CN107407798A - 通过低相干干涉法自动聚焦调节的显微镜系统 - Google Patents

通过低相干干涉法自动聚焦调节的显微镜系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了几种用于使用低相干干涉测量技术来创建用于光学显微镜的自动聚焦装置的技术方法。这些方法允许薄结构上自动聚焦，该结构紧贴反射表面并且位于折射材料之后，如盖玻片，并且将焦点位置自动调整到样品区域中，从而不受相邻表面之间的反射干扰。补偿由覆盖样品材料折射引起的测量偏移。提出了一种仪器的技术，允许在低相干干涉测量自动聚焦系统中的成像物镜自动交换，其主要意义在于将TDI(时间延迟积分)成像、共焦和双光子荧光显微镜相结合。

Description

通过低相干干涉法自动聚焦调节的显微镜系统
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年1月26日提交的美国临时专利申请号62/107,675的权益，该申请的内容在此引入作为参考。
技术领域
一般地，本发明涉及显微镜领域。更具体地，本发明涉及通过低相干干涉法自动聚焦调节的显微镜系统。
背景技术
对于许多共焦的、双光子和TDI扫描显微镜，需要非常快的自动聚焦程序。这种快速程序需要与大型成像物镜(数值孔径>0.5)相结合，并且与位于反射表面下方的样品材料(例如，组织学中所使用的切片组织)相结合。
在现有技术中，已知有几种自动聚焦方法。这些方法中的大多数是基于通过使用成像相机从样品获取的图像的特殊频率分析。这种方法在响应速度方面受到限制，因为它们在迭代优化的基础上，将焦点设置为样本。在使用TDI(时间延迟积分)成像的孔板检查和大面积滑动扫描的应用中，需要自动聚焦装置的响应时间非常短。特殊频率分析技术是优化这些成像问题速度的限制因素。
替代技术方案，如三角测量或图案照明分析，使用更简单和更快速的方法。这些技术方案的缺点是它们对信号干扰高度敏感，该信号干扰是由位于靠近将要成像的样品的反射表面引起的。
早期(美国专利5,493,109)已经提出了，使用低相干干涉法来确定样品的位置，从而实现焦点调节。所提出的方式不足以解决(在光轴中，聚焦重复性<1μm)的高精度和(当通过玻璃表面成像时)反射灵敏度的问题。这些问题的原因是：所提出的设置是利用迈克尔逊型干涉仪，其中干涉仪臂局部地明显分离并部分地通过光纤引导。这种方法受到一个干涉仪臂相对于另一个的光路长度的热和机械感应变化。在所提出的系统中保持重复性<1μm已被证明是不可能的。其是用于外科眼科OCT(光学相干干涉测量)的目标应用，因为在这些应用中使用较低的NAs(<0.5)，不需要如此大的可重复性。相关技术的另一种描述见WO2012016753A1。所提出的方法更接近于解决在上述目标应用中已示的需求，因为它提出了一种位于成像物镜附近的分束装置，并且因此降低了干涉仪臂之间的相对光程长度漂移(参见权利要求5)。所述产品和程序包括来自靠近样品表面的非抑制反射装置，因此不适用于高NA(>0.5)的玻璃覆盖样品的成像。在这些情况下，由玻璃反射引起的多数信号可能与样品的信号重叠，使得样品位置的绝对定义不可能具有<1μm的精度。
图1示出了使用高斯光束从显微镜设置推导出的低相干干涉测量信号，该高斯光束以成像显微镜的光轴为中心并具有保持薄(～5μm)的组织学样本载玻片，玻璃盖板覆盖样品。可见以下特征：
自动干扰(A)由光谱条纹产生，该光谱条纹主要由盖玻片的第一表面干涉(B)以及盖玻片和载玻片的第二表面相邻反射(C)引起，盖玻片的后表面形成另一信号峰(D)。
