CN107405392B - 用于增强对抗登革病毒的安全性及免疫力的抗原表位替换的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种分离的突变登革病毒E蛋白变体。该变体包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％的相似度，且在天冬酰氨酸8(N8)、精氨酸9(R9)、缬氨酸12(V12)及/或谷氨酸13(E13)的对应位置上具有一个或多个氨基酸残基取代基。该变体可包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的相似度且缺乏包含在结构域I的SEQ ID NO:28氨基酸序列的感染性增强抗体结合基序。还公开了一种编码该变体的分离的核酸序列、一种表达该变体的质粒、一种表达包含该变体的病毒样颗粒的质粒、一种DNA疫苗，以及一种检测生物样品中登革病毒存在的方法。

Description

用于增强对抗登革病毒的安全性及免疫力的抗原表位替换的 疫苗
技术领域
本发明大体上与疫苗有关，更特定而言是与用于登革病毒的疫苗有关。
背景技术
登革病毒(DENV)，一种全球性的疾病，被分为四种血清型(DENV1-4)。抗登革病毒的包膜蛋白(E)的交叉反应性及非中和抗体与细胞的Fcγ受体(FcγR)结合，从而经由抗体依赖性增强(ADE)由异源血清型加剧病毒感染。增强的抗原表位的鉴定与修饰可以减轻登革病毒感染的增强。
因此，登革病毒E蛋白的B细胞抗原表位，其诱发交叉反应性及非中和抗体的鉴定可能对疫苗开发提供有价值的信息。目前尚无既安全又有效的抗登革病毒疫苗。因此，需要鉴定并替换中和性很差且高度增强抗体所识别的抗原表位以改善登革疫苗。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种分离的突变登革病毒E蛋白变体，包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％的相似度，且在天冬酰氨酸8(N8)、精氨酸9(R9)、缬氨酸12(V12)和/或谷氨酸13(E13)的对应位置上具有一个或多个氨基酸残基取代。
在另一方面，本发明涉及一种分离的突变登革病毒E蛋白变体，其中该非突变的野生型登革病毒E蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，该变体包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的相似度且缺乏包含在结构域I的SEQ ID NO:28氨基酸序列的感染性增强抗体结合基序。
在本发明的一个具体实施例中，该变体包含选自下列所组成的群组中的一个或多个突变：(a)该第8天冬酰氨酸残基的取代；(b)该第9精氨酸残基的取代；(c)该第12缬氨酸残基的取代；以及(d)该第13谷氨酸残基的取代。
在本发明的一个具体实施例中，该突变登革病毒E蛋白变体在位置8的天冬酰氨酸被取代。例如，该变体的天冬酰氨酸被丙氨酸、谷氨酸或精氨酸取代。
在另一方面，本发明涉及一种编码如前述的突变登革病毒E蛋白变体的分离的核酸序列。
在另一方面，本发明涉及一种表达如前述的突变登革病毒E蛋白变体的质粒。
在另一方面，本发明涉及一种表达病毒样颗粒的质粒，该病毒样颗粒包含如前述的突变登革病毒E蛋白变体。
在本发明的一个具体实施方式中，前述的质粒包含(a)一种包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列的分离的核酸序列；以及(b)一种可操作地连接到该分离的核酸序列的启动子。
在另一方面，本发明涉及一种DNA疫苗，包含：(a)一种重组DNA，包含编码如前述的突变登革病毒E蛋白变体的核苷酸序列与可操作地连接到该核苷酸序列的启动子；以及(b)金或钨，其中该重组DNA和金或钨形成复合物。
在另一方面，本发明涉及包含抗体的免疫的人类血清，该抗体具有下列特征：(a)与野生型登革病毒E蛋白和如前述的突变登革病毒E蛋白变体具有特异性结合亲和力；(b)具有抗登革病毒感染的中和与保护活性；(c)无登革病毒感染的抗体依赖性增强；(d)该抗体由突变登革病毒E蛋白变体所引起；以及(e)对于位于野生型登革病毒E蛋白的结构域I的登革病毒感染性增强的抗原表位天冬酰氨酸8(Asn8)、精氨酸9(Arg9)、缬氨酸12(Val12)和/或谷氨酸13(Glu13)不具有结合活性。
在另一方面，本发明涉及前述的免疫的血清或前述的突变登革病毒E蛋白变体在制造一种用于在有此需要的个体体内引发抗一种或多种登革病毒血清型的中和与保护活性的药物，和/或在制造一种用于中和登革病毒、减少、减轻登革病毒感染的抗体依赖性增强的药物，和/或提高有此需要的个体的存活率的用途。
在本发明的一个具体实施方式中，该药物是用于在个体内减轻该抗体依赖性增强，该个体的血清样品显示对包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的分离的多肽有反应性。
或者，本发明涉及前述的免疫的血清或前述的突变登革病毒E蛋白变体用于在一有此需要的个体体内引发抗一种或多种登革病毒血清型的中和与保护活性，或用于中和登革病毒、减少、减轻登革病毒感染的抗体依赖性增强，和/或提高有此需要的个体的存活率的用途。
或者，本发明涉及在有此需要的个体体内引发抗一种或多种登革病毒血清型的中和与保护活性的方法，或中和登革病毒、减少、减轻登革病毒感染的抗体依赖性增强，和/或提高有此需要的个体的存活率的方法，包含对该有此需要的个体施予前述的免疫的血清或前述的突变登革病毒E蛋白变体。
在本发明的一个具体实施方式中，前述的免疫的血清或突变登革病毒E蛋白变体是用于在一个体体内减轻该抗体依赖性增强，该个体的血清样品显示对包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的分离的多肽有反应性。
在本发明的一个具体实施方式中，该分离的多肽的长度小于15个氨基酸残基，且与选自于由SEQ ID NOs:2-12及14-26所组成的群组的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的相似度。
此外，在另一方面，本发明涉及一种检测生物样品中登革病毒存在的方法，包含：
(a)将该生物样品与包含如前述的突变登革病毒E蛋白变体或含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的分离的多肽的组合物接触；
(b)使该生物样品中的登革病毒抗体与该变体或多肽形成复合物；以及
(c)检测该复合物中登革病毒抗体的存在。
另外，在另一方面，本发明涉及一种检测生物样品中登革病毒感染性增强的抗体的存在的方法，包含：
(a)将该生物样品与包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的分离的多肽的组合物接触；
(b)使在该样品中的登革病毒感染性增强的抗体与该多肽形成复合物；以及
(c)检测该复合物中感染性增强的抗体的存在。
该生物样品可选自由下列所组成的群组：血液、血清、血浆、唾液、脑脊液，以及尿液。
这些与其他方面在结合以下附图后将对以下描述的优选的实施方式变得明显。
附图例示出了本发明的一个或多个具体实施方式，并且与书面描述一起用于解释本发明的原理。只要可能，相同的组件符号在整个附图中用来指示一个具体实施方式的相同或类似的组件。
附图说明
图1A-图1B显示由交叉反应性的单克隆抗体所介导的登革病毒感染的ADE。(A)在连续稀释的单克隆抗体存在下，用登革病毒1(MOI＝1)、登革病毒2(MOI＝1)、登革病毒3(MOI＝5)或登革病毒4(MOI＝1)感染的K562细胞，在感染后72小时用4G2及RPE偶联的山羊抗小鼠IgG抗体染色并接着用流式细胞仪检验。显示受感染的K562细胞的百分比。(B)所指示的单克隆抗体进行连续稀释，并在4℃下与登革病毒2(MOI＝1或10)培养1小时。然后将混合物加入到THP-1细胞，并在感染后72小时用流式细胞仪检验受感染的细胞。受感染的细胞用hDB32-6及RPE偶联的山羊抗人类IgG抗体染色。显示受感染的THP-1细胞的百分比。以NMIgG作为对照组。图1A及图1B中显示的数据是来自三个独立实验的平均值±标准偏差(SEM)。
图2A-图2E显示体内ADE的特征以及用DB21-6及DB39-2单克隆抗体与患者血清竞争。(A)AG129小鼠在第0天以1×105pfu的DENV2S221进行静脉注射感染，并在第-1天以及第1天以腹腔注射给予5μg的DB21-6(n＝8)或同型对照组(n＝5)。记录存活率30天。(***P<0.001，相对于同型对照组)。(B)AG129小鼠在第0天以1×105pfu的DENV2S221进行静脉注射感染，并在第-1天以及第1天以腹腔注射给予5μg的DB39-2(n＝7)或同型对照组(n＝6)。记录存活率30天。(**P<0.01，相对于同型对照组)。图2A与图2B中显示的数据是来自两个独立实验中的一个代表性实验。(C-D)使用定量RT-PCR在感染DENV2S221后用DB21-6或DB39-2单克隆抗体处理的AG129小鼠血中测量病毒含量。在感染后第4及5天，病毒量显著增加。显示的数据为平均值±标准偏差。(**P<0.01，***P<0.001)(E)单克隆抗体与患者血清之间竞争与DENV2结合。(*P<0.05，***P<0.001，NS不显著)。
