CN107404922B - 乳基蛋白质水解物及由其制备的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于制备乳蛋白质水解物的方法，该方法包括用微生物碱性丝氨酸蛋白酶联合菠萝蛋白酶、来自曲霉(Aspergillus)的蛋白酶和来自芽孢杆菌(Bacillus)的蛋白酶水解乳基蛋白质材料。
Description
技术领域
本发明涉及包含乳基蛋白质水解物的组合物，所述乳基蛋白质水解物使用来自微生物来源和植物来源的酶。该组合物可掺入到婴儿配方食品和食品补充剂中。
本发明避免使用来源于猪的酶，从而提供具有清真性的组合物。
背景技术
人类母乳和母乳喂养代表婴儿营养方面无可争议的黄金标准。用作人类母乳的替代物或补充物的婴儿配方食品应满足婴儿的营养要求，具有可接受的味道，并且当以处于变态反应和/或食物耐受不良风险的婴儿为目标时，还应为低变应原性的。
已知对牛乳及含有牛乳蛋白质的婴儿配方食品的变态反应是由于这样的事实：牛乳的蛋白质不同于母乳的蛋白质，并且可构成人类的变应原。主要公认的牛乳变应原是α-乳白蛋白(aLA)、β-乳球蛋白(bLG)和牛血清白蛋白(BSA)。
牛乳清蛋白和/或酪蛋白通常用作婴儿配方食品中的乳蛋白质源。
为了减弱变应原性，牛乳蛋白质经酶水解，因此被还原为肽。必须小心监测用于产生这些水解物的水解方法，使得最终产物保留其营养价值和所需的物理特性，但是为低变应原性的。
水解物可被表征为“部分水解物”或“深度水解物”，具体取决于水解反应进行的程度。根据针对牛乳蛋白质变态反应(CMA)的WAO(世界变态反应组织(World AllergyOrganization))指南，目前对深度水解产物(EHP)没有一致的法律/临床定义，但是存在共识：已证明，对于患有牛乳变态反应(CMA)的婴儿，水解制剂是有用的且广泛使用的蛋白质来源。深度水解物可被定义为其中至少95％的蛋白质/肽群具有小于1000道尔顿的分子量，而部分水解物可被定义为其中60％的蛋白质/肽群具有小于1000道尔顿的分子量。这些定义目前在本行业中使用。
欧洲儿科变态反应与临床免疫学会(European Society for PaediatricAllergy and Clinical Immunology,ESPACI)和欧洲儿科胃肠病学、肝脏病学和营养学会(European Society for Paediatric Gastroenterology,Hepatology,and Nutrition,ESPGHAN)均强调，由于深度水解配方食品已被证实具有安全性和低变应原性，应当将其用于IgE介导的CMA(Businco et al.Pediatr Allergy Immunol 1993,4:101-111(Businco等人，《儿科变态反应和免疫学杂志》，1993年，第4卷，第101-111页)；
et al.Arch DisChild 1999,81:80-84(
等人，《儿童疾病档案》，1999年，第81卷，第80-84页)；American Academy of Pediatrics,Pediatrics 1989,83:1068-1069(美国儿科学会，《儿科学》，1989年，第83卷，第1068-1069页))。
为优化水解方法，许多组进行了研究。水解反应条件，包括温度和反应器体积、水解循环数、所选的蛋白质底物、酶的类型和浓度，是影响水解反应并因此影响最终产物的物理、化学以及最终生物学特性的许多因素中的一些。