由样品产生的信号预计在位置(C)周围的两个峰之间，并被玻璃反射叠加。不可能给出诸如精确到(<1μm)的测定样品位置数据集。
因此，需要可以解决上述问题的产品和程序。
本发明的一个实施例提出了通过与光轴平行移动的方式，来设置照明和检测孔的程序。这与Zeiss AG在WO2012016753A1中提出的程序主要的区别在于，其中在物镜之前使用成角度的光束产生相对于中心光轴的平行偏移的测量光束。这种方法不能足够好地抑制表面反射，从而允许放置在显微镜盖板下方的样品轴向精度薄度在(<10μm)内的样品位置的精确限制在<1μm内。
此外，上述两种低相干干涉测量方法都没有提出在成像物镜改变时优化信号的解决方案。
本发明的一个实施例提供了一种以数字方式补偿控制回路中的偏移的程序，该偏移来自于位于成像物镜和样品材料之间的任意厚度材料的使用。没有发现描述了覆盖样品材料引起折射补偿的现有文献。
本发明的一些实施例提供了用于使用不同成像物镜自动校准装置的程序。没有发现描述了这种自动校准的现有文献。
发明内容
本发明的实施例提供了几种用于使用低相干干涉测量技术来创建用于光学显微镜的自动聚焦装置的技术方法。本发明的一个实施例允许在薄结构上自动聚焦，该结构紧贴反射表面并且位于折射材料之后，如盖玻片。本发明的实施例允许将焦点位置自动调整到样品区域中，而不受相邻表面之间的反射干扰。补偿由覆盖样品材料折射引起的测量偏移。本发明的实施例提出了允许在低相干干涉测量自动聚焦系统中自动交换成像物镜的仪器的技术。本发明的一个主要有益实施例是结合TDI(时间延迟积分)成像、共焦和双光子荧光显微镜。
本发明的一个实施例提供一种显微镜系统，包括：低相干干涉仪；分束装置(beamsplitter)，其将光透射到显微镜并将来自低相干干涉仪的光反射到与成像物镜的光轴平行的光路中；其中所述成像物镜将来自所述低相干干涉仪的光聚焦到样品材料中，所述样品材料被部分反射介质覆盖；其中所述低相干干涉仪配置为具有检测孔，所述检测孔与由具有照明孔的点对称的区域限定的孔不重合，所述点对称是具有孔平面的所述成像物镜的光轴的截距；并且其中干涉仪配置为检测来自所述样品的一部分反向散射光，并排除从所述部分反射介质反射的大部分光。
本发明的另一个实施例提供了一种用于自动聚焦显微镜系统的自动相对聚焦调节方法，该显微镜系统包括低相干干涉仪和分束装置，该分束装置将光透射到显微镜并将来自低相干干涉仪的光反射到与成像物镜的光轴平行的光路中，其中样品被覆盖材料覆盖，所述方法包括：计算相对空气/覆盖材料位置的A扫描数据；计算相对样品位置的A扫描数据；校准焦点位置；计算覆盖材料的厚度；处理发动机设置位置；并控制发动机单元的移动；其中如果从样品背向散射的信号小于本底噪声10dB以上，则存储对应于大于本底噪声10dB的样品背向散射的信号的最后位置；其中如果从样品背向散射的信号小于本底噪声10dB以上，最后位置用于处理。
本发明的另一个实施例提供了一种用于操作显微镜系统的方法，所述显微镜系统包括：低相干干涉仪和分束装置，所述分束装置将光透射到显微镜并将来自低相干干涉仪的光反射到与成像物镜的光轴平行的光路中；所述方法包括：通过成像物镜将来自所述低相干干涉仪的光聚焦到样品材料中，所述样品材料被部分反射介质覆盖；所述低相干干涉仪配置为具有检测孔，所述检测孔与由具有照明孔的点对称的区域限定的孔不重合，所述点对称是具有孔平面的所述成像物镜的光轴的截距；以及检测来自所述样品的一部分反向散射光，并排除从所述部分反射介质反射的大部分光。
附图说明
图1示出了从以成像物镜为中心的样品臂到嵌在玻璃显微镜载玻片和盖玻片之间的样品的低相干断层扫描信号。
图2示出了低相干干涉仪样品臂插入到显微镜物镜和样品中。
