CN107412880B - 一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及感受器领域，公开了一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，包括：(1)取单层石墨烯加入硝酸溶液中沸煮处理；(2)离心洗涤样品；(3)取石墨烯配成溶液并进行超声处理；(4)丝素蛋白的提取；(5)配制丝素蛋白水溶液并超声处理；(6)取丝素蛋白水溶液、石墨烯溶液、甘油和聚乙二醇混合，超声分散；(7)对衬底硅基进行防粘处理；(8)将丝素蛋白‑石墨烯‑甘油混合液在硅片基底上成膜；(9)将膜在甲醇/水溶液中低温退火处理，取出室温干燥。本发明采用石墨烯成膜后再低温退火的方法，产品同时具有优异的透明度、良好的外力响应性能和物理机械性能。本发明利用丝素蛋白的生物亲和性，产品对人体无任何刺激和危害。
Description
技术领域
本发明涉及感受器领域，尤其涉及一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法。
技术背景
人工皮肤是一种用于治疗皮肤创伤的敷料，主要使用生物材料或者生物相容性好的合成材料制备而成。人工皮肤在医疗领域对烫伤、烧伤和皮肤破损缺失有良好的作用，在一些情况下甚至可以作为天然皮肤的替代物。目前研制成功并应用的人工皮肤主要起到了一定保护皮下组织的覆盖作用，提供了促进创面表皮细胞生长的复合材料支架，或者具有一些能够促进皮肤生长的缓释药物因子。这类人工皮肤具有良好的生物相容性、物理机械性能和医用性能，但是其生产复杂、成本高而且不具有天然皮肤的触感感受和信号传递功能。
人工皮肤感受器是在原有人工皮肤的基础上增加了外界刺激感知功能和电信号传递功能的膜状复合材料。这类感受器具有对外界环境的变化和刺激有一定的感知功能，如温度感受器可以感知皮肤温度的变化、触觉感受器可以感知外力作用下皮肤的形变。石墨烯因为其良好的电化学敏感性，常常被用于合成人工皮肤，但目前石墨烯制备的人工皮肤感受器存在的普遍问题是物理机械性能和透明性未达到使用要求。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法。本发明利用生物相容性好的蚕丝丝素蛋白和石墨烯混合制备成膜，并加入甘油和聚乙二醇作为增韧剂来提高人工皮肤膜的拉伸强度。丝素膜作为骨架促进创面表皮细胞生长，石墨烯具有优异的导电性能和电化学敏感性，在外力的下可以改变电阻的大小，在一定范围内具有优异的强度和拉伸性能。而采用成膜后经过水中低温退火处理，可以改变丝素的β折叠，提高膜的韧性和透明性。
本发明的具体技术方案为：一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，包括如下步骤：
(1)取单层石墨烯经研磨粉碎后，加入硝酸溶液中进行沸煮处理20-60分钟。
(2)将处理过的单层石墨烯用去离子水离心洗涤直至溶液为中性，并取部分样品干燥后测定样品浓度。
步骤(2)中，石墨烯不能经过干燥处理，而是利用取样测量得到石墨烯样品的浓度然后再配制成一定浓度的溶液。这样可以减少石墨烯的团聚，提高成品的透明度。
(3)根据样品浓度将单层石墨烯加入去离子水中进行超声处理，得到分散均匀的0.1%单层石墨烯溶液。
(4)丝素蛋白的制备。
(5)取干燥后的丝素蛋白加入到去离子水中并进行超声处理，得到分散均匀的0.08-0.12wt%丝素蛋白水溶液。
(6)取丝素蛋白水溶液、单层石墨烯溶液、甘油和聚乙二醇进行混合，用氨水调pH至9.5-10.5，超声分散，得到分散均匀的丝素蛋白-石墨烯-甘油-聚乙二醇混合液。
(7)对柔复合膜所用的衬底硅基进行防粘处理，将单晶硅片放置于蒸发皿中，加入三甲基氯硅烷液体，封闭蒸发皿，在其中蒸发8-12min用作不粘层；
(8)将丝素蛋白-石墨烯-甘油混合液利用旋涂法在硅片基底上成膜，40~80℃干燥。
(9)将干燥好的膜在浸入体积百分比为85-95%的甲醇/水溶液中低温退火处理1-3h，然后取出室温干燥，得到柔性透明人工皮肤感受器。
本发明通过将石墨烯和丝素蛋白制作成人工皮肤，并在成膜之后进行还原处理，得到高效柔性透明人工皮肤膜。与现有技术相比，该方法对环境污染小，制备方法简单。制成的人工皮肤感受器具有促进创伤愈合，外力响应和良好的物理机械性能。