图3A-图3B显示用DB21-6和DB39-2单克隆抗体进行噬菌体展示多肽库的筛选。(A)经过3轮生物淘选后，噬菌体效价分别增加12871倍(DB21-6)以及5000倍(DB39-2)。(B)用ELISA确认DB21-6和DB39-2所筛选出的免疫阳性噬菌体选殖株。以NMIgG作为阴性对照组。
图4A-图4D显示DB21-6和DB39-2单克隆抗体的抗原表位残基确认。(A)以表达野生型(WT)或突变DENV2E蛋白的载体转染BHK-21细胞。2天后，将收集的细胞与单克隆抗体进行反应，然后用流式细胞仪分析。测定相对指数。取代N8、R9、V12，以及E13导致DB21-6的结合活性显著丧失。取代N8、R9以及E13导致DB39-2的结合活性显著丧失。以4G2作为对照组。显示的数据是来自两个独立实验中的一个代表性实验。(B)该模型是基于登革病毒DENV2E蛋白模型(PDB：1OAN)，从结构底部显示的位置。交叉反应性单克隆抗体的抗原表位位于EDI中的N8、R9、V12，以及E13残基。(C)用PYMOLTM程序进行结构分析确定来自相同(阴影部分)或相邻单体的抗原表位残基之间的距离(°A)。(D)用兔抗DENV2E蛋白的血清多克隆抗体捕捉分泌出来的病毒样颗粒(VLP)。通过捕捉病毒样颗粒的ELISA用DB32-6和4G2检测野生型(WT)和突变的病毒样颗粒。显示的数据是来自两个独立实验中的一个代表性实验。
图5A-图5E显示免疫的血清与登革病毒DENV2的体外和体内的中和分析。(A)在三周的间隔用载体、野生型(WT)，或N8R质粒对小鼠进行免疫。在第3次免疫后，收集并合并血清样品以用于每个组别。使用含有感染登革病毒DENV2 16681的C6/36细胞培养盘进行ELISA评估免疫血清。在490nm波长下测定吸光度(**P<0.01，NS不显著)。(B)第3次免疫后，将个体合并的血清进行连续稀释并在4℃下与登革病毒DENV2(MOI＝1)共同培养1小时。然后将该混合物用于感染BHK-21细胞。3天后，用4G2对细胞染色，并用流式细胞仪进行分析。(n＝3)(C)表格显示对登革病毒DENV2感染具有50％抑制率的效价。(D和E)第3次免疫后，将个体合并的血清进行连续稀释并在4℃下与25倍半致死量(LD50)的登革病毒DENV2共同培养0.5小时。将混合物通过脑内途径(i.c.)注射到ICR哺乳小鼠。记录存活率28天。用来测试每种免疫血清的试验动物数目介于每组4至16只。(***P<0.001，**P<0.01，相对于免疫载体的血清)。图5A、图5B、图5D和图5E中显示的数据是来自两个独立实验中的一个代表性实验。
图6A-图6F显示用免疫血清治疗的AG129小鼠，体内试验死亡率的增强。(A)AG129小鼠在第0天以1×105pfu的登革病毒DENV2(S221)进行静脉注射感染，并在第-1天以及第1天以腹腔注射给予用野生型(WT)(n＝4)、N8R(n＝4)，或载体(n＝4)免疫的血清(1:25稀释)。用野生型(WT)(P＝0.3834)或N8R(P＝0.1278)免疫血清处理小鼠的存活率，与用载体免疫血清处理小鼠的存活率没有显著差异。(B)AG129小鼠在第0天以1×105pfu的登革病毒DENV2(S221)进行静脉注射感染，并在第-1天以及第1天以腹腔注射给予用野生型(WT)(n＝5)、N8R(n＝5)，或载体(n＝7)免疫的血清(1:100稀释)。用野生型(WT)(***P＝0.0007)免疫血清处理小鼠的存活率，显著地低于用载体免疫血清处理小鼠的存活率。然而，用N8R(P＝0.3538)免疫血清处理小鼠的存活率，与用载体免疫血清处理小鼠的存活率没有显著差异。(C)AG129小鼠在第0天以1×105pfu的登革病毒DENV2(S221)进行静脉注射感染，并在第-1天以及第1天以腹腔注射给予用野生型(WT)(n＝7)、N8R(n＝7)，或载体(n＝6)免疫的血清(1:400稀释)。用野生型(WT)(P＝0.8701)或N8R(P＝0.1587)免疫血清处理小鼠的存活率，与用载体免疫血清处理小鼠的存活率没有显著差异。(D)示意图描述了单克隆抗体和免疫血清的竞争分析。在4℃下用兔抗DENV超免疫血清多克隆抗体涂覆ELISA分析盘过夜。在阻断后，在室温下加入稀释的登革病毒DENV2病毒上清液反应2小时。将与HRP偶联的增强型单克隆抗体(Innova Biosciences公司HRP偶联试剂盒)以及免疫的血清(1:40稀释)在室温下培养2小时。清洗后，加入OPD溶液，并用3N盐酸停止反应。在490nm波长下测定吸光度。(E-F)单克隆抗体与免疫的血清之间对与登革病毒DENV2结合的竞争。以正常小鼠血清(Normalmouse serum，NMS)作为对照组。竞争的百分比计算如下：竞争作用(％)＝[1-(免疫血清与单克隆抗体的混合物的吸光度/正常小鼠血清与单克隆抗体混合物的吸光度)]×100。(***P<0.001)
图7A-图7C显示通过免疫荧光分析法(immunofluorescence assay，IFA)分析DB21-6和DB39-2抗登革病毒DENV以及登革病毒DENV2的E蛋白的特征。(A)用登革病毒DENV1(MOI＝1)、DENV2(MOI＝1)、DENV3(MOI＝10)，或DENV4(MOI＝1)感染BHK-21细胞。2天后，使用DB21-6和DB39-2检测被感染的细胞。以未被感染的细胞(对照组)和NMIgG作为阴性对照组。其结果以400倍放大倍数显示。(B和C)DENV2E，包含E蛋白的第1-400个氨基酸，被克隆到pcDNA3.1质粒内。DENV2EDI-II(第1-295个氨基酸)和EDIII(第295-400个氨基酸)也被分别插入pcDNA3.1质粒内。转染后，用IFA来显示DB21-6和DB39-2识别表达DENV2E(B)或EDI-II(C)蛋白质的BHK-21细胞。
图8A-图8B显示单克隆抗体抗登革病毒DENV1-4的中和活性评估。(A)DB21-6、DB39-2，或4G2抗登革病毒DENV1-4的中和活性与抑制作用分析。登革病毒DENV1(MOI＝5)、登革病毒DENV2(MOI＝1)、登革病毒DENV3(MOI＝5)，或登革病毒DENV4(MOI＝1)与单克隆抗体在4℃下培养1小时，然后用于感染BHK-21细胞。3天后，将细胞固定并用4G2染色。抗体效价表示为抑制百分比。显示的数据是来自两个独立实验中的一个代表性实验。(B)DB21-6、DB39-2和4G2对登革病毒DENV1-4的50％抑制浓度的总结。
图9A-图9B显示在K562(A)和THP-1(B)细胞中，登革病毒DENV2S221感染的由单克隆抗体介导的ADE的体外测试。登革病毒DENV2S221与单克隆抗体的稀释液在4℃下培养1小时，并将得到的混合物用于感染K562或THP-1细胞。3天后，将细胞用4G2染色，并用流式细胞仪进行分析。
图10A-图10B显示使用单克隆抗体和患者血清的竞争分析。稀释倍数为1:50(A)或1:200(B)的单克隆抗体和患者血清之间竞争与登革病毒DENV2结合。
图11A-图11D显示用ELISA评估抗登革病毒DENV2的体液免疫反应。(A)在三周的间隔用载体对照组、野生型(WT)，或N8R质粒对小鼠进行免疫。在第一、二、三次免疫后，收集并合并血清样品。使用含有感染DENV2 16681的C6/36细胞的培养盘评估血清。(B)收集的血清被稀释为1：200，并用抗IgG1或IgG2a抗体检测。(C)IgG1/IgG2a的比值。(D)在第三次免疫后收集并检测免疫的血清(***P<0.001)。
图12A-图12B显示感染不同登革病毒DENV2病毒株的中和作用。(A)分别在1、1、1或10的MOI条件下用登革病毒DENV2病毒株16681、PL046、马来西亚07587，或NGC在37℃下感染BHK-21细胞2小时。3天后，将细胞固定，用4G2和RPE偶联的山羊抗小鼠IgG染色。用流式细胞仪分析受感染细胞的百分比。以BHK-21细胞作为阴性对照组(对照组)。PE表示藻红蛋白。FSC表示前向散射。(B)分别在1、1、1或10的MOI条件下，将第3次免疫合并的血清的连续稀释液与登革病毒DENV2病毒株16681、PL046、马来西亚07587，或NGC在4℃下培养1小时。然后用得到的混合物感染BHK-21细胞。3天后，将细胞用4G2染色，并用流式细胞仪分析。
图13显示一个N8R质粒的载体图谱。CMV：巨细胞病毒启动子。JEV SS：日本脑炎病毒(JEV)的信号多肽序列。JEV-E：日本脑炎病毒的包膜(E)蛋白序列。SEQ ID NO:27的核苷酸序列包含JEV SS和prM(第1-570个核苷酸)、N8R(第571-1755个核苷酸)，和JEV-E(第1756-2058个核苷酸)的区域。
具体实施方式
本发明更具体地由以下的实施例所描述，这些实施例仅为说明性的，因为对本领域技术人员而言，许多修改和变化将是显而易见的。现在将详细地描述本发明的各种具体实施例。参照附图，贯穿附图，相同的数字表示相似的组件。如在本文的描述和整个随后的权利要求，“一”、“一个”以及“该”的含义包括复数引用，除非上下文另有明确说明。此外，如在本文的描述和整个随后的权利要求所用的“中”的含义包括“中”和“上”，除非上下文另有明确说明。此外，为了便于读者阅读，在本说明书中可能使用标题或副标题，其对本发明的范围没有影响。此外，在本说明书中使用的一些术语更特定地定义如下。
定义
