TWI702227B - 用於增進對抗登革病毒之安全性及免疫力的替換抗原決定位疫苗 - Google Patents

用於增進對抗登革病毒之安全性及免疫力的替換抗原決定位疫苗 Download PDF

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Abstract

分離的突變登革病毒E蛋白變體被揭露。該變體包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：1具有至少80%的相似度，且在天冬醯胺酸8(N8)、精胺酸9(R9)、纈胺酸12(V12)及/或麩胺酸13(E13)的對應位置上具有一或多個胺基酸殘基取代基。該變體可包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：1具有至少90%的相似度且缺乏一包含在結構域I的SEQ ID NO：28胺基酸序列的感染性增強抗體結合模體。一種編碼該變體的分離的核酸序列、一種表現該變體的質體、一種表現一包含該變體的病毒樣顆粒的質體、一種DNA疫苗，以及一種檢測在一生物樣品中登革病毒存在的方法也被揭露。

Description

用於增進對抗登革病毒之安全性及免疫力的替換抗原決定位疫苗
本發明廣泛地與疫苗有關，更特定而言是與用於登革病毒的疫苗有關。
登革病毒(DENV)，一種全球性的疾病，被分為四種血清型(DENV1-4)。抗登革病毒的包膜蛋白(E)的交叉反應性及非中和抗體與細胞的Fcγ受體(FcγR)結合，並從而經由抗體依賴性增強(ADE)由異源血清型加劇病毒感染。增強的抗原決定位的鑑定與修飾可能減輕登革病毒感染的增強。
因此，登革病毒E蛋白的B細胞抗原決定位，其誘發交叉反應性及非中和抗體的鑑定可能對疫苗開發提供有價值的信息。目前尚無既安全又有效的抗登革病毒疫苗。因此，有需要鑑定並替換中和性很差且高度增強抗體所辨識的抗原決定位以改善登革疫苗。
在一個方面，本發明涉及一種分離的突變登革病毒E蛋白變體，包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：1具有至少80%的相似 度，且在天冬醯胺酸8(N8)、精胺酸9(R9)、纈胺酸12(V12)及/或麩胺酸13(E13)的對應位置上具有一或多個胺基酸殘基取代基。
在另一方面，本發明涉及一種分離的突變登革病毒E蛋白變體，其中該非突變的野生型登革病毒E蛋白包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列，該變體包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：1具有至少90%的相似度且缺乏一包含在結構域I的SEQ ID NO：28胺基酸序列的感染性增強抗體結合模體。
在本發明的一個具體實施例中，該變體包含選自下列所組成之群組中的一個或多個突變：(a)該第8天冬醯胺酸殘基的取代基；(b)該第9精胺酸殘基的取代基；(c)該第12纈胺酸殘基的取代基；以及(d)該第13麩胺酸殘基的取代基。
在本發明的一個具體實施例中，該突變登革病毒E蛋白變體具有在位置8被取代的天冬醯胺酸。例如，該變體具有取代，即以天冬醯胺酸取代丙胺酸、麩胺酸或精胺酸。
在另一方面，本發明涉及一種編碼如前述的突變登革病毒E蛋白變體的分離的核酸序列。
在另一方面，本發明涉及一種表現如前述的突變登革病毒E蛋白變體的質體。
在另一方面，本發明涉及一種表現病毒樣顆粒的質體，該病毒樣顆粒包含如前述的突變登革病毒E蛋白變體。
在本發明的一個具體實施例中，前述的質體包含(a)一種包 含SEQ ID NO：27的核苷酸序列的分離的核酸序列；以及(b)一種可操作地連接到該分離的核酸序列的啟動子。
在另一方面，本發明涉及一種DNA疫苗，包含：(a)一種重組DNA，包含編碼如前述的突變登革病毒E蛋白變體的核苷酸序列與一可操作地連接到該核苷酸序列的啟動子；以及(b)金或鎢，其中該重組DNA和金或鎢形成一複合物。
在另一方面，本發明涉及包含抗體的免疫的人類血清，該抗體具有下列特徵：(a)與野生型登革病毒E蛋白與如前述的突變登革病毒E蛋白變體具有特異性結合親和力；(b)具有抗登革病毒感染的中和與保護活性；(c)無登革病毒感染的抗體依賴性增強；(d)該抗體被突變登革病毒E蛋白變體所引起；以及(e)對於位於野生型登革病毒E蛋白的結構域I的登革病毒感染性增強的抗原決定位天冬醯胺酸8(Asn8)、精胺酸9(Arg9)、纈胺酸12(Val12)及/或麩胺酸13(Glu13)不具有結合活性。
在另一方面，本發明涉及前述的免疫的血清或前述的突變登革病毒E蛋白變體在製造一種用於在一有此需要的個體體內引發抗一或多種登革病毒血清型的中和與保護活性的藥物，及/或在製造一種用於中和一登革病毒、減少、減輕登革病毒感染的抗體依賴性增強的藥物，及/或增加一有此需要的個體的存活率的用途。
在本發明的一個具體實施例中，該藥物是用於在一個體體內減輕該抗體依賴性增強，該個體的血清樣品顯示對包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的分離的胜肽有反應性。
或者，本發明涉及前述的免疫的血清或前述的突變登革病毒E蛋白變體用於在一有此需要的個體體內引發抗一或多種登革病毒血清型的中和與保護活性，或用於中和一登革病毒、減少、減輕登革病毒感染的抗體依賴性增強，及/或增加一有此需要的個體的存活率的用途。
或者，本發明涉及在一有此需要的個體體內引發抗一或多種登革病毒血清型的中和與保護活性的方法，或中和一登革病毒、減少、減輕登革病毒感染的抗體依賴性增強，及/或增加一有此需要的個體的存活率的方法，包含對該有此需要的個體施予前述的免疫的血清或前述的突變登革病毒E蛋白變體。
在本發明的一個具體實施例中，前述的免疫的血清或突變登革病毒E蛋白變體是用於在一個體體內減輕該抗體依賴性增強，該個體的血清樣品顯示對包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的分離的胜肽有反應性。
在本發明的一個具體實施例中，該分離的胜肽的長度小於15個胺基酸殘基，且與選自於由SEQ ID NOs：2-12及14-26所組成的群組的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%的相似度。
此外，在另一方面，本發明涉及一種檢測在一生物樣品中登革病毒存在的方法，包含：(a)將該生物樣品與一包含如前述的突變登革病毒E蛋白變體或一含有SEQ ID NO：28的胺基酸序列的分離的胜肽的組合物接觸；(b)使在該生物樣品中的登革病毒抗體與該變體或胜肽形成一複合物；以及 (c)檢測該複合物中登革病毒抗體的存在。
然而，在另一方面，本發明涉及一種檢測在一生物樣品中登革病毒感染性增強的抗體的存在的方法，包含：(a)將該生物樣品與一包含一含有SEQ ID NO：28的胺基酸序列的分離的胜肽的組合物接觸；(b)使在該樣品中的登革病毒感染性增強的抗體與該胜肽形成一複合物；以及(c)檢測該複合物中感染性增強的抗體的存在。
該生物樣品可選自由下列所組成之群組：血液、血清、血漿、唾液、腦脊液，以及尿液。
這些與其他方面在結合以下附圖後將對以下描述的較佳具體實施例變得明顯。
附圖例示出了本發明的一個或多個具體實施例，並且與書面描述一起用於解釋本發明的原理。只要可能，相同的元件符號在整個附圖中用來指示一個具體實施例的相同或類似的元件。