作为优选，步骤(1)中，单层石墨烯与硝酸溶液的用量比为0.1g:100mL-0.5g:100mL，硝酸溶液的浓度为0.1-1mol/L。
经硝酸酸化处理后石墨烯的导电性能得到提高，同时石墨烯膜的透光性不会因此而改变。
作为优选，步骤(2)中，离心洗涤的条件为3000-8000rpm下离心2-5次，每次离心2-5min。
作为优选，步骤(4)中，所述丝素蛋白经过脱胶、离子液体中酶解、透析、冷冻干燥制得。具体优选为：
A）称取4g桑蚕丝作为样品，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。
B）将烘干的样品以1:100的浴比在含有0.5% Na2PO4和1%C17H35COONa的混合溶液中煮沸30min，进行脱胶处理，共脱胶两次。
C）脱胶之后，将样品用去离子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。
D）称取2g干燥的丝素纤维，以1:40的浴比浸入离子液体中，同时加入PEG-碱性蛋白酶粉末0.15g，在40℃的油浴中搅拌6h，得到丝素/离子液体溶液后，在80℃以上的油浴中保温至少30min，进行灭酶。
E）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将溶液装入截留分子量7000-10000的透析袋中透析24h，得到纯净丝素蛋白溶液。
F）将得到的丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。
其中，PEG-碱性蛋白酶的制备：称取碱性蛋白酶0.15g，PEG（1000MW聚乙二醇）0.17g，K2HPO4(磷酸氢二钾)0.16g，溶解在10mL去离子水中，40℃保温2h，然后在-20℃条件下冷冻4h，经冷冻干燥96h后，得到PEG-碱性蛋白酶粉末，待用。
离子液体的制备：在250mL三口烧瓶中，加入137mL 2-甲基烯丙基氯和80mL N-甲基咪唑，在80℃油浴中搅拌回流3h，反应完毕后，采用旋转蒸发除去过量的2-甲基烯丙基氯，得到淡黄色透明液体，即1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯化物离子液体，冷冻干燥24h后，解冻待用。
在丝素蛋白制备过程中，本发明利用PEG 1000对碱性蛋白酶进行修饰，利用PEG对离子液体的亲和作用，不仅提高了酶的稳定性和反应活性，同时增加了酶在离子液体中的分散均匀性，有利于其对丝素蛋白的水解。本发明在脱胶过程中，加入C17H35COONa作为缓冲剂，维持碱性环境，提高脱胶效率，同时减少对丝素纤维的伤害。本发明利用生物酶和离子液体的双重溶解作用，同时对丝素蛋白进行处理，提高了丝素蛋白的溶解度。本发明中，生物酶无毒无害、与环境友好，同时用量少，节约资源；特异性高，作用条件温和，对丝素蛋白的破坏小。而离子液体是“绿色溶剂”，环保无害，基团可设计，并且易于回收，可循环使用。
作为优选，步骤(6)中，丝素蛋白水溶液、石墨烯溶液、甘油和聚乙二醇的质量比为9:1:3:2。
甘油的加入可以提高膜的韧性和拉伸强度，聚乙二醇的加入可以提高体系的透明度和成品的水润性。
作为优选，步骤(8)中，旋涂法的转速为300-800rpm，时间为30-90s，干燥温度为40℃-80℃。
作为优选，步骤(9)中，低温退火处理温度为10-20℃。甲醇溶液作为凝固浴，提高了膜的稳定性。低温退火处理可以改变丝素的β折叠，提高膜的韧性和透明性。
作为优选，步骤(3)和(5)中，超声的时间为1h-4h，超声提高了溶液中石墨烯的分散性，提高了膜的透光性。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)本发明采用废蚕丝作为原料，实现了废料的回收利用，降低了实验成本。
(2)本发明采用石墨烯成膜后再低温退火的方法，产品同时具有优异的透明度、良好的外力响应性能和物理机械性能。
(3)本发明利用丝素蛋白的生物亲和性，产品对人体无任何刺激和危害。
(4)本发明使用化学药品较少，实验过程绿色环保。