在本说明书中使用的术语通常具有在本领域中普通的含义，在本发明的范围内，并在使用各术语的特定上下文中。用来描述本发明的某些术语将在下面讨论，或者在说明书的其他地方中，以提供关于本发明的描述的从业者进一步的指导。为了方便起见，某些术语可被突出显示，例如使用斜体字和/或引号。使用突出显示对术语的范围和含义没有影响；在同样的情况下，不论一个术语是否被突出显示，其范围和含义是一样的。应该理解的是，同样的东西可以一个以上的方式叙述。因此，替代语言和同义词可用于本文中所讨论的任一个或一个以上的术语中，不论一个术语是否在本文中被阐述或讨论，并无任何特殊的意义。提供了某些术语的同义词。列举一个或多个同义词并不排除使用其它同义词。在本说明书中任何地方使用到的实施例，包括在本文所讨论的任何术语的示例都仅是说明性的，而绝不是限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样地，本发明并不限定于在本说明书中给出的各种具体实施例。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属技术领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。在冲突的情况下，以本文件，包括定义，为准。
如本文所用，“左右”、“大约”或“近似”一般应在20％之内的意思，优选在10％之内，更优选地在给定值或范围的5％之内。本文所给出的数值的数量是近似的，这意味着，如果没有明确说明，可以推断出术语“左右”、“大约”或“近似”。
术语“处理”或“治疗”是指以治愈、减轻、解除、补救、改善，或防止疾病、其症状，或该疾病的倾向，或减轻症状发生率的目的，施用有效量的治疗剂至有此需要的个体，该个体带有该疾病，或有该疾病的症状或倾向。这样的个体可由医护专业人士基于任何合适的诊断方法的结果来鉴定。
“有效量”是指需要赋予经治疗的个体治疗效果的活性化合物的量。有效剂量会有所不同，如本领域的技术人员所知，这取决于施予途径、赋形剂的使用，以及共同使用其他治疗性处理的可能性。
由美国卫生与人类服务部食品及药物管理局所发行的“在成人健康志愿者的治疗剂临床试验中评估安全起始剂量的工业和审查指南”揭露“人类等效剂量”可通过下列公式计算来获得：
HED＝动物剂量(mg/kg)×(动物体重(公斤)/人体重(公斤))0.33。
如本文所用，当一个数字或一个范围被叙述时，在本领域的普通技术人员理解，该数字或范围旨在包括一个针对本发明有关的特定领域的适当合理范围。
美国专利第US 8,920,804号中已公开了用于标记抗体的检测试剂或标记试剂，其通过引用整体并入本文中。
野生型登革病毒DENV2(16681)的E蛋白(GenBank登录号：AAB58782)的第1-395个氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
缩写：病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)；登革热(dengue fever，DF)；登革出血热(dengue hemorrhagic fever，DHF)；E蛋白结构域I(E protein domain I，EDI)；抗体依赖性增强(antibody-dependent enhancement，ADE)；谷氨酸(Glu；E)；缬氨酸(Val；V)；天冬酰氨酸(Asn；N)；精氨酸(Arg；R)；膜前(prM)；包膜(E)蛋白；感染复数(multiplicity of infection，MOI)。
我们描述了抗登革病毒结构域I-II的单克隆抗体(mAbs)DB21-6和DB39-2的交叉反应特性；这些抗体具有很差的中和能力，且在体外和体内皆有力地增强登革病毒的感染。两个增强的单克隆抗体，DB21-6和DB39-2，被观察到与来自感染登革热患者血清中的抗体竞争。对这些增强的单克隆抗体的抗原表位进行鉴定。N8、R9、V12，和E13是DB21-6的反应性残基，而N8、R9，和E13是DB39-2的反应性残基。N8取代倾向于保持VLP的分泌，并降低DB21-6和DB39-2的结合活性。来自N8取代(N8R)DNA疫苗的免疫血清，在体外和体内均发挥比野生型(WT)免疫血清更大的中和及保护活性。用N8R免疫血清治疗降低在AG129小鼠中提高的死亡率。这些结果支持用增强的抗原表位识别及取代作为开发安全性登革疫苗的新策略。
实施例
以下提供根据本发明的具体实施例的示例性仪器、装置、方法及其相关的结果。
材料和方法
登革病毒、细胞株，以及单克隆抗体
四种登革病毒血清型，DENV1夏威夷、DENV2 16681、DENV3H87，以及DENV4H241，如Wu等人所述的方式(2003年)制备。(“Identification of a dengue virus type 2(DEN-2)serotype-specific B-cell epitope and detection of DEN-2-immunized animalserum samples using an epitope-based peptide antigen”J Gen Virol 84,2771-2779)。C6/36细胞在含有10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)与100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，以及0.25μg/ml两性霉素B的50％Mitsumashi和Maramorsch昆虫培养基(
Figure GDA0001413366500000101
公司)加上50％Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)中生长。将登革病毒以0.1-1的感染复数(MOI)感染C6/36细胞，并在28℃下培养7-9天。从上清液收集病毒，并用噬菌斑测定法在幼仓鼠肾成纤维细胞株(BHK-21)中测定病毒滴度。在-80℃保存等分试样。BHK-21细胞用补充10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，以及0.25μg/ml两性霉素B的基本必需培养基(MEM)培养。人类红白血病K562与单核球细胞THP-1细胞在含有10％FBS的RPMI培养基中培养。小鼠单克隆抗体，包括DB21-6和DB39-2，用登革病毒DENV2免疫BALB/c小鼠，并于杂交瘤细胞中生产而预先制备((Li等人(2012年)“Development of aHumanized Antibody with High Therapeutic Potential against Dengue Virus Type2”PLoS Negl Trop Dis 6,e1636))。DB21-6和DB39-2被确认为IgG1，并使用蛋白G琼脂(SEPHAROSE TM)4B凝胶(奇异医疗公司)纯化。
具有单克隆抗体的抗体依赖性增强(ADE)的体外测量
将单克隆抗体的连续稀释液与登革病毒DENV1夏威夷株(MOI＝1)、DENV2 16681(MOI＝1)、DENV3H87(MOI＝5)，以及DENV4H241(MOI＝1)在4℃下一起培养1小时。用该混合物在37℃下感染K562细胞2小时。清洗后，将细胞用2％FBS的RPMI培养基在37℃下培养3天。收集感染的细胞并用3.7％甲醛在4℃下固定10分钟。为了染色，将细胞在含有0.1％皂苷(Sigma公司)及2％FBS的PBS中透化，接着在4℃下用4μg/ml 4G2染色0.5小时。清洗细胞，并用R-藻红蛋白(R-phycoerythrin，RPE)偶联的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories公司)在4℃下培养1小时。清洗细胞，并用流式细胞仪确认感染细胞的百分比。针对THP-1细胞的感染，将登革病毒DENV2 16681(MOI＝1或10)与稀释的单克隆抗体在4℃下培养1小时，然后在37℃下与细胞一起培养2小时。3天后，将细胞固定、透化，并用hDB32-6染色。清洗后，将细胞用RPE偶联的山羊抗人IgG培养，并随后用流式细胞仪分析。
在AG129小鼠内具有单克隆抗体的抗体依赖性增强(ADE)的体内测量
干扰素第I型和第II型受体缺陷小鼠(AG129小鼠；5至6周龄)购自B&K Universal公司。在第1天与第-1天给予AG129小鼠在200μl PBS内的5μg单克隆抗体(腹腔注射)。以小鼠IgG1同型抗体作为阴性对照组。在第0天，用在100μl PBS内的1×105pfu适应小鼠的登革病毒DENV2S221(获自于S.Shresta)接种小鼠(静脉注射)。记录AG129小鼠的存活率30天。
以定量RT-PCR测量病毒血症
在第0天用1×105pfu的登革病毒DENV2S221(静脉注射)感染AG129小鼠，并在第-1天和第1天通过腹腔注射用5μg单克隆抗体处理。使用
Figure GDA0001413366500000111
病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen公司)从合并的受感染的小鼠血清中提取病毒RNA。使用
Figure GDA0001413366500000112
480系统(ROCHETM公司)进行定量RT-PCR。以登革病毒DENV2S221(浓度为101至107pfu/ml)制作标准曲线。病毒血症的测量以pfu当量/ml表示，这是基于根据针对登革病毒DENV2S221的标准曲线的循环阈值(Ct)所计算。