图3示出了离开平面的反射。
图4示出了离开非平面样本的散射信号。
图5示出了具有入射和检测孔与成像物镜的中心轴线偏移的低相干干涉测量孔。
图6示出了具有不对称入射和检测孔的低相干干涉测量孔。
图7示出了具有检测孔大于照明孔的环形低相干干涉测量孔。
图8示出了具有照明孔大于检测孔的环形相干干涉测量孔。
图9示出了具有在任意位置的检测孔与照明孔的点对称镜像不重合的低相干干涉测量孔。
图10示出了根据实施例的显微镜系统设置的示例。
图11示出了嵌在玻璃显微镜载玻片和盖玻片之间的从样品臂偏离中心到成像物镜样品上的低相干断层扫描信号。
图12示出了如图9所示的低相干断层扫描信号，但是不存在背散射材料。
图13示出了根据实施例的信号处理和自动聚焦程序。
具体实施方式
根据本发明的原理，说明性实施例的描述旨在结合附图来理解，附图将认为是整个书面描述的一部分。在本发明公开的实施例描述中，任何对方向或取向的参考仅仅是为了便于描述，并不意图以任何方式限制本发明的范围。相对术语诸如“低的”、“高的”、“水平的”、“垂直的”、“上面”、“下面”、“上”、“下”、“顶”和“底”以及其衍生术语(例如，“水平地”、“向下地”、“向上地”等)，应当解释为指的是如所描述的或如所讨论的图中所示的取向。这些相关术语仅用于描述的方便，并且不要求在特定方向构造或操作设备，除非明确指出。诸如“附加”、“添上”、“连接”、“耦合”、“互连”以及类似的术语，是指其中结构通过中间结构直接或间接地彼此固定或附接的关系，以及可移动或刚性附着或关联，除非另有明确说明。此外，通过参考示例性实施例来说明本发明的特征和益处。因此，本发明明确地不应限于这些可能单独存在或以其他特征组合存在的示例性实施例，其示出了一些特征的非限制性可能组合；本发明的范围由所附权利要求限定。
本公开描述了目前预期实施本发明的最佳实施模式。本说明书并不旨在被理解为限制性的，而是仅通过参考附图提供仅用于说明的目的本发明的示例，以向本领域普通技术人员建议本发明的优点和结构。在附图的各种视图中，相同的附图标记表示相同或相似的部分。
时间延迟积分(TDI)是一种众所周知的成像技术，可以以受控的方式通过CCD传输电荷来对移动的样品进行成像。在TDI应用中，样品始终处于运动状态是自动聚焦的挑战。传统的自动聚焦方法需要通过改变焦平面在普通XY位置摄取多个图像，并比较质量度量以确定最佳焦点。鉴于X或Y方向上不断运动的物体的TDI成像的性质，没有能力在单个点捕获多个图像，因此使传统的基于图像的自动聚焦方法不切实际。基于OCT的自动聚焦可以提供高速、非图像的反馈机制，可在移动样品时校正系统的焦点位置。
本发明的一个实施例对于(例如通常使用双光子显微镜和激光扫描共焦显微镜板孔成像的)自动化样品测量具有相同的益处。
在这些应用中，一些折射和相对平面材料位于成像和物镜之间，以及由于来自折射表面的与来自于样品材料的大量反射引起的信号失真，导致使用低相干断层扫描厚度测量的误差。
玻璃反射抑制
为了使低相干干涉测量在所提出的目标应用中起作用，接近待成像样品的表面反射强度，需要减少相对于来自样品散射检测到的强度。
图2示出了可以通过几种方式设计的反射抑制低相干干涉仪(201)。低相干干涉仪具有样品臂光(202)，其进入由镜(203)组成的显微镜装置，该镜(203)用作分离装置传输显微镜(未示出)的成像部分，并且反射来自低相干干涉仪的光。以类似的方式，镜可以传输干涉仪光并反射成像光。成像物镜(204)通过反射介质(205)进入样品材料(206)产生聚焦(207)。该反射介质可以是盖玻片或显微镜载玻片。