(5)本发明利用生物相容性好的蚕丝丝素蛋白和石墨烯混合制备成膜，并加入甘油和聚乙二醇作为增韧剂来提高人工皮肤膜的拉伸强度。丝素膜作为骨架促进创面表皮细胞生长，石墨烯具有优异的导电性能和电化学敏感性，在外力的下可以改变电阻的大小，在一定范围内具有优异的强度和拉伸性能。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，采用如下步骤：
(1)取0.5g单层石墨烯经过研磨粉碎后，加入0.1mol/L的硝酸溶液中进行沸煮处理20分钟。
(2)将处理过的样品用去离子水离心洗涤直至溶液为中性，并将适量样品冷冻干燥测定浓度。其中，离心洗涤的条件为5000rpm下离心3次，每次离心4min。
(3)取0.5g干燥后的石墨烯加入500mL的去离子水中进行超声处理2.5h，得到分散均匀的0.1%单层石墨烯溶液。
(4) 所述丝素蛋白的制备方法为：
A）称取4g桑蚕丝作为样品，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。
B）将烘干的样品以1:100的浴比在含有0.5% Na2PO4和1%C17H35COONa的混合溶液中煮沸30min，进行脱胶处理，共脱胶两次。
C）脱胶之后，将样品用去离子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。
D）称取2g干燥的丝素纤维，以1:40的浴比浸入离子液体中，同时加入PEG-碱性蛋白酶粉末0.15g，在40℃的油浴中搅拌6h，得到丝素/离子液体溶液后，在80℃以上的油浴中保温至少30min，进行灭酶。
E）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将溶液装入截留分子量8000的透析袋中透析24h，得到纯净丝素蛋白溶液。
F）将得到的丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。
其中，PEG-碱性蛋白酶的制备：称取碱性蛋白酶0.15g，PEG（1000MW聚乙二醇）0.17g，K2HPO4(磷酸氢二钾)0.16g，溶解在10mL去离子水中，40℃保温2h，然后在-20℃条件下冷冻4h，经冷冻干燥96h后，得到PEG-碱性蛋白酶粉末，待用。
离子液体的制备：在250mL三口烧瓶中，加入137mL 2-甲基烯丙基氯和80mL N-甲基咪唑，在80℃油浴中搅拌回流3h，反应完毕后，采用旋转蒸发除去过量的2-甲基烯丙基氯，得到淡黄色透明液体，即1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯化物离子液体，冷冻干燥24h后，解冻待用。
(5)取0.5g干燥后的丝素加入500mL的去离子水中并进行超声处理2.5h，得到分散均匀的0.1%丝素蛋白水溶液；
(6)取丝素蛋白水溶液、石墨烯溶液、甘油和聚乙二醇按9:1:3:2质量比进行混合，用氨水调pH至10，超声分散，得到分散均匀的丝素蛋白-石墨烯-甘油混合液；
(7)对柔复合膜所用的衬底硅基进行防粘处理，将单晶硅片放置于蒸发皿中，加入少量的三甲基氯硅烷液体，封闭蒸发皿，在其中蒸发10min用来做不粘层；
(8)将丝素蛋白-石墨烯-甘油混合液利用旋涂法在硅片基底上成膜，40℃干燥24h；旋涂法的转速为500rpm，时间为60s，干燥温度为60℃。
(9)将干燥好的膜在浸入90:10体积比的甲醇/水溶液中低温（15℃）退火处理2h，取出室温干燥，得到柔性透明人工皮肤感受器。
实施例2
一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，采用如下步骤：
(1)取0.75g单层石墨烯经过研磨粉碎后，加入0.5mol/L的硝酸溶液中进行沸煮处理20分钟。
(2)将处理过的样品用去离子水离心洗涤直至溶液为中性，并将适量样品冷冻干燥测定浓度。其中，离心洗涤的条件为3000rpm下离心5次，每次离心2min。
(3)取0.3g干燥后的石墨烯加入300mL的去离子水中进行超声处理1h，得到分散均匀的0.1%单层石墨烯溶液。
(4) 所述丝素蛋白的制备方法为：
A）称取4g桑蚕丝作为样品，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。
B）将烘干的样品以1:100的浴比在含有0.5% Na2PO4和1%C17H35COONa的混合溶液中煮沸30min，进行脱胶处理，共脱胶两次。