单克隆抗体和患者血清样品的竞争ELISA
共有21个受登革病毒DENV2感染的患者血清样品，于2002年至2003年在台湾爆发期间，收集自11个DF和10个DHF患者。登革病毒感染的诊断依据IgM抗体捕获ELISA(MAC-ELISA)、反转录酶PCR(RT-PCR)，或在细胞培养物中的病毒分离。这些血清样品是在从症状发作后第4天至第22天之间所收集的；这种血清含有抗登革抗体。根据世界卫生组织(WorldHealth Organization，WHO)于2009年发行的标准判断所有的患者具有典型的DF或DHF。表2显示纳入本研究的患者血清样品的特征。进行竞争性ELISA。简言之，在4℃下用多株兔抗DENV超免疫血清涂布培养盘过夜。阻断之后，在室温(R.T.)下加入稀释的DENV2病毒上清液(1×106pfu)2小时。稀释的单克隆抗体和患者血清(1:100倍稀释)在室温下培养2小时。清洗后，在室温下加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶联的抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)1小时。然后加入过氧化物酶基质邻苯二胺二盐酸(o-phenylenediamine dihydrochloride，OPD，SIGMA-ALDRICHTM公司)，并用3NHCl中止反应。在490nm波长下测量吸光度(OD)。以正常人类血清(Normal human serum，NHS)作为对照组。竞争作用的百分比计算如下：竞争作用(％)＝[1-(患者血清-单克隆抗体混合物的吸光度/正常人类血清(NHS)-单克隆抗体混合物的吸光度)]×100。
噬菌体展示生物淘选
进行噬菌体展示生物淘选。简言之，在4℃下将培养盘以100μg/ml单克隆抗体涂布6小时。清洗和阻断后，在室温下培养4×1010pfu的噬菌体展示多肽库(New EnglandBioLabs公司)50分钟。清洗后，结合的噬菌体用100μl 0.2M甘氨酸/盐酸(pH 2.2)洗脱，并用15μl 1M Tris/盐酸(pH 9.1)中和。然后将洗脱的噬菌体在ER2738中扩增，以用于后续几轮的筛选。在含有IPTG和X-Gal的LB平板培养基上测定噬菌体的数量。除了加入2×1011pfu的扩增噬菌体之外，第二轮和第三轮的筛选与第一轮一样。
用ELISA鉴定免疫阳性的噬菌体选殖株
将培养盘涂布50μg/ml单克隆抗体。在清洗与阻断后，加入扩增的噬菌体，并于室温下培养1小时。清洗后，加入稀释的与HRP偶联的抗M13抗体(奇异医疗公司)，并在室温下培养1小时。该培养盘与抗体作用且随后用3N HCl终止反应。在波长490nm下测定吸光度(OD)。
使用以流式细胞仪为基础的结合分析对表达野生型(WT)和突变DENV2prM/E蛋白的细胞进行抗原表位的鉴定
表达登革病毒DENV2的prM-E蛋白的pCBD2-2J-2-9-1质粒已经在先前被确定特征并描述(Chang等人，(2003年)“Enhancing biosynthesis and secretion of premembraneand envelope proteins by the chimeric plasmid of dengue virus type 2andJapanese encephalitis virus”Virology 306,170-180)。进行定点诱变以替换每个所选择的氨基酸残基。诱变后，对质粒进行测序，以确保在非目标位点上不存在任何进一步的突变。使用POLYJETTM体外DNA转染试剂(SignaGen Laboratories公司)用表达野生型(WT)或突变DENV2E蛋白的构建体转染BHK-21细胞。2天后，将细胞固定，并以在含有0.1％皂苷(SIGMATM公司)的PBS中的2％FBS进行透化。针对染色，将细胞与DB21-6、DB39-2、4G2，以及混合的单克隆抗体(DB32-6、3H5，以及DB25-2)分别以1、1、1和1μg/ml的浓度在4℃下培养0.5小时。清洗后，将细胞与RPE偶联的山羊抗小鼠IgG抗体培养，并用流式细胞仪进行分析。用下式测定单克隆抗体对突变的E蛋白的相对指数：[突变的E蛋白的强度/野生型E蛋白的强度(以单克隆抗体识别)]/[突变的E蛋白的强度/野生型E蛋白的强度(以混合的单克隆抗体识别)]。
通过捕获ELISA检测分泌的病毒样颗粒
用表达登革病毒DENV2的野生型(WT)或突变的E蛋白的载体转染BHK-21细胞，如上所述。在转染后48小时，收集培养物上清液。在4℃下用多株兔抗DENV超免疫血清涂覆培养盘过夜。阻断后，分别加入含有野生型或突变的病毒样颗粒(VLP)的二倍稀释上清液，在室温下作用2小时。各孔接着以稀释的DB32-6与4G2在室温下培养2小时。清洗后，加入以1：2000倍稀释的HRP偶联的抗小鼠IgG抗体，并在室温下作用1小时。最后，将该培养盘进行呈色，且随后用3N盐酸终止该反应。在490nm波长下测量吸光度。
免疫用的质粒的制备
将表达登革病毒DENV2野生型E蛋白(SEQ ID NO:1)或N8残基被R取代(N8R)的突变E蛋白的质粒用于免疫反应(图13)。针对涂层，将25毫克的1.0μm金粉再悬浮于50mM亚精胺。然后，加入50μg质粒DNA，随后加入1M CaCl2；将溶液混合并在室温下沉淀10分钟。离心收集后，将金-DNA复合物用无水乙醇清洗并重新悬浮于0.1mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)(360kDa)溶液中。将浆液注入TefzelR管(MCMASTER-CARRTM，芝加哥，伊利诺伊州)，然后涂覆。待乙醇挥发后，将管切成0.5英寸的子弹并在-20℃下储存。在每颗子弹中的金带有1μg DNA。在使用前，子弹被装入Helios基因枪装置(Bio-Rad公司，赫拉克勒斯，加州)，用于递送质粒。
小鼠的免疫
以设定为400磅/平方英寸(lb/inch2)的氦气压力的基因枪注入6周龄的雌性BALB/c小鼠的腹腔表皮。每只小鼠以施用4颗含有1μg质粒DNA的子弹进行免疫。小鼠在0、3，和6周进行免疫。在免疫前以及第三次免疫(免疫前、第1次、第2次、第3次免疫血清)后3周收集血清样品。每组取五至六只小鼠的血清样品合并并进行ELISA评估、中和测定，以及抗体依赖性增强(ADE)的体内测量。
用ELISA评估免疫血清抗登革病毒DENV2
以感染登革病毒DENV2 16681的C6/36细胞作为抗原。C6/36细胞接种到96孔ELISA盘的各孔中(2×104细胞/孔)。一天后，加入2×103pfu的登革病毒DENV2 16681(MOI＝0.1)以在37℃下感染细胞2小时。用PBS清洗ELISA盘上的孔，然后在28℃下在2％FBS培养基中培养5天。被感染的细胞用1:1的甲醇/丙酮在4℃下固定10分钟。用5％脱脂奶粉在4℃下对该ELISA盘进行阻断24小时。然后加入稀释的免疫血清在室温下培养2小时。将ELISA盘用含有0.1％(重量/体积)
Figure GDA0001413366500000141
20的磷酸缓冲盐水(PBST0.1)清洗三次，随后用HRP-偶联的抗小鼠IgG抗体培养。最后，将ELISA盘进行呈色，并用3N盐酸终止反应。在波长490nm处测定吸光度。
用免疫血清进行体外和体内中和测定
登革病毒DENV2 16681(MOI＝1)与第3次免疫的血清在4℃下培养1小时。在37℃下用混合物感染BHK-21细胞2小时。3天后，将细胞固定、透化，并用4μg/ml 4G2染色。清洗后，将细胞与RPE偶联的山羊抗小鼠IgG抗体培养，并用流式细胞仪进行分析。抑制百分比(％)＝[1-(与免疫血清一起培养的感染细胞百分比/未与免疫血清一起培养的感染细胞百分比)]×100。
ICR小鼠购自台湾大学医学院实验动物中心。连续稀释的免疫血清与1×104pfu(25倍致死剂量，25倍LD50)登革病毒DENV2 16681在4℃下培养0.5小时。二日龄的乳鼠以颅内注射(intracranial，i.c.)方式接种20μl的混合物。攻毒后，记录存活率28天。
免疫血清的体内抗体依赖性增强(ADE)的研究
在第-1天及第1天给予(腹腔注射)AG129小鼠免疫血清的稀释液，在第0天接种(静脉注射)1×105pfu的登革病毒DENV2S221。记录存活率30天。统计分析
使用Kaplan-Meier生存曲线表示存活率，并使用GraphPad Prism5进行统计分析。针对单克隆抗体和患者血清的竞争测定分析，以Student’s t检测法来确定显著差异和计算的P值(*P<0.05，***P<0.001，NS表示不显著)。针对评估用ELISA测量抗登革病毒DENV2的免疫的血清，以two-way ANOVA与Bonferroni事后检验来确定显著差异和计算P值(**P<0.01，NS表示不显著)。根据从个体合并的免疫血清的抑制百分比，用GRAPHPAD
Figure GDA0001413366500000151
5分析针对登革病毒DENV2的50％抑制效价。
结果
DB21-6和DB39-2的交叉反应对抗登革病毒的特征
图7A显示单克隆抗体DB21-6和DB39-2能识别感染登革病毒1-4的细胞。这些单克隆抗体也分别能识别表达DENV2E和EDI-II蛋白的转染BHK-21细胞(图7B和图7C)。因此，DB21-6和DB39-2的交叉反应能识别登革病毒1-4以及在E蛋白上的结构域I-II。