显微镜设置可以是TDI扫描装置、共焦扫描显微镜或双光子型荧光显微镜。
反射抑制的基本方法是利用从平面反射产生的信号反射到已知方向，而由样品材料反向散射的光子散射到多个方向(近似各向同性散射)的这一事实。
在图3和图4中，来自低相干断层样本臂孔径(300)的入射光束(301)通过成像物镜(302)聚焦。在图3中，示出了离开反射表面的菲涅耳反射。反射光束(305)的位置相对于入射光束(301)偏移。相反，如图4所示，来自非平面样本(304)的反向散射信号(306，全部虚线)被引导到多个方向。与图3相反，图4中的反向散射光(307)的一部分与入射光束重合。
本发明的实施例提供了避免检测孔与由照明孔的点对称给出的区域限定的孔相重合的方法，其中通过孔平面截取成像物镜的光轴来限定对称点。注意，所有已知的现有文献都描述了这种对称性。反之，测量光束可以通过各种方式进行修改，以抑制从平面表面检的测菲涅耳反射。低相干干涉测量装置的孔径可以设计成允许检测一部分反向散射光，而不检测>90％的反射光。
图5至图9示出了根据本发明的一些实施例来实现该目标的不同方法。这些示意图是指如图3和图4所示的孔。在该物镜聚焦之前，光束基本上平行于成像物镜的光轴传播。
在图5中，低相干样本臂的照明孔(400)显著地(>光束尺寸的1/2FWHM)偏移光轴(401)的中心。检测孔与照明孔(400)重合。
图6示出了一种剪切重合照明和检测孔(402)以避免与光轴(403)点对称的方案。
如图7所示，通过提供明显不同的照明孔(405)和检测孔(404)形状也可以解决问题。环形检测孔(404)大于照明孔(405)。在该配置中，例如可以使用穿孔镜或者旋转镜将反向散射光反射到低相干干涉仪的检测单元中。
图8示出互逆方案，其中照明(406)如环形所示，而检测(407)在光束的中心具有最大强度。环形照明孔(406)大于检测孔(407)。
在图9中示出了任意定位，避免了具有成像物镜的光轴(401)的照明孔(409)和检测孔(408)的点对称。
注意，可以预期这些孔设置是可以组合的，例如，剪切光束可以偏心。
在图10中示出了基于如图5所示的孔的配置示例。基于图6-9的孔的其它配置是类似的。
该设置包括基于FD-OCT(傅里叶域光学相干断层扫描技术)原理的低相干断层扫描基础单元(500)。所提出的设置使用SLD宽带(超发光二极管，502)，其与光耦合器(503)光纤耦合。耦合器可能以类似的方式被光环行器代替。来自SLD(502)的光在光纤中转发到准直物镜(508)，使得其进入干涉仪模块(501)，该干涉仪模块包括分束装置(509)、色散补偿玻璃(510)和逆反射装置(retro-reflecting device)(511)。色散补偿玻璃可用于部分补偿成像物镜中的色散。如下所述不是必需的。从分束装置(509)到逆反射装置(511)的光路称为“参考臂”由后向反射装置反射的光将通过分束装置(509)。由分束装置(509)反射的部分将进入光纤耦合器(503)。
从光纤耦合器(503)发射的SLD光的部分通过反射镜(512)进入平行于光轴(513)的成像路径。这种部分反射镜在光源覆盖的光谱范围内，需要具有均匀连续的反射光相位分布。优选地，该反射镜反射入射的SLD光的较大部分，并且透射用于光学显微镜的较大部分的光。如图所示，SLD光与成像物镜(514)的光轴严重偏移。由于该偏移，朝向焦点(516)传播的光束相对于光轴成角度；该角度需要超过反射表面所有可能的角度朝向物镜的光轴。在该配置中，SLD光束通过部分反射表面(515)进入散射样品材料(517)。从该样品材料(517)反向散射的光的一部分与照明SLD光束重合并返回到光纤耦合器(503)。