圖1A-圖1B顯示由交叉反應性的單株抗體所介導的登革病毒感染的ADE。(A)在連續稀釋的單株抗體存在下，以登革病毒1(MOI=1)、登革病毒2(MOI=1)、登革病毒3(MOI=5)或登革病毒4(MOI=1)感染的K562細胞，在感染後72小時以4G2及RPE綴合的山羊抗小鼠IgG抗體染色並接著以流式細胞儀檢驗。顯示受感染的K562細胞的百分比。(B)所指示的單株抗 體進行連續稀釋，並在4℃下與登革病毒2(MOI=1或10)培養1小時。然後將混合物加入到THP-1細胞，並在感染後72小時以流式細胞儀檢驗受感染的細胞。受感染的細胞以hDB32-6及RPE綴合的山羊抗人類IgG抗體染色。顯示受感染的THP-1細胞的百分比。以NMIgG作為對照組。圖1A及圖1B中顯示的數據是來自三個獨立實驗的平均值±標準差(SEM)。
圖2A-圖2E顯示活體內ADE的特徵以及以DB21-6及DB39-2單株抗體與患者血清競爭。(A)AG129小鼠在第0天以1×105pfu的DENV2 S221進行靜脈注射感染，並在第-1天以及第1天以腹腔注射給予5μg的DB21-6(n=8)或同型對照組(n=5)。記錄存活率30天。(***P<0.001，相對於同型對照組)。(B)AG129小鼠在第0天以1×105pfu的DENV2 S221進行靜脈注射感染，並在第-1天以及第1天以腹腔注射給予5μg的DB39-2(n=7)或同型對照組(n=6)。記錄存活率30天。(**P<0.01，相對於同型對照組)。圖2A與圖2B中顯示的數據是來自二個獨立實驗中的一個代表性實驗。(C-D)使用定量RT-PCR在感染DENV2 S221後以DB21-6或DB39-2單株抗體處理的AG129小鼠血中測量病毒含量。在感染後第4及5天，病毒量顯著增加。顯示的數據為平均值±標準差。(**P<0.01，***P<0.001)(E)單株抗體與病人血清之間競爭與DENV2結合。(*P<0.05，***P<0.001，NS不顯著)。
圖3A-圖3B顯示以DB21-6和DB39-2單株抗體進行噬菌體呈現胜肽庫的篩選。(A)經過3輪生物淘選後，噬菌體力價分別增加12871倍(DB21-6)以及5000倍(DB39-2)。(B)以ELISA確認DB21-6和DB39-2所篩選出的免疫陽性噬菌體選殖株。以NMIgG作為陰性對照組。
圖4A-圖4D顯示DB21-6和DB39-2單株抗體的抗原決定位殘基確認。(A)以表現野生型(WT)或突變DENV2 E蛋白的載體轉染BHK-21細胞。2天後，將收集的細胞與單株抗體進行反應，然後以流式細胞儀分析。測定相對指數。取代N8、R9、V12，以及E13導致DB21-6的結合活性顯著減損。取代N8、R9以及E13導致DB39-2的結合活性顯著減損。以4G2作為對照組。顯示的數據是來自二個獨立實驗中的一個代表性實驗。(B)該模型是基於登革病毒DENV2 E蛋白模型(PDB：1OAN)，從結構底部顯示的位置。交叉反應性單株抗體的抗原決定位係位於EDI中的N8、R9、V12，以及E13殘基。(C)以PYMOLTM程式進行結構分析確定來自相同(陰影部分)或相鄰單體的抗原決定位殘基之間的距離(°A)。(D)以兔抗DENV2 E蛋白的血清多株抗體捕捉被分泌出來的病毒樣顆粒(VLP)。透過捕捉病毒樣顆粒的ELISA以DB32-6和4G2檢測野生型(WT)和突變的分泌病毒樣顆粒。顯示的數據是來自二個獨立實驗中的一個代表性實驗。
圖5A-圖5E顯示為免疫的血清與登革病毒DENV2的體外和活體內的中和分析。(A)在三週的間隔以載體、野生型(WT)，或N8R質體對小鼠進行免疫。在第3次免疫後，收集並合併血清樣品以用於每個組別。使用含有感染登革病毒DENV2 16681的C6/36細胞培養盤進行ELISA評估免疫血清。在490nm波長下測定吸光量(**P<0.01，NS不顯著)。(B)第3次免疫後，將個體合併的血清進行連續稀釋並在4℃下與登革病毒DENV2(MOI=1)共同培養1小時。然後將該混合物用於感染BHK-21細胞。3天後，以4G2對細胞染色，並以流式細胞儀進行分析。(n=3)(C)表格顯示對登革病毒DENV2 感染具有50%抑制率的力價。(D和E)第3次免疫後，將個體合併的血清進行連續稀釋並在4℃下與25倍半致死量(LD50)的登革病毒DENV2共同培養0.5小時。將混合物通過腦內途徑(i.c.)注射到ICR哺乳小鼠。記錄存活率28天。用來測試每種免疫血清的試驗動物數目介於每組4至16隻。(***P<0.001。**P<0.01，相對於免疫載體的血清)。圖5A、圖5B、圖5D和圖5E中顯示的數據是來自二個獨立實驗中的一個代表性實驗。
圖6A-圖6F顯示以免疫血清測試AG129小鼠，活體試驗死亡率的增強。(A)AG129小鼠在第0天以1×105pfu的登革病毒DENV2(S221)進行靜脈注射感染，並在第-1天以及第1天以腹腔注射給予以野生型(WT)(n=4)、N8R(n=4)，或載體(n=4)免疫的血清(1：25稀釋)。以野生型(WT)(P=0.3834)或N8R(P=0.1278)免疫血清處理小鼠的存活率，與以載體免疫血清處理小鼠的存活率沒有顯著差異。(B)AG129小鼠在第0天以1×105pfu的登革病毒DENV2(S221)進行靜脈注射感染，並在第-1天以及第1天以腹腔注射給予以野生型(WT)(n=5)、N8R(n=5)，或載體(n=7)免疫的血清(1：100稀釋)。以野生型(WT)(***P=0.0007)免疫血清處理小鼠的存活率，顯著地低於以載體免疫血清處理小鼠的存活率。然而，以N8R(P=0.3538)免疫血清處理小鼠的存活率，與以載體免疫血清處理小鼠的存活率沒有顯著差異。(C)AG129小鼠在第0天以1×105pfu的登革病毒DENV2(S221)進行靜脈注射感染，並在第-1天以及第1天以腹腔注射給予以野生型(WT)(n=7)、N8R(n=7)，或載體(n=6)免疫的血清(1：400稀釋)。以野生型(WT)(P=0.8701)或N8R(P=0.1587)免疫血清處理小鼠的存活率，與以載體免疫血清處理小鼠的存活 率沒有顯著差異。(D)示意圖描述了單株抗體和免疫血清的競爭分析。ELISA分析盤在4℃下與兔抗DENV免疫血清多株抗體進行塗覆整夜。在阻隔反應後，在室溫下加入稀釋的登革病毒DENV2病毒上清液反應2小時。將與HRP偶聯的增強型單株抗體(Innova Biosciences公司HRP偶聯試劑盒)以及免疫的血清(1：40稀釋)在室溫下培養2小時。清洗後，加入OPD溶液，並以3N鹽酸停止反應。在490nm波長下測定吸光值。(E-F)單株抗體與免疫的血清之間對與登革病毒DENV2結合的競爭。以正常小鼠血清(Normal mouse serum，NMS)作為對照組。競爭的百分比計算如下：競爭作用(%)=[1-(免疫血清與單株抗體的混合物的吸光值/正常小鼠血清與單株抗體混合物的吸光值)]×100。(***P<0.001)
