CN107417617B - 一种二硫苏糖醇双光子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二硫苏糖醇的双光子荧光探针及其制备方法。该探针结构通式如式(I)所示:该探针可经化学合成获得,合成工艺简单易行,原料廉价易得,制备成本低,易于推广。且该探针还具有高特异性,在进行相应DTT检测过程中基本不受其他组分的干扰,可用于环境和活细胞内DTT的实时测定,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测二硫苏糖醇的双光子荧光探针及其制备方法和应用,属于分析化学技术领域。
背景技术
二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)是一种常用的巯基试剂,因其具有不易挥发性,被氧化后的产物(DTTox)为稳定环状结构,所以DTT有较高的还原性。在细胞和分子生物学实验中,DTT常用来还原蛋白中的二硫键。除此之外,DTT还可以作为药物用来治疗某些疾病,例如胱氨酸病(cystinosis)和金属造成的细胞毒性。然而,DTT浓度异常能够使多肽,蛋白和DNA氧化损伤,会导致生物分子的结构破坏,进而影响生物分子功能的发挥。因此,发展可靠的方法检测DTT含量具有重要的意义。
相比于传统的测定DTT的高效液相色谱法,荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、实时监测、操作简单等优点,并且在生物样本检测中不会对样品带来损伤,已广泛用于各种生物体内的小分子检测。尤其是双光子荧光成像技术,采用近红外作为激发光源,具有较低的光损伤和较好的组织穿透能力;双光子成像因采用双光子聚焦激发到某一个很小的样品组织中,具有很高分辨率的三维立体成像效果。因此开发新的具有高灵敏度、高选择性、光稳定性,能够实时快速检测双光子DTT荧光探针具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种二硫苏糖醇双光子荧光探针及其制备方法和应用。
本发明采用以下技术方案:
一种二硫苏糖醇双光子荧光探针,所述荧光探针的化学结构式如式(I)所示:
上述的二硫苏糖醇双光子荧光探针的制备方法包括以下步骤:
1)将1mmol的4-溴-1,8-萘二甲酸酐、1.5mmol的正丙胺加入到反应瓶中,用乙醇作溶剂,于85℃回流反应6h,待反应液冷却至室温抽滤得到黄色固体,然后将所得固体进行柱层析纯化得到6-溴-1-丙胺-1,8-萘酰亚胺;
2)将1mmol的6-溴-1-丙胺-1,8-萘酰亚胺和1.2mmol甲硫醇钠、用DMF溶解,室温搅拌2h,用水萃取三次,加入无水硫酸钠除水即得到化合物5;所述化合物5的结构式如下所示:
3)将上述制备1mmol的化合物5与1.5mmol间氯过氧苯甲酸用二氯甲烷溶解,室温搅拌反应15min,将二氯甲烷旋干后,柱层析纯化即得到如式I所示的化合物。
具体合成路线如下:
本发明所述的二硫苏糖醇双光子荧光探针可应用于环境和细胞内DTT的检测;所述检测的条件为:激发波长为410nm,在470-600nm之间进行荧光发射光谱的检测。
本发明的荧光探针,在DTT存在的环境下,其亚砜基还原为硫醚,生成具有高荧光发射能力的荧光物质;也就是说本发明的荧光探针的亚砜基为DTT的响应位点;所生成的荧光物质发射萘酰亚胺衍生物染料的蓝色荧光(峰值约为510nm)。另外,本发明的荧光探针只对DTT有响应,而对Hcys、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、HClO4、GSH、NaNO2、VC、GSH Cys等小分子没有响应。所以,本发明的荧光探针是对DTT的特异性探针,基本不受其他小分子的干扰。通过荧光检测器检测加入本发明的荧光探针之后环境和细胞的荧光强度,从而确定DTT在环境和细胞中的含量,从而实现DTT的快速灵敏检测。因此,本发明的荧光探针能应用于环境和细胞内DTT的检测评价。
本发明的荧光探针应用于环境内DTT的检测评价时的具体测定方法为:将待测样品加入到的荧光探针的甲醇水溶液中,测定溶液的荧光强度作为DTT浓度的评价指标。
本发明采用MTT比色法,通过分析活细胞在加入荧光探针之后的存活率,讨论荧光探针对细胞的毒性;然后进一步研究通过研究加入荧光探针后活细胞的荧光成像。实验证明本发明的荧光探针对活细胞没有毒性、且荧光成像清晰可以对活细胞内的DTT进行快速检测。
将本发明所述荧光探针的甲醇水溶液注入细胞的培养基中进行培养,然后用PBS(磷酸盐缓冲溶液)冲洗培养细胞,再进行荧光成像;根据荧光成像结果判断是否含有DTT。
本发明的有益效果为:本发明所述的检测DTT的双光子荧光探针可经化学合成获得,合成工艺简单易行,原料廉价易得,制备成本低,易于推广。本发明所述的检测细DTT的荧光探针具有高特异性,在进行相应DTT检测过程中基本不受其他组分的干扰,可用于环境和活细胞内DTT的实时测定,具有广阔的应用前景。该荧光探针检测DTT的灵敏度高,具有良好的荧光发射光谱特性(450-600nm),可以实现对环境和活细胞中的DTT快速准确检测的目的。
附图说明
图1是本发明荧光探针的LC-MS图谱;
图2是本发明荧光探针在不同浓度DTT条件下的荧光光谱;图中,从下向上DTT的浓度依次为:0μM-5μM-10μM-15μM-20μM-25μM-30μM-35μM-40μM-45μM–50μM–55μM–60μM–65μM–70μM–75μM–80μM–85μM–90μM–95μM–100μM;