猪类酶，尤其是猪胰酶常用于水解方法。例如，在EP0353122中，使用特定比例的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物制备低变应原性的乳清蛋白水解物。WO9304593A1和US5039532A也公开了使用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的水解方法，该水解方法包括两步水解反应，在其间具有热变性步骤以确保最终水解物基本上不含完整的变应原蛋白质。这些方法中使用的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶是由猪胰腺提取物产生的制剂。
市场上存在许多用动物酶制备的含蛋白质水解物的产品。例如，雀巢HA(R)(Nestle HA(R))婴儿配方食品可用使用从动物胰腺提取的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶产生的水解物来制备。此外，深度水解产物
和
也可使用猪胰酶来制备。
本领域需要含有使用非猪类酶制备的蛋白质水解物的产品。有利地，此类产品可具有清真性。但是，基于非猪类酶的水解物应具有与从猪类酶获得的水解物基本上对应的肽谱，并且应当保持低变应原特性。虽然这是一个相当大的挑战，但是特别重要，因为市场上任何新的婴儿配方食品都要遵守严格的监管指南，例如欧盟指令2006/141/EC适用。
本发明解决了对含有使用非猪类酶制备的蛋白质水解物的产品的需求。
发明内容
发明人实施了大量的研究计划，以尝试鉴定出非猪类酶作为用于进行水解反应的潜在候选物。特别地，本发明人鉴定出了可替代用于制备市售水解产品特别是
和
的猪类酶的酶组合。
本发明人监测了包括水解反应性能和肽分子量分布在内的参数，并且确定了向水解物提供所需物理、化学和生物学特性的酶混合物。
本文公开的乳蛋白质水解物可高效地和可再现地生产，具有所需的营养价值，且是低变应原性的。
根据本发明的第一方面，提供了用于制备乳蛋白质水解物的方法，该方法包括用微生物碱性丝氨酸蛋白酶、菠萝蛋白酶、来自曲霉(Aspergillus)的蛋白酶和来自芽孢杆菌(Bacillus)的蛋白酶水解乳基蛋白质材料。
优选地，该方法包括用微生物碱性丝氨酸蛋白酶、菠萝蛋白酶、来自曲霉的两种蛋白酶和来自芽孢杆菌的蛋白酶水解乳基蛋白质材料。
优选地，该微生物碱性丝氨酸蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶，优选地为枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。
在一个实施方案中，碱性丝氨酸蛋白酶源自芽孢杆菌，优选地源自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。用于本发明的碱性丝氨酸蛋白酶的一个示例是AlcalaseTM。
优选地，来自曲霉的两种蛋白酶是亮氨酸氨肽酶和曲霉胃蛋白酶1(aspergillopepsin 1)。
优选地，来自曲霉的蛋白酶来自米曲霉(Aspergillus oryzae)。
优选地，来自芽孢杆菌的蛋白酶来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
优选地，来自芽孢杆菌的蛋白酶是枯草芽孢杆菌中性蛋白酶。
优选地，该方法包括：
(i)第一水解步骤，包括用微生物碱性丝氨酸蛋白酶水解乳基蛋白质材料；以及
(ii)第二水解步骤，包括用菠萝蛋白酶联合曲霉蛋白酶和芽孢杆菌蛋白酶水解乳蛋白。
该乳基蛋白质材料可以是例如乳清蛋白、酪蛋白或两者的混合物。优选地，该乳基蛋白质材料为乳清蛋白。
优选地，该水解物进一步经受酶失活、微滤和超滤。
在一个特别优选的实施方案中，该蛋白质水解物为深度水解产物，其中水解程度(非蛋白氮/总氮比例，NPN/TN％)大于95％，优选地大于99％。
本发明在提供存在于配方食品(诸如旨在用于喂食对牛乳表现出变态反应的婴儿及儿童的那些)中的“深度”蛋白质水解物方面特别有用。此类水解物优选地针对已被牛乳蛋白致敏的患病(过敏)婴儿及儿童。