C）脱胶之后，将样品用去离子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。
D）称取2g干燥的丝素纤维，以1:40的浴比浸入离子液体中，同时加入PEG-碱性蛋白酶粉末0.15g，在40℃的油浴中搅拌6h，得到丝素/离子液体溶液后，在80℃以上的油浴中保温至少30min，进行灭酶。
E）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将溶液装入截留分子量8000的透析袋中透析24h，得到纯净丝素蛋白溶液。
F）将得到的丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。
其中，PEG-碱性蛋白酶的制备：称取碱性蛋白酶0.15g，PEG（1000MW聚乙二醇）0.17g，K2HPO4(磷酸氢二钾)0.16g，溶解在10mL去离子水中，40℃保温2h，然后在-20℃条件下冷冻4h，经冷冻干燥96h后，得到PEG-碱性蛋白酶粉末，待用。
离子液体的制备：在250mL三口烧瓶中，加入137mL 2-甲基烯丙基氯和80mL N-甲基咪唑，在80℃油浴中搅拌回流3h，反应完毕后，采用旋转蒸发除去过量的2-甲基烯丙基氯，得到淡黄色透明液体，即1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯化物离子液体，冷冻干燥24h后，解冻待用。
(5)取0.3g干燥后的丝素加入300mL的去离子水中并进行超声处理1h，得到分散均匀的0.1%丝素蛋白水溶液。
(6)取丝素蛋白水溶液、石墨烯溶液、甘油和聚乙二醇按9:1:3:2质量比进行混合，用氨水调pH至10，超声分散，得到分散均匀的丝素蛋白-石墨烯-甘油混合液。
(7)对柔复合膜所用的衬底硅基进行防粘处理，将单晶硅片放置于蒸发皿中，加入少量的三甲基氯硅烷液体，封闭蒸发皿，在其中蒸发15min用来做不粘层。
(8)将丝素蛋白-石墨烯-甘油混合液利用旋涂法在硅片基底上成膜，80℃干燥12h。旋涂法的转速为300rpm，时间为90s，干燥温度为40℃。
(9)将干燥好的膜在浸入90:10体积比的甲醇/水溶液中低温（10℃）退火处理1-3h，取出室温干燥，得到柔性透明人工皮肤感受器。
实施例3
一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，采用如下步骤：
(1)取1g单层石墨烯经过研磨粉碎后，加入1mol/L的硝酸溶液中进行沸煮处理30分钟。
(2)将处理过的样品用去离子水离心洗涤直至溶液为中性，并将适量样品冷冻干燥测定浓度。其中，离心洗涤的条件为8000rpm下离心5次，每次离心5min。
(3)取1g干燥后的石墨烯加入1000mL的去离子水中进行超声处理4h，得到分散均匀的0.1%单层石墨烯溶液。
(4) 所述丝素蛋白的制备方法为：
A）称取4g桑蚕丝作为样品，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。
B）将烘干的样品以1:100的浴比在含有0.5% Na2PO4和1%C17H35COONa的混合溶液中煮沸30min，进行脱胶处理，共脱胶两次。
C）脱胶之后，将样品用去离子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。
D）称取2g干燥的丝素纤维，以1:40的浴比浸入离子液体中，同时加入PEG-碱性蛋白酶粉末0.15g，在40℃的油浴中搅拌6h，得到丝素/离子液体溶液后，在80℃以上的油浴中保温至少30min，进行灭酶。
E）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将溶液装入截留分子量8000的透析袋中透析24h，得到纯净丝素蛋白溶液。
F）将得到的丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。
其中，PEG-碱性蛋白酶的制备：称取碱性蛋白酶0.15g，PEG（1000MW聚乙二醇）0.17g，K2HPO4(磷酸氢二钾)0.16g，溶解在10mL去离子水中，40℃保温2h，然后在-20℃条件下冷冻4h，经冷冻干燥96h后，得到PEG-碱性蛋白酶粉末，待用。