为了评估这些单克隆抗体的体外中和活性，我们用各别的单克隆抗体与登革病毒1-4的混合物感染BHK-21细胞。图8A-图8B显示，4G2，一种在一定浓度下具有中和及增强活性的抗黄病毒抗体，针对抗DENV2的部份，比DB21-6和DB39-2发挥更高的中和活性。图8B的表格显示抗登革病毒1-4的单克隆抗体的50％抑制浓度总结，表明DB21-6和DB39-2表现出针对登革病毒1-4的非中和活性(50％抑制浓度>33μg/ml)。
DB21-6和DB39-2的增强活性
为了在体外研究通过抗体依赖性增强(ADE)登革病毒感染的增强，我们进行体外抗体依赖性增强(ADE)分析，并用流式细胞仪检测登革病毒感染细胞百分比的增加。该带有FcγRIIA的K562细胞，其不表达第1型干扰素(interferon，IFN)，被用来检测通过抗体依赖性增强(ADE)而增强感染细胞。该连续稀释的单克隆抗体与登革病毒1-4一起培养，然后用来感染K562细胞。用流式细胞仪检测感染百分比。图1A示出了在大范围的单克隆抗体浓度产生感染的增强。4G2在较低的抗体浓度下造成在K562细胞中登革病毒1-4感染的增加。DB21-6和DB39-2在高抗体浓度下增强在K562细胞中登革病毒1-4的感染。
为了进一步证实增强感染，我们检查了在带有FcγRI和FcγRIIA的THP-1细胞内通过DB21-6和DB39-2增强登革病毒DENV2 16681的感染。在THP-1细胞中，通过DB21-6和DB39-2增强感染的程度比通过4G2增强的程度大(图1B)。
登革病毒DENV2S221以前被用来研究在AG129小鼠中通过抗体依赖性增强(ADE)提高死亡率。为了评估通过单克隆抗体使登革病毒DENV2S221感染体外增强，我们使用K562细胞和THP-1细胞进行抗体依赖性增强(ADE)分析。针对登革病毒DENV1-4的感染，高浓度的DB21-6和DB39-2增强了K562细胞中登革病毒DENV2S221的感染(图9A)。DB21-6和DB39-2在抗体的高浓度下增强DENV2S221在THP-1细胞中的感染(图9A-图9B)。这些结果表明，DB21-6和DB39-2可以提高在体外登革病毒DENV2S221感染。
我们证实在AG129小鼠体内增强的活性。与对照组感染小鼠相比，用5μg DB21-6处理且用DENV2S221感染的AG129小鼠显现出死亡率增加(图2A)。用5μg DB39-2处理的AG129小鼠也显现出增高的死亡率(图2B)。为了确定在感染登革病毒DENV2S221后用DB21-6或DB39-2处理AG129小鼠中的病毒血症，用定量RT-PCR测定病毒RNA的量。结果表明，与同型对照抗体处理组相比，在用DB21-6或DB39-2处理受感染的AG129小鼠后，病毒量显著地增加(图2C-图2D)。结果表明，DB21-6和DB39-2具有非中和活性，并在AG129小鼠体内提高死亡率。
单克隆抗体和感染患者血清的竞争分析
我们进行了竞争分析以确定从登革患者血清中的抗体是否与登革病毒DENV2结合的单克隆抗体竞争。表2示出了患者血清样品的特性。结果表明，来自被感染患者血清中的抗体会与DB21-6和DB39-2竞争。图2E显示，来自DHF患者血清样品的DB21-6和DB39-2的竞争比例显著高于来自DF患者的，而无论从DF或DHF患者而来的血清与中和DB32-6的竞争比例则相似。以较浓的(1:50稀释)或稀释的(1：200稀释)的血清进行相同的实验，得到类似的结果(图10A-图10B)。结果表明，从DHF患者得到的血清样品含有较高浓度的抗体，其与DB21-6和DB39-2单克隆抗体竞争。
DB21-6和DB39-2的增强抗原表位鉴定
为了确定DB21-6和DB39-2的增强抗原表位，我们使用了噬菌体展示多肽库来筛选反应的噬菌体选殖株。经过三轮生物淘选之后，与第一轮的噬菌体效价相比，分别增加到12871倍(DB21-6)和5000倍(DB39-2)(图3A)。随机地选择来自第三轮生物淘选的个别噬菌体选殖株。如ELISA所示，大部分筛选的噬菌体选殖株显现出对单克隆抗体显著的反应性，但对正常小鼠IgG抗体(NMIgG)则不具该反应性。在30个选定的噬菌体选殖株中，29个选殖株与DB21-6反应(图3B)。扩增免疫阳性的噬菌体选殖株，并分离它们的噬菌体DNA以进行DNA测序。表1示出了具有识别的个体多肽序列的11个噬菌体选殖株。同样地，在47个选定的噬菌体选殖株中，46个与DB39-2反应(图3B)。46个与DB39-2反应的免疫阳性噬菌体选殖株中的13个拥有个别的多肽序列。多肽序列的比对显示DB21-6和DB39-2的结合基序为N-R-x-x-V-E(SEQ ID NO:28)。多肽序列的模型与抗原表位服务器预测E蛋白的抗原表位残基为N8、R9、V12，以及E13。
为了进一步验证DB21-6和DB39-2的抗原表位，我们使用pCBD2-2J-2-9-1作为模板进行噬菌体展示的抗原表位的位点定向诱变。通过测序确认变体之后，我们用突变质粒转染细胞，并用流式细胞仪检测结合活性。将每个转染细胞用抗EDIII的单克隆抗体(DB32-6、3H5，和DB25-2)的结合百分比进行归一化，并计算相对指数且如图4A所示。4G2，其与在EDII的融合环上的残基结合，被作为对照组，以验证由突变引起的E蛋白结构变化。基于相对指数，我们发现，在N8、R9、V12，和E13上的突变阻止DB21-6的结合。以同样的方法来识别DB39-2的抗原表位残基为N8、R9，和E13。应用结构模型以显示识别的残基都位于E蛋白的结构域I(图4B)。使用结构模型程序分析来自同样的单体的这些残基之间的距离，并发现小于30°A(图4C)。这个距离可以被单个IgG分子所跨越。这表示，N8、R9、V12，和E13残基构成DB21-6的抗原表位，且N8、R9，和E13残基构成DB39-2的抗原表位。比对显示，DB21-6和DB39-2的结合基序对应于N8、R9、V12，和E13残基，其在登革病毒DENV1-4中是保守的序列(表3和4)。最后，我们使用VLP-捕获ELISA来证明在R9、V12，和E13突变影响登革病毒DENV2的VLP分泌(图4D)。这些突变对分泌VLP的能力影响可能是因为E蛋白结构的变化所造成。然而，N8R取代并未影响DENV2VLP的分泌(图4D)。N8取代趋于保持VLP的分泌和降低DB21-6和DB39-2的结合活性。
小鼠体液免疫反应的检验
在第0、3，和6周时，用载体、野生型，或N8R质粒免疫BALB/c小鼠。经过三次免疫，收集血清样品且将每组血清样品合并。用ELISA检测该免疫血清。图11A显示在免疫后观察到抗DENV2的抗体滴度显著增加。抗DENV2的第三次野生型和N8R免疫的血清表现出比载体免疫血清显著较高的吸光度(图5A)。分析以抗IgG1和IgG2a抗体免疫的血清显示，该IgG1/IgG2a的比值在第二和第三次免疫之间增加(图11B和图11C)。在15周后，免疫小鼠仍保持其抗DENV2的反应(图11D)。
免疫血清的中和活性评估
将该免疫血清用于评估对登革病毒DENV2的中和活性。野生型与N8R免疫的血清均表现出高的中和活性，而载体免疫的血清则没有(图5B)。N8R免疫的血清比以野生型免疫的血清更能有效率的中和登革病毒DENV2的感染(图5C)。为了进一步评估免疫血清是否能广泛地中和多种DENV2病毒株，用免疫血清混合四种不同的DENV2病毒株：16681、NGC、PL046，和马来西亚07587株感染BHK-21细胞。值得注意的是，图12A-图12B表明，野生型和N8R免疫血清展现出抗多种类型登革病毒DENV2的病毒株高中和活性。
检查体内免疫血清对抗DENV2 16681的保护作用。用1:100与1:200稀释的野生型免疫血清处理的小鼠存活率，显著高于用1:100稀释的载体免疫血清处理的小鼠存活率(图5D)，而用1:100、1:200及1:400稀释的N8R免疫血清处理的小鼠存活率，则显著高于用1:100稀释的载体免疫血清处理小鼠存活率(图5E)。用野生型免疫血清处理，在1:200的稀释浓度下提供50％的保护率，而用N8R免疫血清处理，在1:400的稀释浓度下提供50％的保护率(图5D和图5E)。因此，N8R免疫血清在体外和体内具有比野生型免疫血清更高的中和及保护活性。
该免疫血清在体内增强活性的测试
为了研究体内增强的死亡率，我们将不同稀释浓度的野生型、N8R，或载体免疫的血清转移到AG129小鼠体内。接着用登革病毒DENV2S221感染后，野生型或N8R免疫血清(1:25稀释)处理的小鼠存活率，高于用载体免疫血清处理的小鼠存活率(图6A)。图6B显示，用1:100稀释浓度野生型免疫血清处理的小鼠，表现比载体免疫血清处理的小鼠更高的死亡率。用1:100稀释浓度N8R免疫血清处理的小鼠存活率，高于用载体免疫血清处理的小鼠存活率。用N8R免疫血清处理的小鼠则未观察到死亡率增高。用1:400稀释的野生型或N8R免疫血清处理则对小鼠不具有保护或增强死亡的效果。这些结果表明，E蛋白的N8R取代可以减少在体内死亡率增强的效果。
为了进一步了解这些增强抗体在免疫血清中产生的特征，我们用免疫血清进行了竞争性ELISA以抑制HRP偶联的DB21-6或DB39-2单克隆抗体的结合(图6D)。HRP偶联的DB21-6和DB39-2的竞争比例，在野生型免疫血清中显著高于那些在N8R免疫血清中的竞争比例(图6E-图6F)。这些结果表明，N8R取代可通过减少增强抗体的生成而重定向免疫优势。