圖7A-圖7C顯示透過免疫螢光分析法(immunofluorescence assay，IFA)分析DB21-6和DB39-2抗登革病毒DENV以及登革病毒DENV2的E蛋白的特徵。(A)以登革病毒DENV1(MOI=1)、DENV2(MOI=1)、DENV3(MOI=10)，或DENV4(MOI=1)感染BHK-21細胞。2天後，使用DB21-6和DB39-2偵測被感染的細胞。以未被感染的細胞(對照組)和NMIgG作為陰性對照組。其結果以400倍放大倍數顯示。(B和C)DENV2 E，包含E蛋白的第1-400個胺基酸，被選殖到pcDNA3.1質體內。DENV2 EDI-II(第1-295個胺基酸)和EDIII(第295-400個胺基酸)也被分別選殖到pcDNA3.1質體內。轉染後，以IFA來顯示DB21-6和DB39-2識別表現DENV2 E(B)或EDI-II(C)蛋白質的BHK-21細胞。
圖8A-圖8B顯示單株抗體抗登革病毒DENV1-4的中和活性 評估。(A)DB21-6、DB39-2，或4G2抗登革病毒DENV1-4的中和活性與抑制作用分析。登革病毒DENV1(MOI=5)、登革病毒DENV2(MOI=1)、登革病毒DENV3(MOI=5)，或登革病毒DENV4(MOI=1)與單株抗體在4℃下培養1小時，然後用於感染BHK-21細胞。3天後，將細胞固定並以4G2染色。抗體力價表示為抑制百分比。顯示的數據是來自二個獨立實驗中的一個代表性實驗。(B)DB21-6、DB39-2和4G2對登革病毒DENV1-4的50%抑制濃度的摘要。
圖9A-圖9B顯示在K562(A)和THP-1(B)細胞中，登革病毒DENV2 S221感染，由單株抗體產生ADE的體外測試。登革病毒DENV2 S221與單株抗體的稀釋液在4℃下培養1小時，並將得到的混合物用於感染K562或THP-1細胞。3天後，將細胞以4G2染色，並以流式細胞儀進行分析。
圖10A-圖10B顯示使用單株抗體和患者血清的競爭分析法。稀釋倍數為1：50(A)或1：200(B)的單株抗體和患者血清之間競爭與登革病毒DENV2結合。
圖11A-圖11D顯示以ELISA評估抗登革病毒DENV2的體液免疫反應。(A)在三週的間隔以載體對照組、野生型(WT)，或N8R質體對小鼠進行免疫。在第一、二、三次免疫後，收集並合併血清樣品。使用含有感染DENV2 16681的C6/36細胞培養盤評估血清。(B)收集的血清被稀釋為1：200，並以抗IgG1或IgG2a抗體偵測。(C)IgG1/IgG2a的比值。(D)在第三次免疫後收集並檢測免疫的血清(***P<0.001)。
圖12A-圖12B顯示感染不同登革病毒DENV2病毒株的中和 作用。(A)分別在1、1、1或10的MOI條件下以登革病毒DENV2病毒株16681、PL046、馬來西亞07587，或NGC在37℃下感染BHK-21細胞2小時。3天後，將細胞固定，以4G2和RPE綴合的山羊抗小鼠IgG染色。以流式細胞儀分析受感染細胞的百分比。以BHK-21細胞作為陰性對照組(對照組)。PE表示藻紅蛋白。FSC表示前向散射。(B)分別在1、1、1或10的MOI條件下，將第3次免疫合併的血清的連續稀釋液與登革病毒DENV2病毒株16681、PL046、馬來西亞07587，或NGC在4℃下培養1小時。然後將得到的混合物用於感染BHK-21細胞。3天後，將細胞以4G2染色，並以流式細胞儀分析。
圖13顯示一個N8R質體的載體圖譜。CMV：巨細胞病毒啟動子。JEV SS：日本腦炎病毒(JEV)的信號胜肽序列。JEV-E：日本腦炎病毒的套膜(E)蛋白序列。SEQ ID NO：27的核苷酸序列包含JEV SS和prM(第1-570個核苷酸)、N8R(第571-1755個核苷酸)，和JEV-E(第1756-2058個核苷酸)的區域。
本發明更具體地由以下的實施例所描述，這些實施例意僅為說明性的，因為對本領域技術人員而言，許多修改和變化將是顯而易見的。本發明的各種具體實施例現在將被詳細地描述。參照附圖，相同的數字表示相似的觀點組件。如在本文的描述和整個隨後的權利要求，「一」、「一個」以及「該」的含義包括複數引用，除非上下文另有明確說明。此外，如在本文的描述和整個隨後的權利要求所用的「中」的含義包括「中」和「上」，除非上下文另有明確說明。此外，為了便於讀者閱讀，在本說明書中可能 使用標題或副標題，其係對本發明的範圍沒有影響。此外，在本說明書中使用的一些術語被更特定地定義如下。
定義
在本說明書中使用的術語通常具有在本領域中普通的含義，在本發明的範圍內，並在使用各術語的特定上下文中。用來描述本發明的某些術語將在下面討論，或者在說明書的其他地方中，以提供關於本發明的描述的從業者進一步的指導。為了方便起見，某些術語可被突出顯示，例如使用斜體字及/或引號。使用突出顯示對術語的範圍和含義沒有影響；在同樣的情況下，不論一個術語是否被突出顯示，其範圍和含義是一樣的。應該理解的是，同樣的東西可以一個以上的方式敘述。因此，替代語言和同義詞可用於本文中所討論的任一個或一個以上的術語中，不論一個術語是否在本文中被闡述或討論，並無任何特殊的意義。提供了某些術語的同義詞。列舉一個或多個同義詞並不排除使用其它同義詞。在本說明書中任何地方使用到的實施例，包括在本文所討論的任何術語的示例都僅是說明性的，而決不是限制本發明或任何示例性術語的範圍和含義。同樣地，本發明並不限定於在本說明書中給出的各種具體實施例。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有如本發明所屬技術領域中普通技術人員之一通常所理解的相同含義。在衝突的情況下，以本文件，包括定義，為準。
如本文所用，「左右」、「大約」或「近似」一般應在20%之內的意思，優選在10%之內，更優選地在給定值或範圍的5%之內。本文所 給出的數值的數量是近似的，這意味著，如果沒有明確說明，可以推斷出術語「左右」、「大約」或「近似」。
術語「處理」或「治療」是指以治癒、減輕、解除、補救、改善，或防止一疾病、其症狀，或往該疾病的傾向，或減輕症狀發生率的目的，施用一有效量的治療劑至需要其的個體，該個體帶有該疾病，或朝向該疾病的症狀或傾向。這樣的個體可由醫護專業人士基於來自任何合適的診斷方法的結果來鑑定。
「一有效量」是指被要求賦予經治療的個體一治療效果的活性化合物的量。有效劑量會有所不同，如本領域的技術人員所知，這取決於施予途徑、賦形劑的使用，以及共同使用其他治療性處理的可能性。
由美國衛生與人類服務部食品及藥物管理局所發行的「給工業與審視者評估在成人健康志願者體內進行以治療為目的的臨床試驗的安全起始劑量指南」揭露「人類等效劑量」可透過計算下列公式來獲得：HED=動物劑量(mg/kg)×(動物體重(公斤)/人體重(公斤))0.33。
如本文所用，當一個數字或一個範圍被敘述時，在本領域的普通技術人員理解，該數字或範圍旨在包括一個針對本發明有關的特定領域的適當合理範圍。
用於標記抗體的檢測試劑或標記試劑已揭露於美國專利號碼US 8,920,804中，其係透過引用而將其整體併入本文中。
野生型登革病毒DENV2(16681)的E蛋白(GenBank登錄號：AAB58782)的第1-395個胺基酸序列示於SEQ ID NO：1。
縮寫：病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)；登革熱(dengue fever，DF)；登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)；E蛋白結構域I(E protein domain I，EDI)；抗體依賴性增強(antibody-dependent enhancement，ADE)；麩胺酸(Glu；E)；纈胺酸(Val；V)；；天冬醯胺酸(Asn；N)；精胺酸(Arg；R)；膜前(prM)；套膜(E)蛋白；感染劑量(multiplicity of infection，MOI)。