因此，根据本发明的另一方面，提供了包含通过本发明的方法获得的乳基蛋白质水解物的组合物。该组合物可以是例如婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、婴孩食物配方食品、儿童食品补充剂或成人营养组合物。
在一个优选的实施方案中，所述组合物是婴儿配方食品，优选地是低变应原性的婴儿配方食品。
本发明还提供可用于婴儿、儿童或成人产品的蛋白质水解物、组合物及其制备方法，这些蛋白质水解物、组合物及其制备方法的目标在于提供除与变态反应有关的益处以外的其他益处，诸如促进消化；增强氨基酸、肽和蛋白质的吸收和代谢；促进疾病康复；以及优化氮源的利用。
根据本发明的另一方面，提供了菠萝蛋白酶在制备包含乳基蛋白质材料水解物的组合物中的用途。
优选地，菠萝蛋白酶的使用与微生物碱性丝氨酸蛋白酶和来自本文提及的曲霉属和芽孢杆属菌物种的蛋白酶的使用相结合。
根据本发明的另一方面，提供了根据本发明的方法获得的乳蛋白质水解物在制备婴儿配方食品中的用途。
根据本发明的另一方面，提供了本文所定义的用于减少或预防食物耐受不良、牛乳蛋白质变态反应(CMA)、慢性腹泻和吸收不良的组合物。
根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的该组合物用于减少或预防食物耐受不良、牛乳蛋白质变态反应(CMA)、慢性腹泻和吸收不良的用途。
根据本发明的另一方面，提供了向个体施用本发明的组合物的方法，其中该个体具有食物耐受不良、牛乳蛋白质变态反应(CMA)、慢性腹泻和吸收不良。
附图说明
图1：示出了在两个不同试验(左条为第1试验，右条为第2试验)中测定的使用根据本发明的酶组合的UF渗透物的氨基酸谱。
具体实施方式
本发明的乳基蛋白质水解物通过用本文提及的蛋白酶处理乳基蛋白质材料溶液来获得。
乳基蛋白质材料
乳基蛋白质水解物优选地为乳基蛋白质材料。其可以是基于乳清的蛋白质材料、酪蛋白或基于乳清的蛋白质材料和酪蛋白的混合物。
酪蛋白源可以是酸性酪蛋白或非脂乳固形物。
优选地，乳基蛋白质材料是基于乳清的。
基于乳清的蛋白质材料可以是来自奶酪制作的乳清，尤其是诸如经凝乳酶凝结酪蛋白产生的甜乳清、经酸或酸化发酵剂凝结酪蛋白产生的酸性乳清，或甚至经酸和凝乳酶凝结产生的混合乳清。这种原料可以是已通过离子交换和/或电渗析进行脱矿质化的乳清，被称作脱矿质化的乳清蛋白(DWP)。
此类基于乳清的蛋白质材料的来源可以是完全或部分去除了酪蛋白糖巨肽(CGMP)的甜乳清。这种被称作改性甜乳清(MSW)。将CGMP从甜乳清中去除使得蛋白质材料中的苏氨酸和色氨酸含量更接近其在人乳中的含量。用于从甜乳清中去除CGMP的方法在EP880902中有所描述。原料可以是DWP和MSW的混合物。其可以是浓缩物(WPC)，其中乳清蛋白为35％至80％蛋白质，或者，如果乳清蛋白浓度大于95％蛋白质，则其可以是分离物(WPI)。WPC的一个示例为购自丹麦爱氏晨曦公司(Aria Foods,Denmark)的WPC 87 Lacprodan(R)，WPI的一个示例为购自戴维斯柯食品国际公司(Davisco Foods International)(美国明尼苏达州(Minnesota USA))的Bipro(R)。
优选地，乳基蛋白质材料为乳清蛋白分离物(WPI)。
乳基蛋白质材料可在溶液或悬浮液中，并且可例如以按蛋白质材料重量计2％至30％、更优选地5％至20％、更优选地6％至10％的浓度存在。在一个实施方案中，乳基蛋白质材料以约6％的浓度存在。
向用于水解的原料中添加乳糖的优点在于：包含在该乳糖中的任何残留蛋白质均被水解。乳糖可以0.05至30％w/w、优选地0.10至20％w/w的浓度存在，或者在优选较低乳糖含量的情况下，以0.10％至1％、优选地0.10至0.20％(w/w)的浓度存在。在后一种情况下，最终产物可专用于具有低乳糖耐受性的个体。乳糖可例如通过超滤(产生UF乳清)，任选地随后进行透析来除去。在一个实施方案中，乳糖以约2％的浓度存在。