这种背散射光(back-scattered light)的一部分，由表面(515)反射反射的光的一小部分和在参考臂(501)中反射的光的一部分，传播到由准直器(504)、光栅(505)、聚焦光学器件(506)和线性传感器(507)形成的光谱仪中。在处理单元(520)中处理由传感器(507)检测到的频谱。该处理包括傅立叶变换。通过分析传感器(507)上的特殊频率，确定从分束装置(509)到逆反射装置(511)的光路长度与分束装置(509)到散射介质(517)的光程长度。处理单元(520)确定该相对光程长度相对于校准的焦点设置路径长度的偏移，并且驱动发动机单元(519)，使得样品保持器(518)将样品材料(517)移动到物镜的焦点(516)。
图11示出了如图10所示的从设置中计算(“A扫描”)之后经校准的快速傅里叶变换(FFT)信号。该信号取自放置在显微镜载玻片和盖玻片之间的薄(5μm)小白鼠脑切片。其显示了散射和反射信号的深度相关信号强度。与图1相反，该图显示了具有以物镜光轴为中心并对称的测量光束信号，来自盖玻片和载玻片的信号减小约-25dB，使得仅从空气界面到盖玻片的信号(A)在测量系统本底噪声上检测到。散射样品(B)的信号保存良好。在样品上的测量光束不会撞击散射样品介质的地方，如图12所示，仅保留空气/盖玻片信号。
在优选实施例中，确定空气/盖玻片信号(A)和样品信号(B)。
在图13中示出了用于计算从光谱仪数据导出的自动相对焦点调整的FFT信号的稳定程序。在(1310)中，A扫描数据用于空气/盖玻片信号(A)和样品信号(B)的计算。在(1330)中，确定d空气＝相对空气/盖玻片材料位置，在(1340)中，确定d样品＝相对散射样品位置。在(1350)中，如果d样品信号小于本底噪声10dB以上，则存储具有d样品信号大于本底噪声10dB以上的最后位置。在(1320)中，对焦点位置进行校准。在(1360)中，计算覆盖材料的厚度；处理发动机设置位置，命令发动机单元移动样品架；如果d样品信号小于本底噪声10dB以上，则具有大于本底噪声10dB以上的d样品信号的已知最后位置用于计算。特别是在TDI扫描显微镜应用中，由目标成像的盖玻片不应始终保留样品材料，同时有利的是将焦点保持在尽可能好的感兴趣区域。该过程将样品的位置锁定到物镜的焦点中，并将已知距离记录到第一玻璃反射(图11中的(A)中)，以便当不存在样品时，自动聚焦程序保持活动状态并跟踪样品相对于第一次空气/玻璃反射的最后已知位置。
校准的焦点位置可以手动校准，通过(通过物镜观察的图像)调整到焦距，或通过使成像系统观察到的图像的对比度最大化的自动化程序。
根据实施例的成像装置能够将焦点保持在成像场景上，其中测量覆盖折射材料的厚度(例如显微镜盖玻片)，并且控制算法能够根据该测量来调整自动聚焦控制信号。在该程序中应考虑两个潜在的影响：
a)通过低相干干涉法进行的相对距离测量，不直接测量位于成像物镜和样品之间的折射介质的物理距离Δdphys，而是通过物理厚度Δdphys乘以组折射率ngroup的光学厚度dA-扫描测量光束传播通过的材料。
ΔdA-scan＝ngroup·Δdphys
b)通过由位于成像目标和(给定为平面)样品之间的折射材料，成像系统的物理聚焦位置延伸，具有以下关系：
斯涅尔折射定律适用于测量导致测量光束相对于焦点调节轴成角度情况下的孔和样品，通常的情况下该焦点调节轴应该与物镜的光轴重合。
给定这些关系，可以导出自动聚焦过程的虚拟设定点，其独立于位于样品和物镜之间折射介质的厚度。
客观互换性的解决方案
为了实现自动聚焦设置以适应可互换的目标，而不需要对干涉仪进行手动调整，根据实施例提供了自动参考长度调节。这可以通过以下方式实现：