我們描述了抗登革病毒結構域I-II的單株抗體(mAbs)DB21-6和DB39-2的交叉反應特性；這些抗體具有很差的中和能力，且在體外和活體內皆強力地增強登革病毒的感染。兩個增強的單株抗體，DB21-6和DB39-2，被觀察到與來自感染登革熱患者血清中的抗體競爭。對這些增強的單株抗體的抗原決定位進行鑑定。N8、R9、V12，和E13是DB21-6的反應性殘基，而N8、R9，和E13是DB39-2的反應性殘基。N8取代傾向於保持VLP的分泌，並降低DB21-6和DB39-2的結合活性。來自N8取代(N8R)DNA疫苗的免疫血清，在體外和活體內皆發揮比野生型(WT)免疫血清更大的中和及保護活性。以N8R免疫血清治療降低在AG129小鼠中提高的死亡率。這些結果支持以增強的抗原決定位識別及取代作為開發安全性登革疫苗的新穎策略。
實施例
以下提供根據本發明的具體實施例的示例性儀器、裝置、方法及其相關的結果。
材料和方法
登革病毒、細胞株，以及單株抗體
四種登革病毒血清型，DENV1夏威夷、DENV2 16681、DENV3 H87，以及DENV4 H241，如Wu等人所述之方式(2003年)製備。(「Identification of a dengue virus type 2(DEN-2)serotype-specific B-cell epitope and detection of DEN-2-immunized animal serum samples using an epitope-based peptide antigen」J Gen Virol 84,2771-2779)。C6/36細胞在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)與100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素，以及0.25μg/ml兩性黴素B的50% Mitsumashi和Maramorsch昆蟲培養基(SIGMA-ALDRICH®公司)加上50% Dulbecco氏改良的Eagle培養基(DMEM)中生長。將登革病毒以0.1-1的感染劑量(MOI)感染C6/36細胞，並在28℃下培養7-9天。自上清液收集病毒，並以噬菌斑測定法在幼倉鼠腎成纖維細胞株(BHK-21)中測定病毒力價。等分試樣保存在-80℃。BHK-21細胞以補充10% FBS、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素，以及0.25μg/ml兩性黴素B的基本必需培養基(MEM)培養。人類紅白血病K562與單核球細胞THP-1細胞以含有10% FBS的RPMI培養基中培養。小鼠單株抗體，包括DB21-6和DB39-2，以登革病毒DENV2免疫BALB/c小鼠，並於融合瘤細胞中生產而預先製備((Li等人(2012年)「Development of a Humanized Antibody with High Therapeutic Potential against Dengue Virus Type 2」PLoS Negl Trop Dis 6,e1636))。DB21-6和DB39-2被確認為IgG1，並使用蛋白G瓊脂(SEPHAROSETM)4B凝膠(奇異醫療公司)純化。
具有單株抗體的抗體成賴性增強(ADE)的體外測量
將單株抗體的連續稀釋液與登革病毒DENV1夏威夷株 (MOI=1)、DENV2 16681(MOI=1)、DENV3 H87(MOI=5)，以及DENV4 H241(MOI=1)在4℃下一起培養1小時。該混合物用於在37℃下感染K562細胞2小時。清洗後，將細胞以2% FBS的RPMI培養基在37℃下培養3天。收集感染的細胞並以3.7%甲醛在4℃下固定10分鐘。為了染色，將細胞以含有0.1%皂苷(Sigma公司)及2% FBS的PBS中透化，接著在4℃下以4μg/ml 4G2染色0.5小時。清洗細胞，並以R-藻紅蛋白(R-phycoerythrin，RPE)偶聯的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)在4℃下培養1小時。清洗細胞，並以流式細胞儀確認感染細胞的百分比。針對THP-1細胞的感染，將登革病毒DENV2 16681(MOI=1或10)與稀釋的單株抗體在4℃下培養1小時，然後在37℃下與細胞一起培養2小時。3天後，將細胞固定、透化，並以hDB32-6染色。清洗後，將細胞以RPE綴合的山羊抗人IgG培養，並隨後以流式細胞儀分析。
在AG129小鼠內具有單株抗體的抗體依賴性增強(ADE)的活體內測量
干擾素第I型和第II型受體缺陷小鼠(AG129小鼠；5至6週齡)購自B&K Universal公司。在第1天與第-1天給予AG129小鼠在200μl PBS內的5μg單株抗體(腹腔注射)。以小鼠IgG1同型抗體作為陰性對照組。在第0天，以在100μl PBS內的1×105pfu適應小鼠的登革病毒DENV2 S221(獲自於S.Shresta)接種小鼠(靜脈注射)。記錄AG129小鼠的存活率30天。
以定量RT-PCR測量病毒血症
AG129小鼠在第0天感染1×105pfu的登革病毒DENV2 S221 (靜脈注射)，並在第-1天和第1天以腹腔注射以5μg單株抗體處理。使用QIAAMP®病毒RNA迷你套組(Qiagen公司)自合併的受感染的小鼠血清中萃取病毒RNA。使用LIGHTCYCLER® 480系統(ROCHETM公司)進行定量RT-PCR。以登革病毒DENV2 S221(濃度為101至107pfu/ml)製作標準曲線。病毒血症的測量以pfu當量/ml表示，這是基於根據針對登革病毒DENV2 S221的標準曲線的閾值循環值數(Ct)所計算。
單株抗體和患者血清樣品的競爭ELISA
共有21個受登革病毒DENV2感染的患者血清樣品，在台灣於2002年至2003年間爆發期間，收集自11個DF和10個DHF患者。登革病毒感染的診斷係依據IgM抗體捕獲ELISA(MAC-ELISA)、反轉錄酶PCR(RT-PCR)，或在細胞培養物中的病毒分離。這些血清樣品是在從症狀發作後第4天至第22天之間所收集的；這種血清含有抗登革抗體。根據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)於2009年發行的標準判斷所有的患者具有典型的DF或DHF。表2顯示納入本研究的患者血清樣品的特徵。進行競爭性ELISA。簡言之，在4℃下以多株兔抗DENV超免疫血清塗佈培養盤整夜。阻隔作用之後，在室溫(R.T.)下加入稀釋的DENV2病毒上清液(1×106pfu)2小時。稀釋的單株抗體和患者血清(1：100倍稀釋)在室溫下培養2小時。清洗後，在室溫下加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)綴合的抗小鼠IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)1小時。然後加入過氧化物酶基質鄰苯二胺二鹽酸(o-phenylenediamine dihydrochloride，OPD，SIGMA-ALDRICHTM公司)，並以3N HCl中止反應。 在490nm波長下測量吸光值(OD)。以正常人類血清(Normal human serum，NHS)作為對照組。競爭作用的百分比計算如下：競爭作用(%)=[1-(患者血清-單株抗體混合物的吸光值/正常人類血清(NHS)-單株抗體混合物的吸光值)]×100。