原料可以是真水溶液或胶态水溶液的形式，或者粉末形式。在后一种情况下，粉末优选地溶于去离子水中以形成水溶液。
用于水解的酶
微生物碱性丝氨酸蛋白酶
微生物碱性丝氨酸蛋白酶优选地源自芽孢杆菌属物种，更优选地源自地衣芽孢杆菌。
在一个优选的实施方案中，碱性丝氨酸蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶。
枯草杆菌蛋白酶的示例为源自芽孢杆菌的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。示例在WO98/0201 15、WO 01/44452、WO 01/58275、WO 01/58276、WO 03/006602和WO 04/099401中有所描述。
碱性丝氨酸蛋白酶的一个示例为枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶Uniprot P00780或其变体。
在一个特别优选的实施方案中，用于本发明的碱性丝氨酸蛋白酶为AlcalaseTM。
菠萝蛋白酶
术语‘菠萝蛋白酶’是本领域众所周知的。菠萝蛋白酶可指源自凤梨科成员的提取物，其包括各种硫醇蛋白酶，并且已知在体外和体内具有蛋白水解活性。
优选地，该提取物源自菠萝(Ananas comosus)的茎。该提取物可包含诸如半胱氨酸蛋白酶、淀粉酶、酸性磷酸酶、过氧化物酶和纤维素酶之类的组分。
该酶可具有以下EC编号：EC 3.4.22.32。
菠萝蛋白酶可包括：“茎菠萝蛋白酶”(UniProt P14518)或其变体。
曲霉蛋白酶
亮氨酸氨肽酶
优选地，本发明使用曲霉亮氨酸氨肽酶。更优选地，本发明使用米曲霉亮氨酸氨肽酶。
该酶可具有以下EC编号：EC 3.4.11.1。
亮氨酸氨肽酶优选地催化肽的N-末端残基水解，优选地催化亮氨酸残基水解。
由米曲霉表达的亮氨酸氨肽酶酶的示例包括LAPA(UniProt Q2U1F3)、LAP1(UniProt Q2PIT3)和LAP2(UniProt Q2ULM2)。
曲霉胃蛋白酶1
优选地，本发明使用源自曲霉属物种的曲霉胃蛋白酶1。更优选地，本发明使用米曲霉曲霉胃蛋白酶1。本领域常用的曲霉胃蛋白酶1的其他名称包括(尤其是)曲霉胃蛋白酶A、曲霉胃蛋白酶F和曲霉菌肽酶A(Aspergillopeptidase A)。
该酶可具有以下EC编号：EC 3.4.23.18。
曲霉胃蛋白酶1酶优选地催化具有宽谱特异性的多肽水解，优选地催化疏水残基之间的肽键水解。
芽孢杆菌蛋白酶
本发明的方法优选地使用来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶。本发明的方法优选地使用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶。本领域常用的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的其他名称包括(尤其是)芽孢杆菌溶素(bacillolysin)、芽孢杆菌金属内肽酶、巨大芽孢杆菌肽酶(megateriopeptidase)、芽孢杆菌中性蛋白酶和芽孢杆菌细胞外中性金属蛋白酶。
优选地，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶来自枯草芽孢杆菌。
芽孢杆菌蛋白酶可具有以下EC编号：3.4.24.28。
芽孢杆菌蛋白酶的一个示例为NPRE(UniProt P68763)或其变体。
水解方法