a.参考逆反射装置的电动化，从而可以调整参考路径长度以补偿在不同物镜中的光路长度差异。
b.交换色散补偿玻璃板，通过不同的物镜匹配光程长度的差异。
c.位于干涉仪模块内部的棱镜元件沿其对称轴移动。
在优选实施例中，调整参考路径的路径长度，而不对由样品臂路径中的物镜给出的色散进行精确补偿。在本实施例中，数字地补偿色散。这种方法的优点是对于物镜中的光程长度的分批变化是普遍和不敏感的。
在一个实施例中，由物镜引入的参考臂和样品臂之间的色散失配也可以数字地补偿。优点是任意数量的校准可以存储在软件中，并在需要时使用，并且可以考虑新的物镜。此外，这种方法简单、数值稳定，一般会产生好的结果。
在参考和样品臂之间的组速度色散失配存在下获得的光谱S(k)可以通过将其与相位因子相乘来校正
其中产生校正频谱Scorr(k)的合适的相位函数φ(k)。φ(k)的常数和线性项不改变校正，而是移动整个信号的位置。在大多数情况下，相位函数可以通过二次函数近似
其中k0是中心波长，并且根据色散不匹配减少对单个自由参数A的校正。
尽管已经相当长篇幅地描述了本发明并且对几个具有一些特殊性的实施例进行了描述，但是并不意图将其限制于任何这样的特例、实施例或任何具体实施例，应参考所附权利要求来解释以便根据现有技术提供对这种权利要求的最广泛的解释，并因此有效地涵盖了本发明的预期范围。此外，上述内容根据发明人所预见的实现方式描述了本发明，尽管如此，本发明未发现的非实质性修改仍可表示其等价物。

Claims (19)

1.一种显微镜系统，包括：
低相干干涉仪(500)；
分束装置(509)，所述分束装置(509)将光透射到显微镜并将来自低相干干涉仪的光反射到光路中，所述光路平行于成像物镜(514)的光轴(513)；
其中所述成像物镜将来自所述低相干干涉仪的光聚焦到样品材料(517)中，所述样品材料被部分反射介质(515)覆盖；
其中所述低相干干涉仪配置为具有检测孔，所述检测孔不与具有照明孔的点对称区域限定的孔重合，所述点对称是具有孔平面的成像物镜的光轴的截距；以及
其中干涉仪配置为检测一部分来自样品的反向散射光，并且排除从部分反射介质反射的大部分光。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述照明孔到所述光轴的中心至少偏移一半FWHM(半高宽)，并且所述检测孔与所述照明孔重合。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述照明孔和检测孔重合并剪除以避免与所述光轴点对称。
4.根据权利要求1所述的系统，其中检测孔为环形，并且大于照明孔。
5.根据权利要求1所述的系统，其中照明孔为环形，并且大于检测孔。
6.根据权利要求1所述的系统，其中检测孔位于任意位置，并且不与照明孔的点对称镜像重合。
7.根据权利要求1所述的系统，其中低相干干涉仪包括光源(502)，所述光源(502)与光耦合器(503)光纤耦合，并且来自光源的光在光纤中转发到准直物镜，使得光进入干涉仪模块(501)，所述干涉仪模块(501)包括：
分束装置(509)；和
逆反射装置(511)；
其中光的一部分由分束装置(509)反射到逆反射装置，再由逆反射装置(511)反射回分束装置(509)，然后通过分束装置(509)反射到光纤耦合器(503)，从分束装置(509)到逆反射装置(511)的光路形成参考臂；
其中所述光的另一部分通过成像物镜进入部分反射镜上的成像路径，在样品中通过部分反射表面(512)；