噬菌體展示生物淘選
進行噬菌體展示生物淘選。簡言之，在4℃下將培養盤以100μg/ml單株抗體塗佈6小時。清洗和阻隔作用後，在室溫下培養4×1010pfu的噬菌體展示胜肽庫(New England BioLabs公司)50分鐘。清洗後，結合的噬菌體以100μl 0.2M甘胺酸/鹽酸(pH 2.2)流洗，並用15μl 1M Tris/鹽酸(pH 9.1)中和。然後將流洗的噬菌體在ER2738中擴增，以用於後續幾輪的篩選。在含有IPTG和X-Gal的LB平板培養基上測定噬菌體的數量。除了加入2×1011pfu的擴增噬菌體之外，第二輪和第三輪的篩選與第一輪一樣。
以ELISA鑑定免疫陽性的噬菌體選殖株
將培養盤塗佈了50μg/ml單株抗體。在清洗與阻隔作用後，加入擴增的噬菌體，並於室溫下培養1小時。清洗後，加入稀釋的與HRP偶聯的抗M13抗體(奇異醫療公司)，並在室溫下培養1小時。該培養盤與抗體作用且隨後以3N HCl終止反應。在波長490nm下測定吸光值(OD)。
使用以流式細胞儀為基礎的結合分析對表現野生型(WT)和突變DENV2 prM/E蛋白的細胞進行抗原決定位的鑑定
表現登革病毒DENV2的prM-E蛋白的pCBD2-2J-2-9-1質體已經在先前被確定特徵並描述(Chang等人，(2003年)「Enhancing biosynthesis and secretion of premembrane and envelope proteins by the chimeric plasmid of dengue virus type 2 and Japanese encephalitis virus」Virology 306,170-180)。進行定點誘變以替換每個所選擇的胺基酸殘基。誘變後，將質體進行定序，以確保在非目標位點上不存在任何進一步的突變。使用POLYJETTM體外DNA轉染試劑(SignaGen Laboratories公司)以表現野生型(WT)或突變DENV2 E蛋白的構築轉染BHK-21細胞。2天後，將細胞固定，並以在含有0.1%皂苷(SIGMATM公司)的PBS中的2%FBS進行穿透作用。針對染色，將細胞與DB21-6、DB39-2、4G2，以及混合的單株抗體(DB32-6、3H5，以及DB25-2)分別以1、1、1和1μg/ml的濃度在4℃下培養0.5小時。清洗後，將細胞與RPE綴合的山羊抗小鼠IgG抗體培養，並以流式細胞儀進行分析。使用下式測定一單株抗體對突變的E蛋白的相對指數：[突變的E蛋白的強度/野生型E蛋白的強度(以單株抗體辨識)]/[突變的E蛋白的強度/野生型E蛋白的強度(以混合的單株抗體辨識)]。
通過捕獲ELISA檢測分泌的病毒樣顆粒
以表現登革病毒DENV2的野生型(WT)或突變的E蛋白的載體轉染BHK-21細胞，如上所述。在轉染後48小時，收集培養物上清液。將培養盤在4℃下進行塗覆多株兔抗DENV超免疫血清整夜。阻隔後，分別加入含有野生型或突變的病毒樣顆粒(VLP)的二倍稀釋上清液，在室溫下作用2小時。各孔接著以稀釋的DB32-6與4G2在室溫下培養2小時。清洗後，加入以1：2000倍稀釋的HRP綴合的抗小鼠IgG抗體，並在室溫下作用1小時。最後，將該培養盤進行呈色，且隨後以3N鹽酸終止該反應。在490nm波長 下測量吸光值。
免疫用的質體的製備
將表現登革病毒DENV2野生型E蛋白(SEQ ID NO：1)或N8殘基被R取代(N8R)的突變E蛋白的質體用於免疫反應(圖13)。針對塗層，將25毫克的1.0μm金粉再懸浮於50mM亞精胺。然後，加入50μg質體DNA，隨後加入1M CaCl2；將溶液混合並在室溫下沉澱10分鐘。以離心收集後，將金-DNA複合物以無水乙醇清洗並重新懸浮於0.1mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)(360kDa)溶液中。將漿液注入一TefzelR管(MCMASTER-CARRTM，芝加哥，伊利諾州)，然後塗覆。待乙醇揮發後，將管切成0.5英寸的子彈並儲存於-20℃。在每顆子彈中的金帶有1μg DNA。在使用前，子彈被裝入Helios基因槍裝置(Bio-Rad公司，赫拉克勒斯，加州)，用於遞送質體。
小鼠的免疫
以設定為400磅/平方英寸(lb/inch2)的氦氣壓力的基因槍注入6週齡的雌性BALB/c小鼠的腹腔表皮。每隻小鼠以施打4顆含有1μg質體DNA的子彈進行免疫。小鼠在0、3，和6週進行免疫。在免疫前以及第三次免疫(免疫前、第1次、第2次、第3次免疫血清)後3週收集血清樣品。每組取五至六隻小鼠的血清樣品合併並進行ELISA評估、中和測定，以及抗體依賴性增強(ADE)的活體內測量。
以ELISA進行免疫血清抗登革病毒DENV2的評估
以感染登革病毒DENV2 16681的C6/36細胞作為抗原。C6/36 細胞接種到96孔ELISA盤的各孔中(2×104細胞/孔)。一天後，加入2×103pfu的登革病毒DENV2 16681(MOI=0.1)以在37℃下感染細胞2小時。以PBS清洗ELISA盤上的孔，然後在28℃下於2% FBS培養基中培養5天。被感染的細胞以1：1的甲醇/丙酮在4℃下固定10分鐘。以5%脫脂奶粉在4℃下對該ELISA盤進行阻隔作用24小時。然後加入稀釋的免疫血清在室溫下培養2小時。將ELISA盤以含有0.1%(重量/體積)TWEEN® 20的磷酸緩衝鹽水(PBST0.1)清洗三次，隨後以HRP-綴合的抗小鼠IgG抗體培養。最後，將ELISA盤進行呈色，並以3N鹽酸終止反應。在波長490nm處測定吸光值。
以免疫血清進行體外和活體內中和測定
登革病毒DENV2 16681(MOI=1)與第3次免疫的血清在4℃下培養1小時。在37℃下以混合物感染BHK-21細胞2小時。3天後，將細胞固定、透化，並以4μg/ml 4G2染色。清洗後，將細胞與RPE綴合的山羊抗小鼠IgG抗體培養，並以流式細胞儀進行分析。抑制百分比(%)=[1-(與免疫血清一起培養的感染細胞百分比/未與免疫血清一起培養的感染細胞百分比)]×100。
ICR小鼠購自國立台灣大學醫學院實驗動物中心。連續稀釋的免疫血清與1×104pfu(25倍致死劑量，25倍LD50)登革病毒DENV2 16681在4℃下培養0.5小時。二日齡的乳鼠以顱內注射(intracranial，i.c.)方式接種20μl的混合物。攻毒後，記錄存活率28天。
免疫血清的活體內抗體依賴性增強(ADE)的研究
在第-1天及第1天給予(腹腔注射)AG129小鼠免疫血清的稀 釋液，在第0天接種(靜脈注射)1×105pfu的登革病毒DENV2 S221。記錄存活率30天。
統計分析
使用Kaplan-Meier生存曲線表示存活率，並使用GraphPad Prism5進行統計分析。針對單株抗體和患者血清的競爭測定分析，以Student’s t檢測法來確定顯著差異和計算的P值(*P<0.05，***P<0.001，NS表示不顯著)。針對評估以ELISA測量抗登革病毒DENV2的免疫的血清，以two-way ANOVA與Bonferroni事後檢驗來確定顯著差異和計算P值(**P<0.01，NS表示不顯著)。根據從個體合併的免疫血清的抑制百分比，以GRAPHPAD PRISM®5分析針對登革病毒DENV2的50%抑制效價。