离子液体的制备：在250mL三口烧瓶中，加入137mL 2-甲基烯丙基氯和80mL N-甲基咪唑，在80℃油浴中搅拌回流3h，反应完毕后，采用旋转蒸发除去过量的2-甲基烯丙基氯，得到淡黄色透明液体，即1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯化物离子液体，冷冻干燥24h后，解冻待用。
(5)取1g干燥后的丝素加入1000mL的去离子水中并进行超声处理4，得到分散均匀的0.1%丝素蛋白水溶液。
(6)取丝素蛋白水溶液、石墨烯溶液、甘油和聚乙二醇按9:1:3:2质量比进行混合，用氨水调pH至10，超声分散，得到分散均匀的丝素蛋白-石墨烯-甘油混合液；
(7)对柔复合膜所用的衬底硅基进行防粘处理，将单晶硅片放置于蒸发皿中，加入少量的三甲基氯硅烷液体，封闭蒸发皿，在其中蒸发12min用来做不粘层；
(8)将丝素蛋白-石墨烯-甘油混合液利用旋涂法在硅片基底上成膜，60℃干燥18h。旋涂法的转速为800rpm，时间为30s，干燥温度为80℃。
(9)将干燥好的膜在浸入90:10体积比的甲醇/水溶液中低温（20℃）退火处理1-3h，取出室温干燥，得到柔性透明人工皮肤感受器。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (8)
1.一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取单层石墨烯经研磨粉碎后，加入硝酸溶液中进行沸煮处理20-60分钟；
(2)将处理过的单层石墨烯用去离子水离心洗涤直至溶液为中性，并取部分样品干燥后测定样品浓度；
(3)根据样品浓度将单层石墨烯加入去离子水中进行超声处理，得到分散均匀的0.1%单层石墨烯溶液；
(4)丝素蛋白的制备；
(5)取干燥后的丝素蛋白加入到去离子水中并进行超声处理，得到分散均匀的0.08-0.12wt%丝素蛋白水溶液；
(6)取丝素蛋白水溶液、单层石墨烯溶液、甘油和聚乙二醇进行混合，用氨水调pH至9.5-10.5，超声分散，得到分散均匀的丝素蛋白-石墨烯-甘油-聚乙二醇混合液；
(7)对衬底硅基防粘处理：将作为衬底硅基的单晶硅片放置于蒸发皿中，加入三甲基氯硅烷液体，封闭蒸发皿，在其中蒸发8-12min，得到防粘处理后的衬底硅基；
(8)将丝素蛋白-石墨烯-甘油混合液利用旋涂法在衬底硅基上成膜，40~80℃干燥；
(9)将干燥好的膜在浸入体积百分比为85-95%的甲醇/水溶液中低温退火处理1-3h，然后取出室温干燥，得到柔性透明人工皮肤感受器。
2.如权利要求1所述的一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，单层石墨烯与硝酸溶液的用量比为0.1g:100mL-0.5g:100mL，硝酸溶液的浓度为0.1-1mol/L。
3.如权利要求1所述的一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，离心洗涤的条件为3000-8000rpm下离心2-5次，每次离心2-5min。
4.如权利要求1所述的一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述丝素蛋白经过脱胶、离子液体中酶解、透析、冷冻干燥制得。
5.如权利要求1所述的一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，丝素蛋白水溶液、石墨烯溶液、甘油和聚乙二醇的质量比为9:1:3:2。
6.如权利要求1所述的一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，旋涂法的转速为300-800rpm，时间为30-90s，干燥温度为40℃-80℃。
7.如权利要求1所述的一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，其特征在于，步骤(9)中，低温退火处理温度为10-20℃。
8.如权利要求1所述的一种柔性透明人工皮肤感受器的制备方法，其特征在于，步骤(3)和(5)中，超声的时间为1h-4h。
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