我们描述了DB21-6和DB39-2增加登革病毒感染细胞百分比的能力特征。这些单克隆抗体增强AG129小鼠的死亡率。来自感染患者血清中的抗体会与这些单克隆抗体竞争结合位置。我们将增强单克隆抗体DB21-6和DB39-2的抗原表位定位在EDI蛋白上。为了研究如何降低增强作用，同时保持中和活性，我们取代了E蛋白的N8残基，用基因枪递送系统对小鼠免疫野生型或N8R质粒。经过三次免疫后，N8R免疫血清产生对DENV2的中和活性，而且与野生型免疫血清相比，降低了增强的死亡率。因此，增强的抗原表位残基的取代可以增加抵抗病毒感染的免疫反应，同时降低了抗体依赖性增强(ADE)的可能性。
我们证明了对EDI-II交叉反应的DB21-6和DB39-2对登革病毒1-4具有差的中和活性(图8A-图8B)。DB21-6和DB39-2在体外具有强的抗体依赖性增强(ADE)活性(图1)。4G2具有抗登革病毒1-4部分中和活性(图8A-图8B)以及在低抗体浓度下增强了体外病毒感染(图1A)。DB21-6和DB39-2在高浓度下增强了DENV1-4在K562细胞中的感染(图1A)。在THP-1细胞中，由DB21-6和DB39-2增加DENV2的感染，比由4G2增加的程度大很多(图1B)。DB21-6和DB39-2增强了在AG129小鼠中的死亡率(图2A和图2B)以及增加在受感染小鼠的血清中的病毒载量(图2C-图2D)。这些结果表明，DB21-6和DB39-2在体外和体内具有很强的增强活性。
抗体依赖性增强(ADE)被视为导致严重登革热疾病，包括DHF/DSS发展的重要机制。交叉反应性以及与病毒结合的非中和抗体可以通过抗体依赖性增强(ADE)提高带有FcγR细胞的感染，从而提高病毒载量和/或产生细胞激素。高病毒载量与登革热疾病的严重程度和DHF相关。因此，有必要能够确认在登革患者血清中增强抗体的存在。我们的结果表明，DB21-6和DB39-2的竞争比例在DHF病患血清中显著高于在DF病患血清中的比例(图2E)，这表明在登革患者的血清样品中有较高量的增强抗体，DB21-6和DB39-2，与严重的登革疾病有关。我们推测当增强抗体的表达程度较高的时候，这种登革病毒感染的患者可能遭受更严重的症状，如DHF。
使用DB21-6和DB39-2单克隆抗体筛选的噬菌体选殖株展现出包含共有基序的多肽序列，N-R-x-x-V-E(表1)。这些展示的多肽序列可以适用于检测登革患者血清样品中的增强抗体，以及用于提供有关登革热发病机制的信息。通过展示的多肽序列和结构模型比对，预测候选的抗原表位并使用VLP突变体证实(图3和图4)。增强的单克隆抗体DB21-6的抗原表位残基为在DENV2E蛋白的结构域I的N8、R9、V12，和E13(图4A和图4B)，而增强的单克隆抗体DB39-2的抗原表位残基为在DENV2E蛋白的结构域I的N8、R9，和E13。该N8、R9、V12，和E13残基在登革病毒1-4是保守的序列。因此，交叉反应的DB21-6和DB39-2可与DENV1-4结合。先前的报告指出，G106和L107是单克隆抗体4G2的抗原表位残基。图4A中的数据确认在融合环中的W101、G106、L107，以及F108是4G2的抗原表位残基。由4G2识别的抗原表位的残基与那些由DB21-6和DB39-2识别的抗原表位的残基不同。DB21-6(N8、R9、V12，和E13)以及DB39-2(N8、R9，和E13)的增强的抗原表位是新颖且以前未被报告过。
N8R取代并不影响DENV2VLP的分泌(图4D)。野生型和N8R免疫的血清均对DENV2具有保护活性。相较于野生型免疫的血清，N8R-免疫的血清具有较高的体外中和活性以及体内保护活性(图5B-图5E)。这些结果表明接种N8R DNA疫苗可能会增加对DENV2的中和与保护性免疫力。
我们使用稀释的载体、野生型或N8R免疫血清，然后用登革病毒DENV2S221对AG129小鼠进行攻毒。相对于载体免疫血清，野生型和N8R免疫血清在1:25稀释倍数下具有保护力。相较于用载体免疫的血清处理，用野生型免疫的血清在1:100稀释倍数下处理增加了小鼠的死亡率。用N8R免疫的血清在1:100稀释倍数下处理并未增加小鼠的死亡率(图6B)。当稀释至1:400时，没有观察到死亡率增加(图6C)。我们的结果表明，取代增强抗原表位可减少抗体依赖性增强(ADE)现象以及增加体内的保护活性。
在免疫小鼠中，增强抗原表位的取代以及中和抗原表位的保全可提供保护性免疫力。这种方法将重定向免疫优势(图6E-图6F)和通过满足所需的中和占位以提高免疫原性。总之，我们已经确定了新的增强抗原表位，并通过在DENV2E蛋白中N8R的取代，说明了一种使我们能够减少潜在抗体依赖性增强(ADE)的有用方式。这可能是一种适用于开发可增加抗DENV免疫反应的全新登革疫苗的可行方法。
表1示出了由DB21-6和DB39-2筛选的噬菌体展示多肽序列的比对。表2示出所用的DENV2感染患者的血清样品。表3示出登革病毒DENV1、2、3，和4a的EDI-II蛋白质的氨基酸序列比较。表4示出了数据库、基因/蛋白质以及登录/识别号。
表1
Figure GDA0001413366500000211
a噬菌体展示一致的氨基酸以粗体字显示。
b登革病毒DENV1-4的E蛋白中第8至13个氨基酸序列由GenBank检索得到(登录号AIU47321、AAB58782、AAA99437，以及AAX48017)。表2
Figure GDA0001413366500000221
Figure GDA0001413366500000231
aDHF：登革出血热；DF：登革热。
表3
Figure GDA0001413366500000232
Figure GDA0001413366500000241
a比对四种登革病毒血清型病毒株的EDI-II蛋白。所示为单个字母的氨基酸缩写。
b、c关键残基以粗体字显示，且通过分别与DB21-6b和DB39-2c结合的丧失来识别。
表4
Figure GDA0001413366500000242
Figure GDA0001413366500000251
Figure GDA0001413366500000261
我们发现，交叉反应性的单克隆抗体DB21-6和DB39-2表现出差的中和活性以及增强登革病毒感染的能力。我们确认被DB21-6和DB39-2识别的抗原表位。为了进一步改善抗登革病毒DENV2的DNA疫苗，在说明的例子中，我们在一个用于免疫作用的质粒中，以精氨酸取代野生型(WT)DENV2E蛋白的N8残基(N8R)。N8R免疫的血清产生比野生型免疫的血清更高的中和与保护活性。相较于用野生型免疫血清处理的小鼠，用N8R免疫血清处理AG129小鼠，减少了抗体依赖性增强(ADE)现象以及死亡率。总之，我们已经确定在E蛋白中一种新颖的交叉反应和增强感染性的抗原表位，并证明了取代该增强的抗原表位是一种有希望开发安全登革疫苗的策略。
在本说明书中所引用和讨论的所有参考文献均通过引用的方式整体并入本文，其程度相当于每个参考文献通过引用被单独并入。
序列表
<110> 中央研究院
<120> 用于增强对抗登革病毒的安全性及免疫力的抗原表位替换的疫苗
<130> 10011-047PCT
<150> US 62/113811
<151> 2015-02-09
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 395
<212> 蛋白质
<213> 登革病毒
<400> 1
Met Arg Cys Ile Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr
20 25 30
Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr
35 40 45
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys
50 55 60
Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro
65 70 75 80
Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met
85 90 95
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly
100 105 110
Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys
115 120 125
Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His
130 135 140
Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys
145 150 155 160
Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr
165 170 175
Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp
180 185 190
Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val
195 200 205
His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala
210 215 220
Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe
225 230 235 240
Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln
245 250 255
Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met
260 265 270
Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg
275 280 285
Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly
290 295 300
Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile
305 310 315 320
Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro
325 330 335
Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile
340 345 350
Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu
355 360 365
Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro
370 375 380
Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly
385 390 395
<210> 2
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> PC21-15
<400> 2
Asn Gly Ser Asn Arg Asp Ile Val Glu Val Gln Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> PC21-10
<400> 3
Asn Gln Ile Tyr Asn Arg Asp Tyr Thr Glu Pro Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> PC21-9
<400> 4
Tyr Asn Arg Asp Met Leu Glu Thr Asp Tyr Val Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> PC21-13
<400> 5
Gln Asn Thr Trp Asn Arg Asp Ser Ile Glu Glu Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> PC21-17
<400> 6
Phe Pro Glu Val Ser Val Asn Arg Leu Val Val Glu
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> PC21-20
<400> 7
His Val Asn Arg Leu His Val Glu Gly Pro Val Pro
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> PC21-18
<400> 8
Lys Met Thr Leu Pro Met Asn Arg Ser His Val Glu
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> PC21-2
<400> 9
Ser Tyr Val Thr Gly Gly Asn Arg Tyr Ala Val Glu
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<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> PC21-1
<400> 10
Ser Ser Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Phe Thr Glu Ala
1 5 10
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<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> PC21-16
<400> 11
Ser Ala Thr Thr Met Ser Asn Arg Tyr Tyr Thr Glu
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> PC21-5
<400> 12
Gln Pro Tyr Asn Arg Ser Tyr Ile Asp Phe Met Val
1 5 10
<210> 13
<211> 6
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DENV1-4
<400> 13
Asn Arg Asp Phe Val Glu
1 5
<210> 14
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
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<400> 14
Leu Ser Asn Arg Leu His Val Glu Ser Leu Glu Leu
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-40
<400> 15
Asn Gln Thr Asn Arg His Phe Val Glu Ile Val His
1 5 10
<210> 16
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-11
<400> 16
Ser Gly Leu Asp Arg Asn Arg Gln Leu Val Glu Arg
1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-39
<400> 17
Asn Arg Thr Leu Val Glu Leu Gly Tyr Ala Met Leu
1 5 10
<210> 18
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-3
<400> 18
Val Asn Arg Pro Trp Val Glu Thr Thr Thr Gln Gly
1 5 10
<210> 19
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-28
<400> 19
Ile Val Pro Tyr Ser Asn Arg Thr Val Thr Glu Thr
1 5 10
<210> 20
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-31
<400> 20
Asn Arg Val Ser Asn Glu Pro Phe Trp Asp Ile Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-34
<400> 21
Asp Tyr Leu Asn Arg Ser Thr Asn Glu Pro Ala Leu
1 5 10
<210> 22
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-36
<400> 22
Ser Met Pro Leu Ser Gly Arg Ala Val Val Glu Gly
1 5 10
<210> 23
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-47
<400> 23
His Thr Ser Leu His Ser Gly Arg Asn Ser Val Glu
1 5 10
<210> 24
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-4
<400> 24
Ser Ser Pro Gly Val Ile Ser Arg Phe Leu Val Glu
1 5 10
<210> 25
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-43
<400> 25
Asp Arg Tyr Leu Val Glu Tyr Ser Ser Gly Arg Trp
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-1
<400> 26
Met Pro Ser Gly Gly Arg Phe Leu Val Glu Gly Ala
1 5 10
<210> 27
<211> 2058
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码N8R突变的DNA序列
<400> 27