結果
DB21-6和DB39-2的交叉反應對抗登革病毒的特徵
圖7A顯示單株抗體DB21-6和DB39-2能辨識感染登革病毒1-4的細胞。這些單株抗體也分別能辨識表現DENV2 E和EDI-II蛋白的轉染BHK-21細胞(圖7B和圖7C)。因此，DB21-6和DB39-2的交叉反應能辨識登革病毒1-4以及在E蛋白上的結構域I-II。
為了評估這些單株抗體的體外中和活性，我們以各別的單株抗體與登革病毒1-4的混合物感染BHK-21細胞。圖8A-圖8B顯示，4G2，一種在一定濃度下具有中和及增強活性的抗黃病毒抗體，針對抗DENV2的部份，比DB21-6和DB39-2發揮更高的中和活性。圖8B的表格顯示抗登革病毒1-4的單株抗體的50%抑制濃度摘要，表明DB21-6和DB39-2表現出針對登革 病毒1-4的非中和活性(50%抑制濃度>33μg/ml)。
DB21-6和DB39-2的增強活性
為了在體外研究透過抗體依賴性增強(ADE)登革病毒感染的增強，我們進行體外抗體依賴性增強(ADE)分析，並以流式細胞儀檢測登革病毒感染細胞百分比的增加。該帶有FcγRIIA的K562細胞，其不表現第1型干擾素(interferon，IFN)，被用來檢測透過抗體依賴性增強(ADE)而增強感染細胞。該連續稀釋的單株抗體與登革病毒1-4一起培養，然後用來感染K562細胞。以流式細胞儀檢測感染百分比。圖1A示出了在大範圍的單株抗體濃度產生感染的增強。4G2在較低的抗體濃度下造成在K562細胞中登革病毒1-4感染的增加。DB21-6和DB39-2在高抗體濃度下增強在K562細胞中登革病毒1-4的感染。
為了進一步證實增強感染，我們檢視了在帶有FcγRI和FcγRIIA的THP-1細胞內透過DB21-6和DB39-2增強登革病毒DENV2 16681的感染。在THP-1細胞中，透過DB21-6和DB39-2增強感染的程度比透過4G2增強的程度大(圖1B)。
登革病毒DENV2 S221以前被用來研究在AG129小鼠中透過抗體依賴性增強(ADE)提高死亡率。為了評估透過單株抗體使登革病毒DENV2 S221感染增強，我們使用K562細胞和THP-1細胞進行抗體依賴性增強(ADE)分析。針對登革病毒DENV1-4的感染，高濃度的DB21-6和DB39-2增強了K562細胞中登革病毒DENV2 S221的感染(圖9A)。DB21-6和DB39-2在抗體的高濃度下增強DENV2 S221在THP-1細胞中的感染(圖9B)。這些結 果表明，DB21-6和DB39-2可以提高在體外登革病毒DENV2 S221感染。
我們證實在AG129小鼠體內增強的活性。與對照組感染小鼠相比，以5μg DB21-6處理且以DENV2 S221感染的AG129小鼠顯現出死亡率增加(圖2A)。以5μg DB39-2處理的AG129小鼠也顯現出增高的死亡率(圖2B)。為了確定在感染登革病毒DENV2 S221後以DB21-6或DB39-2處理AG129小鼠中的病毒血症，以定量RT-PCR測定病毒RNA的量。結果表明，與同型對照抗體處理組相比，在以DB21-6或DB39-2處理受感染的AG129小鼠後，病毒量顯著地增加(圖2C-圖2D)。結果表明，DB21-6和DB39-2具有非中和活性，而在AG129小鼠體內提高死亡率。
單株抗體和感染患者血清的競爭分析
我們進行了競爭分析以確定從登革患者血清中的抗體是否與登革病毒DENV2結合的單株抗體競爭。表2示出了患者血清樣品的特性。結果表明，從被感染患者血清中的抗體會與DB21-6和DB39-2競爭。圖2E顯示，來自DHF患者血清樣品的DB21-6和DB39-2的競爭比例顯著高於來自DF患者的，而無論從DF或DHF患者而來的血清與中和DB32-6的競爭比例則相似。以較濃的(1：50稀釋)或稀釋的(1：200稀釋)的血清進行相同的實驗，得到類似的結果(圖10A-圖10B)。結果表明，從DHF患者得到的血清樣品含有較高濃度的抗體，其係與DB21-6和DB39-2單株抗體競爭。
DB21-6和DB39-2的增強抗原決定位鑑定
為了確定DB21-6和DB39-2的增強抗原決定位，我們使用了噬菌體展示胜肽庫來篩選反應的噬菌體選殖株。經過三輪生物淘選之後， 與第一輪的噬菌體力價相比，分別增加到12871倍(DB21-6)和5000倍(DB39-2)(圖3A)。隨機地選擇來自第三輪生物淘選的個別噬菌體選殖株。如ELISA所示，大部分篩選的噬菌體選殖株顯現出對單株抗體顯著的反應性，但對正常小鼠IgG抗體(NMIgG)則不具該反應性。在30個選定的噬菌體選殖株中，29個選殖株與DB21-6反應(圖3B)。擴增免疫陽性的噬菌體選殖株，並分離它們的噬菌體DNA以進行DNA定序。表1示出了具有識別的個體胜肽序列的11個噬菌體選殖株。同樣地，在47個選定的噬菌體選殖株中，46個與DB39-2反應(圖3B)。46個與DB39-2反應的免疫陽性噬菌體選殖株中的13個擁有個別的胜肽序列。胜肽序列的比對顯示DB21-6和DB39-2的結合模體為N-R-x-x-V-E(SEQ ID NO：28)。胜肽序列的模型與抗原決定位伺服器預測E蛋白的抗原決定位殘基為N8、R9、V12，以及E13。
為了進一步驗證DB21-6和DB39-2的抗原決定位，我們使用pCBD2-2J-2-9-1作為模板進行噬菌體展示的抗原決定位的位點定向誘變。通過定序確認變體之後，我們以突變質體轉染細胞，並以流式細胞儀檢測結合活性。將每個轉染細胞用抗EDIII的單株抗體(DB32-6、3H5，和DB25-2)的結合百分比進行正常化，並計算相對指數且如圖4A所示。4G2，其係與在EDII的融合環上的殘基結合，被作為對照組，以驗證由突變引起的E蛋白結構變化。基於相對指數，我們發現，在N8、R9、V12，和E13上的突變阻止由DB21-6的結合。以同樣的方法來識別DB39-2的抗原決定位殘基為N8、R9，和E13。應用結構模型以顯示識別的殘基都位於E蛋白的結構域I(圖4B)。使用結構模型程式分析來自同樣的單體的這些殘基之間的距離，並被 發現小於30°A(圖4C)。這個距離可以被單個IgG分子所跨越。這表示，N8、R9、V12，和E13殘基構成DB21-6的抗原決定位，且N8、R9，和E13殘基構成DB39-2的抗原決定位。比對顯示，DB21-6和DB39-2的結合基序對應於N8、R9、V12，和E13殘基，其在登革病毒DENV1-4中是保守的序列(表3和4)。最後，我們使用VLP-捕獲ELISA來證明在R9、V12，和E13突變影響登革病毒DENV2的VLP分泌(圖4D)。這些突變對分泌VLP的能力影響可能是因為E蛋白結構的變化所造成。然而，N8R取代並未影響DENV2 VLP的分泌(圖4D)。N8取代趨於保持VLP的分泌和降低DB21-6和DB39-2的結合活性。
小鼠體液免疫反應的檢驗
在第0、3，和6週時，以載體、野生型，或N8R質體免疫BALB/c小鼠。經過三次免疫，收集血清樣品且將每組血清樣品合併。以ELISA檢測該免疫血清。圖11A顯示在免疫後觀察到抗DENV2的抗體反應顯著增加。抗DENV2的第三次野生型和N8R免疫的血清表現出比載體免疫血清具有顯著較高的吸光值(圖5A)。分析以抗IgG1和IgG2a抗體免疫的血清顯示，該IgG1/IgG2a的比值在第二和第三次免疫之間增加(圖11B和圖11C)。在15週後，免疫小鼠仍保持其抗DENV2的反應(圖11D)。