其中来自所述样品的背散射光，由所述部分反射表面反射反射的光的一部分和在所述参考臂中反射的光的一部分的一部分传播到光谱仪，所述光谱仪包括准直器(504)、光栅(505)、聚焦光学器件(506)和线性传感器(507)；
其中由所述传感器检测到的频谱在处理单元(520)中处理，所述处理单元(520)确定从所述分束装置到所述逆反射装置的相对光路长度，通过分析传感器上的特殊频率，所述相对光路长度具有从所述分束装置到所述样品的光路长度，并且处理单元基于校准的焦点设置路径长度来确定相对光程长度的偏移，并且驱动发动机单元(519)以移动样品架，使得样品架上的样品进入成像物镜的焦点。
8.根据权利要求7所述的系统，其中所述成像物镜是可互换的，并且所述逆反射装置电动化，使得可以调整参考路径长度以补偿在不同物镜中的光路长度差异。
9.根据权利要求7所述的系统，其中所述成像物镜是可互换的，并且所述系统还包括可互换的色散补偿玻璃板，所述色散补偿玻璃板匹配不同物镜中的光程长度差异。
10.根据权利要求7所述的系统，其中所述成像物镜是可互换的，并且所述干涉仪模块包括棱镜元件，所述棱镜元件沿其对称轴调节以匹配不同物镜中的光程长度差异。
11.根据权利要求7所述的系统，其中所述成像物镜是可互换的，并且所述系统配置为以数字方式补偿不同物镜中的路径长度差异。
12.根据权利要求11所述的系统，其中存储不同物镜中的路径长度差的补偿数据。
13.一种用于自动聚焦显微镜系统的自动相对聚焦调整的方法，所述自动聚焦显微镜系统包括低相干干涉仪和分束装置，所述分束装置将光透射到显微镜并将来自低相干干涉仪的光反射到与成像物镜的光轴平行的光路中，其中样品被覆盖材料覆盖，所述方法包括：
计算相对空气/覆盖材料位置的A扫描数据(1330)；
计算相对样品位置的A扫描数据(1340)；
校准焦点位置(1320)；
计算所述覆盖材料的厚度(1360)；
处理发动机设定位置(1360)；以及
控制发动机单元的移动(1360)；
其中如果从样品背向散射的信号小于本底噪声10dB以上，则存储对应于大于本底噪声10dB的从样品背向散射的信号的最后位置(1350)；
其中如果从样品背向散射的信号小于本底噪声10dB以上，最后位置用于处理(1350)。
14.一种用于操作显微镜系统的方法，所述显微镜系统包括低相干干涉仪(500)和分束装置(509)，所述分束装置将光透射到显微镜并将来自低相干干涉仪的光反射到与成像物镜(514)的光轴(513)平行的光路中，所述方法包括：
通过成像物镜将来自低相干干涉仪的光聚焦到样品材料(517)中，所述样品材料被部分反射介质(515)覆盖；
在所述低相干干涉仪上设置检测孔，所述检测孔不与具有照明孔的点对称区域限定的孔重合，所述点对称是具有孔平面的成像物镜的光轴的截距；以及
检测一部分来自样品的反向散射光，并且排除从部分反射介质反射的大部分光。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述照明孔到所述光轴的中心至少偏移一半FWHM(半高宽)，并且所述检测孔与所述照明孔重合。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述照明和检测孔重合并剪除以避免与所述光轴点对称。
17.根据权利要求14所述的方法，其中检测孔为环形，并且大于照明孔。
18.根据权利要求14所述的方法，其中照明孔为环形，并且大于检测孔。
19.根据权利要求14所述的方法，其中检测孔位于任意位置，并且不与照明孔的点对称镜像重合。
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