atgggcaaga ggtccgccgg ctcaatcatg tggctcgcga gcttggcagt tgtcatagct 60
tgtgcaggcg ccttccattt aaccacacgt aacggagaac cacacatgat cgtcagcaga 120
caagagaaag ggaaaagtct tctgtttaaa acagaggatg gcgtgaacat gtgtaccctc 180
atggccatgg accttggtga attgtgtgaa gacacaatca cgtacaagtg tccccttctc 240
aggcagaatg agccagaaga catagactgt tggtgcaact ctacgtccac gtgggtaact 300
tatgggacgt gtaccaccat gggagaacat agaagagaaa aaagatcagt ggcactcgtt 360
ccacatgtgg gaatgggact ggagacacga actgaaacat ggatgtcatc agaaggggcc 420
tggaaacatg tccagagaat tgaaacttgg atcttgagac atccaggctt caccatgatg 480
gcagcaatcc tggcatacac cataggaacg acacatttcc aaagagccct gattttcatc 540
ttactgacag ctgtcactcc ttcaatgaca atgcgttgca taggaatgtc acgtagagac 600
tttgtggaag gggtttcagg aggaagctgg gttgacatag tcttagaaca tgggagctgt 660
gtgacgacga tggcaaaaaa caaaccaaca ttggattttg aactgataaa aacagaagcc 720
aaacagcctg ccaccctaag gaagtactgt atagaggcaa agctaaccaa cacaacaaca 780
gaatctcgct gcccaacaca aggggaaccc agcctaaatg aagagcagga caaaaggttc 840
gtctgcaaac actccatggt agacagagga tggggaaatg gatgtggact atttggaaag 900
ggaggcattg tgacctgtgc tatgttcaga tgcaaaaaga acatggaagg aaaagttgtg 960
caaccagaaa acttggaata caccattgtg ataacacctc actcagggga agagcatgca 1020
gtcggaaatg acacaggaaa acatggcaag gaaatcaaaa taacaccaca gagttccatc 1080
acagaagcag aattgacagg ttatggcact gtcacaatgg agtgctctcc aagaacgggc 1140
ctcgacttca atgagatggt gttgttgcag atggaaaata aagcttggct ggtgcacagg 1200
caatggttcc tagacctgcc gttaccatgg ttgcccggag cggacacaca agggtcaaat 1260
tggatacaga aagagacatt ggtcactttc aaaaatcccc atgcgaagaa acaggatgtt 1320
gttgttttag gatcccaaga aggggccatg cacacagcac ttacaggggc cacagaaatc 1380
caaatgtcat caggaaactt actcttcaca ggacatctca agtgcaggct gagaatggac 1440
aagctacagc tcaaaggaat gtcatactct atgtgcacag gaaagtttaa agttgtgaag 1500
gaaatagcag aaacacaaca tggaacaata gttatcagag tgcaatatga aggggacggc 1560
tctccatgca agatcccttt tgagataatg gatttggaaa aaagacatgt cttaggtcgc 1620
ctgattacag tcaacccaat tgtgacagaa aaagatagcc cagtcaacat agaagcagaa 1680
cctccattcg gagacagcta catcatcata ggagtagagc cgggacaact gaagctcaac 1740
tggtttaaga aaggaagcac gctgggcaag gccttttcaa caactttgaa gggagctcaa 1800
agactggcag cgttgggcga cacagcctgg gactttggct ctattggagg ggtcttcaac 1860
tccataggaa aagccgttca ccaagtgttt ggtggtgcct tcagaacact ctttggggga 1920
atgtcttgga tcacacaagg gctaatgggt gccctactgc tctggatggg cgtcaacgca 1980
cgagaccgat caattgcttt ggccttctta gccacagggg gtgtgctcgt gttcttagcg 2040
accaatgtgc atgcttaa 2058
<210> 28
<211> 6
<212> 蛋白质
<213> 人工序列
<220>
<223> DB21-6和DB39-2的結合基序
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可为任何自然发生的氨基酸
<400> 28
Asn Arg Xaa Xaa Val Glu
1 5

Claims (15)

1.一种分离的突变登革病毒E蛋白，其在对应于序列为SEQ ID NO: 1的非突变的野生型登革病毒E蛋白的第8位置的天冬酰氨酸残基包含一个氨基酸残基取代，所述的一个氨基酸残基取代选自于由丙氨酸、精氨酸及谷氨酸残基所组成的群组的氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的突变登革病毒E蛋白，该第8位置的天冬酰氨酸残基被丙氨酸残基取代。
3.如权利要求1所述的突变登革病毒E蛋白，该第8位置的天冬酰氨酸残基被精氨酸残基取代。
4.一种编码如权利要求1-3中任一项所述的突变登革病毒E蛋白的分离的核酸序列。
5.一种表达如权利要求1-3中任一项所述的突变登革病毒E蛋白的质粒。
6.如权利要求5所述的质粒，所述的质粒包含：
(a) 分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO: 27的核苷酸序列；以及
(b) 与该分离的核酸序列可操作地连接的启动子。
7.一种表达病毒样颗粒的质粒，该病毒样颗粒包含如权利要求1-3中任一项所述的突变登革病毒E蛋白。
8.一种DNA疫苗，其包含：
（a）重组DNA，其包含编码权利要求1或2所述的突变登革病毒E蛋白的核苷酸序列和与该核苷酸序列可操作连接的启动子；以及
（b）金或钨，
其中该重组DNA与金或钨形成复合物。
9.一种DNA疫苗，包含：
(a) 重组DNA，其包含编码如权利要求3所述的突变登革病毒E蛋白的核苷酸序列和与该核苷酸序列可操作地连接的启动子；以及
(b) 金或钨，
其中该重组DNA和金或钨形成复合物。
10.包含抗体的免疫的人类血清，该抗体具有下列特征：
(a) 与野生型登革病毒E蛋白和如权利要求1-3中任一项所述的突变登革病毒E蛋白具有特异性结合亲和力；
(b) 具有抗登革病毒感染的中和与保护活性；
(c) 无登革病毒感染的抗体依赖性增强；
(d) 该抗体由所述的该突变登革病毒E蛋白所引起；以及
(e) 对于位于野生型登革病毒E蛋白的结构域I的登革病毒感染性增强的抗原表位天冬酰氨酸8不具有结合活性。
11.如权利要求10所述的免疫的血清或如权利要求1-3项中任一项所述的突变登革病毒E蛋白在制造用于在有此需要的个体体内引发中和与保护活性以抵抗一种或多种登革病毒血清型的药物的用途，和/或在制造用于在有此需要的个体体内中和登革病毒、减少、减轻登革病毒感染的抗体依赖性增强的药物的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中该药物用于在个体内减轻该抗体依赖性增强，该个体的血清样品显示对包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的分离的多肽有反应性。
13.如权利要求12所述的用途，其中该分离的多肽的长度小于15个氨基酸残基，且选自于由SEQ ID NOs: 2-12及14-26所组成的群组的氨基酸序列。
14.如权利要求1-3中任一项所述的突变登革病毒E蛋白在制备用于检测生物样品中的登革病毒抗体的存在的检测试剂的用途。
15.一种分离的多肽在制备用于检测生物样品中登革病毒感染性增强的抗体的存在的检测试剂的用途，其中该多肽的长度小于15个氨基酸残基，且选自于由SEQ ID NOs: 2-12及14-26所组成的群组的氨基酸序列。
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