免疫血清的中和活性評估
將該免疫血清用於評估對登革病毒DENV2的中和活性。野生型與N8R免疫的血清皆表現出高的中和活性，而載體免疫的血清則沒有(圖5B)。N8R免疫的血清比以野生型免疫的血清更能有效率的中和登革病毒 DENV2的感染(圖5C)。為了進一步評估免疫血清是否能廣泛地中和多種DENV2病毒株，以免疫血清混合四種不同的DENV2病毒株：16681、NGC、PL046，和馬來西亞07587株感染BHK-21細胞。值得注意的是，圖12A-圖12B表明，野生型和N8R免疫血清展現出抗多種類型登革病毒DENV2的病毒株具高中和活性。
檢查活體內免疫血清對抗DENV2 16681的保護作用。以稀釋1：100與1：200的野生型免疫血清處理的小鼠存活率，顯著高於以稀釋1：100的載體免疫血清處理的小鼠存活率(圖5D)，而以稀釋1：100、1：200及1：400的N8R免疫血清處理的小鼠存活率，則顯著高於以稀釋1：100的載體免疫血清處理小鼠存活率(圖5E)。以野生型免疫血清處理者，在1：200的稀釋濃度下提供50%的保護率，而以N8R免疫血清處理者，在1：400的稀釋濃度下提供50%的保護率(圖5D和圖5E)。因此，N8R免疫血清在體外和活體內具有比野生型免疫血清更高的中和和保護活性。
該免疫血清在活體內增強活性的測試
為了研究活體內增強的死亡率，我們將不同稀釋濃度的野生型、N8R，或載體免疫的血清施打到AG129小鼠活體內。接著以登革病毒DENV2 S221感染後，野生型或N8R免疫血清(1：25稀釋)處理的小鼠存活率，高於以載體免疫血清處理的小鼠存活率(圖6A)。圖6B顯示，以1：100稀釋濃度野生型免疫血清處理的小鼠，表現比載體免疫血清處理的小鼠更高的死亡率。以1：100稀釋濃度N8R免疫血清處理的小鼠存活率，高於以載體免疫血清處理的小鼠存活率。以N8R免疫血清處理的小鼠則未觀察到死亡率 增高。以1：400稀釋的野生型或N8R免疫血清處理則對小鼠不具有保護或增強死亡的效果。這些結果表明，E蛋白的N8R取代可以減少在活體內死亡率增強的效果。
為了進一步了解這些增強抗體在免疫血清中產生的特徵，我們以免疫血清進行了競爭性ELISA以抑制HRP偶聯的DB21-6或DB39-2單株抗體的結合(圖6D)。HRP偶聯的DB21-6和DB39-2的競爭比例，在野生型免疫血清中顯著高於那些在N8R免疫血清中的競爭比例(圖6E-圖6F)。這些結果表明，N8R取代可透過減少增強抗體的生成而重定向免疫優勢。
我們描述了DB21-6和DB39-2增加登革病毒感染細胞百分比的能力特徵。這些單株抗體增強AG129小鼠的死亡率。從感染患者血清中的抗體會與這些單株抗體競爭結合位置。我們將增強單株抗體DB21-6和DB39-2的抗原決定位確認位置在EDI蛋白上。為了研究如何降低增強作用，同時保持中和活性，我們取代了E蛋白的N8殘基，用基因槍遞送系統對小鼠免疫野生型或N8R質體。經過三次免疫後，N8R免疫血清產生對DENV2的中和活性，而且與野生型免疫血清相比，降低了增強的死亡率。因此，增強的抗原決定位殘基的取代可以增加抵抗病毒感染的免疫反應，同時降低了抗體依賴性增強(ADE)的可能性。
我們證明了對EDI-II交叉反應的DB21-6和DB39-2對登革病毒1-4具有不佳的中和活性(圖8A-圖8B)。DB21-6和DB39-2在體外具有強的抗體依賴性增強(ADE)活性(圖1)。4G2具有抗登革病毒1-4部分中和活性(圖8A-圖8B)以及在低抗體濃度下增強了體外病毒感染(圖1A)。DB21-6和 DB39-2在高濃度下增強了DENV1-4在K562細胞中的感染(圖1A)。在THP-1細胞中，由DB21-6和DB39-2增加DENV2的感染，比由4G2增加的程度大很多(圖1B)。DB21-6和DB39-2增強了在AG129小鼠中的死亡率(圖2A和圖2B)以及增加在受感染小鼠的血清中的病毒載量(圖2C-圖2D)。這些結果表明，DB21-6和DB39-2在體外和活體內具有強烈的增強活性。
抗體依賴性增強(ADE)被視為導致嚴重登革熱疾病，包括DHF/DSS發展的重要機制。交叉反應性以及非中和抗體可以透過抗體依賴性增強(ADE)提高帶有FcγR細胞的感染，從而提高病毒載量及/或產生細胞激素。高病毒載量與登革熱疾病的嚴重程度和DHF相關。因此，有必要能夠確認在登革患者血清中增強抗體的存在。我們的結果表明，DB21-6和DB39-2的競爭比例在DHF病患血清中顯著高於在DF病患血清中的比例(圖2E)，這表明在登革患者的血清樣品中有較高量的增強抗體，DB21-6和DB39-2，與嚴重的登革疾病有關。我們推測當增強抗體的表現程度是較高的時候，這種登革病毒感染的患者可能遭受更嚴重的症狀，如DHF。
使用DB21-6和DB39-2單株抗體篩選的噬菌體選殖株展現出包含一共有模體的胜肽序列，N-R-x-x-V-E(表1)。這些展示的胜肽序列可以適用於檢測登革患者血清樣品中的增強抗體，以及用於提供有關登革熱發病機制的資訊。透過展示的胜肽序列和結構模體比對，預測候選的抗原決定位並使用VLP突變體證實(圖3和圖4)。增強的單株抗體DB21-6的抗原決定位殘基為在DENV2 E蛋白的結構域I的N8、R9、V12，和E13(圖4A和圖4B)，而增強的單株抗體DB39-2的抗原決定位殘基為在DENV2 E蛋白的結構域I 的N8、R9，和E13。該N8、R9、V12，和E13殘基在登革病毒1-4是保守的序列。因此，交叉反應的DB21-6和DB39-2可與DENV1-4結合。先前的報告指出，G106和L107是單株抗體4G2的抗原決定位殘基。圖4A中的數據確認在融合環中的W101、G106、L107，以及F108是4G2的抗原決定位殘基。由4G2辨識的抗原決定位的殘基與那些由DB21-6和DB39-2辨識者不同。DB21-6(N8、R9、V12，和E13)以及DB39-2(N8、R9，和E13)的增強的抗原決定位是新穎且以前未被報告過的。
N8R取代並不影響DENV2 VLP的分泌(圖4D)。野生型和N8R免疫的血清均對DENV2具有保護活性。相較於野生型免疫的血清，N8R-免疫的血清具有較高的體外中和活性以及活體內保護活性(圖5B-圖5E)。這些結果表明接種N8R DNA疫苗可能會增加對DENV2的中和與保護性免疫力。
我們使用稀釋的載體、野生型或N8R免疫血清，然後以登革病毒DENV2 S221對AG129小鼠進行攻毒。相對於載體免疫血清，野生型和N8R免疫血清在1：25稀釋倍數下具有保護力。相較於以載體免疫的血清，以野生型免疫的血清在1：100稀釋倍數下增加了小鼠的死亡率。以N8R免疫的血清在1：100稀釋倍數下並未增加小鼠的死亡率(圖6B)。當稀釋至1：400時，沒有觀察到死亡率增加(圖6C)。我們的結果表明，取代增強抗原決定位可減少抗體依賴性增強(ADE)現象以及增加活體內的保護活性。
在免疫小鼠中，增強抗原決定位的取代以及中和抗原決定位的保全可提供保護性免疫力。這種方法將重定向免疫優勢(圖6E-圖6F)和透 過滿足佔用中和所需位以提高免疫原性。總之，我們已經確定了新的增強抗原決定位，並透過在DENV2 E蛋白中N8R的取代，說明了一種使我們能夠減少潛在抗體依賴性增強(ADE)的有用方式。這可能適用於開發可增加抗DENV免疫反應的全新登革疫苗。