图3是本发明荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱;
图4是本发明荧光探针在活细胞中的成像应用;图中a:只加10μM探针的细胞明场照片;b图:只加10μM探针的细胞红色通道荧光照片;c图:a图和b图的叠加照片;d图:只加10μM探针的细胞红色双光子通道荧光照片;e图:加入10μM探针和100μM DTT的细胞明场照片;f图:加入10μM探针和100μM DTT的细胞红色通道荧光照片;g图:d图和e图的叠加照片;h图:加入10μM探针和100μM DTT的探针的细胞红色双光子通道荧光照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明,但本发明保护内容不仅限于此。
实施例1:本发明所述检测癌细胞内DTT的荧光探针的制备
取50ml圆底烧瓶将4-溴-1,8-萘二甲酸酐(275mg、1mmol)以及丙胺(化合物288.5mg、1.5mmol)加入到瓶中,加入4mL乙醇做溶剂,于85℃回流6h。等待反应液冷却至室温,抽滤得到浅黄色固体粗品即为化合物3,产率58%。
将化合物3(1mmol)、1.2mmol化合物4(甲硫醇钠)用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解,室温搅拌2h,用水萃取三次,加入无水硫酸钠除水即得到化合物5;1mmol化合物5与1.5mmol化合物6(间氯过氧苯甲酸)用二氯甲烷(DCM)溶解,室温搅拌反应15min,将DCM旋干后,柱层析纯化即得到最后的产物7(式I),其LC-MS图谱见图1。
实施例2:本发明所述荧光探针在不同DTT浓度下的荧光光谱
本专利采用DTT溶解在水溶液中供应DTT。预先准备20份5mL的10μM的探针缓冲溶液(乙醇的体积含量为5%);分别加入DTT使得探针缓冲溶液中DTT依次为0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM。然后进行荧光检测(Ex=450nm);计算各体系中荧光强度;通过分析510nm处的荧光强度与DTT浓度的关系,评估该探针对DTT的响应性能(见图2)。图2表明,随着DTT浓度的增大,溶液的荧光强度逐渐增强。
实施例3:荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱
预先准备10份5mL的10μM的探针缓冲溶液(含5%乙醇,pH=7.4),然后分别向该体系中依次加入100μL浓度为200μM的DTT、Hcys、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、HClO4、Cys、GSH、NaNO2、VC等小分子的PBS溶液。然后进行荧光检测(Ex=450nm);计算各体系中荧光强度;评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性(见图3)。从图3中看出,只有当探针溶液中加入DTT时,能够使溶液产生显著的荧光;而当探针溶液中加入Hcys、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、HClO4、GSH、NaNO2、VC等小分子时,溶液荧光基本没有变化;这表示该探针只对DTT有响应,而基本不受其他小分子的干扰。
实施例4:荧光探针在活细胞中的成像应用
将癌细胞HeLa细胞放在培养基(培养基中DMEM培养液和胎牛血清的体积比为9:1)中,放置于条件为37℃、5%(体积分数)CO2和20%(体积分数)O2的培养箱中培养24-48h。加入本发明所述荧光探针的乙醇溶液(荧光探针浓度为5μM,含5%(体积分数)乙醇,pH=7.4),注入含有HeLa细胞的培养基中,继续在培养箱中培养30min,PBS缓冲溶液冲洗培养细胞3次。加入DTT,使得培养基中DTT的浓度为25μM,继续培养30min。之后用PBS冲洗培养细胞3次,进行荧光成像。结果见图4:从a、b、c和d(双光子通道)图中看出,只加入探针时,细胞在单光子和双光子激发下无蓝色荧光;从e、f、g和h(双光子通道)图中看出,加入探针之后,再加入100μM DTT,细胞有明显的蓝色单光子和双光子荧光产生,这表示该探针可通过单双光子双模式用于检测癌细胞中的DTT。
Claims (2)
1.一种二硫苏糖醇双光子荧光探针,其特征在于,所述荧光探针的化学结构式如式(I)所示:
式(I) 。
2.一种权利要求1所述的二硫苏糖醇双光子荧光探针的制备方法,其特征在于,它包括以下步骤:
1)将1mmol的4-溴-1,8-萘二甲酸酐、1.5 mmol的正丙胺加入到反应瓶中,用乙醇作溶剂,于85℃回流反应6 h,待反应液冷却至室温抽滤得到黄色固体,然后将所得固体进行柱层析纯化得到6-溴-1-丙胺-1,8-萘酰亚胺;
2)将1mmol的6-溴-1-丙胺-1,8-萘酰亚胺和1.2mmol甲硫醇钠、用DMF溶解,室温搅拌2h,用水萃取三次,加入无水硫酸钠除水即得到化合物5;所述化合物5的结构式如下所示:
;
3)将上述制备1mmol的化合物5与1.5 mmol间氯过氧苯甲酸用二氯甲烷溶解,室温搅拌反应15 min,将二氯甲烷旋干后,柱层析纯化即得到如式I所示的化合物。
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