表1示出了由DB21-6和DB39-2篩選的噬菌體展示胜肽序列的比對。表2示出所用的DENV2感染患者的血清樣品。表3示出登革病毒DENV1、2、3，和4的EDI-II蛋白質的胺基酸序列比較。表4示出了數據庫、基因/蛋白質以及登錄/識別號。
Figure 105103497-A0305-02-0034-1
 b登革病毒DENV1-4的E蛋白中第8至13個胺基酸序列係由GenBank檢索得到(登錄號AIU47321、AAB58782、AAA99437，以及AAX48017)。
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Figure 105103497-A0305-02-0037-4
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我們發現，交叉反應性的單株抗體DB21-6和DB39-2表現出不佳的中和活性以及增強登革病毒感染的能力。我們確認被DB21-6和DB39-2識別的抗原決定位。為了進一步改善抗登革病毒DENV2的DNA疫 苗，在說明的例子中，我們在一個用於免疫作用的質體中，以精胺酸取代野生型(WT)DENV2 E蛋白的N8殘基(N8R)。N8R免疫的血清產生比野生型免疫的血清更高的中和與保護活性。相較於以野生型免疫血清處理的小鼠，以N8R免疫血清處理AG129小鼠，減少了抗體依賴性增強(ADE)現象以及死亡率。總之，我們已經確定在E蛋白中一種新穎的交叉反應和增強感染性的抗原決定位，並證明了取代該增強的抗原決定位是一種可發展安全登革疫苗的策略。
在本說明書中所有引用的參考文獻和討論皆透過引用的方式將其整體併入本文，且如同每個參考文獻被單獨地通過引用併入的相同程度。
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<223> DB39-31
<400> 20
Figure 105103497-A0305-02-0046-27
<210> 21
<211> 12
<212> 蛋白質
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-34
<400> 21
Figure 105103497-A0305-02-0046-28
Figure 105103497-A0305-02-0047-29
<210> 22
<211> 12
<212> 蛋白質
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-36
<400> 22
Figure 105103497-A0305-02-0047-30
<210> 23
<211> 12
<212> 蛋白質
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-47
<400> 23
Figure 105103497-A0305-02-0047-31
<210> 24
<211> 12
<212> 蛋白質
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-4
<400> 24
Figure 105103497-A0305-02-0047-32
<210> 25
<211> 12
<212> 蛋白質
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-43
<400> 25
Figure 105103497-A0305-02-0047-33
<210> 26
<211> 12
<212> 蛋白質
<213> 人工序列
<220>
<223> DB39-1
<400> 26
Figure 105103497-A0305-02-0048-34
<210> 27
<211> 2058
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼N8R突變的DNA序列
<400> 27
Figure 105103497-A0305-02-0048-35
Figure 105103497-A0305-02-0049-36
<210> 28
<211> 6
<212> 蛋白質
<213> 人工序列
<220>
<223> DB21-6和DB39-2的結合模體
<220>
<221> misc_特徵
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可為任何自然發生的胺基酸
<400> 28
Figure 105103497-A0305-02-0049-37

Claims (12)

  1. 一種分離的突變登革病毒E蛋白變體，包含一登革病毒E蛋白胺基酸序列，該胺基酸序列係在對應於SEQ ID NO：1的天冬醯胺酸8(Asn8)的位置上以其他胺基酸殘基取代。
  2. 如請求項1的變體，其中該天冬醯胺酸8(Asn8)的位置係由精胺酸(Arg)殘基取代。
  3. 一種分離的核酸序列，其係編碼如請求項1或2的突變登革病毒E蛋白變體。
  4. 一種質體，其係表現如請求項1或2的突變登革病毒E蛋白變體。
  5. 一種表現病毒樣顆粒的質體，其中該病毒樣顆粒包含如請求項1或2的突變登革病毒E蛋白變體。
  6. 如請求項5的質體，包含：(a)一包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列的分離的核酸序列；以及(b)一種可操作地連接到該分離的核酸序列的啟動子。
  7. 一種DNA疫苗，包含：(a)一重組DNA，其包含編碼如請求項1或2的突變登革病毒E蛋白變體的核苷酸序列與一可操作地連接到該核苷酸序列的啟動子；以及(b)金或鎢，其中該重組DNA和金或鎢形成一複合物。
  8. 一種抗體或包含該抗體的血清，其中該抗體具有下列特徵：(a)與野生型登革病毒E蛋白以及如請求項2的突變登革病毒E蛋白變體具有特異性結合親和力；(b)具有抗登革病毒感染的中和與保護活性；(c)無登革病毒感染的抗體依賴性增強；(d)該抗體被突變登革病毒E蛋白變體所引起；以及(e)對於位於野生型登革病毒E蛋白的結構域I的登革病毒感染性增強的抗原決定位天冬醯胺酸8(Asn8)不具有結合活性。
  9. 一種如請求項8的抗體或包含該抗體的血清或如請求項2的突變登革病毒E蛋白變體在製造藥物的用途，該藥物係用於在有此需要的個體體內引發對抗一或多種登革病毒血清型的中和與保護活性，及/或用於中和登革病毒、減少、減輕登革病毒感染的抗體依賴性增強，及/或增加有此需要的個體的存活率。
  10. 如請求項9的用途，其中該藥物係用於在個體體內減輕該抗體依賴性增強，該個體的血清樣品顯示對包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列且長度小於15個胺基酸殘基的分離的胜肽有反應性。
  11. 如請求項10的用途，其中該分離的胜肽係選自於由SEQ ID NOs：2-12及14-26所組成的群組的胺基酸序列。
  12. 一種檢測在一生物樣品中登革病毒存在的方法，包含：(a)將該生物樣品與一組合物接觸，該組合物包含如請求項2的突 變登革病毒E蛋白變體；(b)使在該生物樣品中的登革病毒抗體與該變體形成一複合物；以及(c)檢測該複合物中登革病毒抗體的存在。
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