用于进行水解方法的典型条件在现有技术中已有描述。温度可在约40℃至60℃的范围内(例如约55℃)。反应时间可为例如1至10小时，并且在开始水解之前的pH值可例如在6.5至8.5、优选地7.0至8.0的范围内。
pH可用已知的试剂(例如Ca(OH)2)来调节。
在一个实施方案中，该方法包括：
(i)第一水解步骤，包括用微生物碱性丝氨酸蛋白酶水解乳基蛋白质材料；以及
(ii)第二水解步骤，包括用菠萝蛋白酶联合来自曲霉的蛋白酶和来自芽孢杆菌的蛋白酶水解乳蛋白。
步骤(i)可进行例如约四小时，步骤(ii)可进行例如约六小时。
不管如何进行水解，都要对水解产物进行热处理，使进行水解的酶失活。这种热处理优选地包括预热水解物至75℃或以上(例如75℃至90℃)并将其在该温度下保持约0.1至30分钟以促进酶的自身消化。该处理之后可进行灭菌，优选地通过注射蒸汽或在热交换器中于超高温(例如在125℃至135℃)下灭菌30秒至3分钟。
可对由此得到的水解物进行澄清、微滤和/或超滤，以除去残留的蛋白质大片段。也可例如通过反渗透进行浓缩。然后可例如针对不同的应用通过冻干法、喷雾干燥或冷冻干燥进行干燥，或者甚至可进行后续处理。在后一种情况下，酶可在后续处理过程中失活。
本发明的水解物可具有以NPN/TN％含量表征的水解程度。NPN/TN％比例意指非蛋白氮除以总氮×100。非蛋白氮是蛋白质经酸沉淀后得到的氮级分。NPN/TN％可如Adler-Nissen J-,1979,J.Agric.Food Chem.,27(6),1256-1262(Adler-Nissen J-，1979年，《农业与食品化学杂志》，第27卷，第6期，第1256-1262页)中所详述的那样进行测定。
或者，水解程度可通过水解时释放的氨基氮的量来表征；游离氨基氮可与试剂诸如三硝基苯磺酸(TNBS)反应。
一般来讲，深度水解物的特征在于具有大于95％的NPN/TN％，而部分水解的水解物的特征在于具有在75％至85％范围内的NPN/TN％。在一个优选的实施方案中，本发明的水解物为具有在大于95％、96％、97％、98％或99％的范围内的NPN/TN％的深度水解物。
这些水解物的特征还可在于其至少95％的蛋白质/肽群具有<1000道尔顿的分子量。
所得的蛋白质水解物中肽的分子量分布可例如通过体积排阻色谱法(SEC)测定。在一个优选的实施方案中，本发明的水解物具有类似于或基本等同于
的肽重量分布的肽重量分布。优选地，本发明的水解物具有类似于或基本等同于用猪胰酶代替本文提及的菠萝蛋白酶和曲霉蛋白酶及芽孢杆菌蛋白酶(尤其是代替菠萝蛋白酶、来自米曲霉的亮氨酸氨肽酶、来自米曲霉的曲霉胃蛋白酶1以及枯草芽孢杆菌中性蛋白酶)制得的水解物的肽重量分布的肽重量分布。换句话说，在本发明的上下文中，菠萝蛋白酶和曲霉蛋白酶及芽孢杆菌蛋白酶的共混物表现出与猪胰酶基本相同的水解活性。
在一个优选的实施方案中，本发明的水解物为深度水解物，并且由具有300Da至370Da、优选地320Da至360Da的中值分子量的肽组成。
可使用标准免疫测定法诸如ELISA检测评估水解物残留的抗原性。优选地，本发明的水解物呈现<0.1mg BLG当量/g蛋白质当量的残留β-乳球蛋白(BLG)，并且最优选地为<0.01mg BLG当量/g蛋白质。
可将本发明的水解物，连同蛋白质水解物可为人类提供的任何其他益处，一起掺入到婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、婴孩食物、婴儿谷物、成长乳、婴幼儿或儿童食品补充剂或者成人营养组合物，即所有治疗变态反应的制剂中。优选地，水解物用于1段婴儿配方食品。
由此类牛乳蛋白质水解物构成的旨在预防变态反应的当前低变应原性配方食品还包含其他营养物质，诸如动物油、植物油、淀粉、麦芽糖糊精、乳糖和蔗糖。
在本发明的一个实施方案中，本发明的水解物与所选益生菌联合使用，例如用于婴儿配方食品。所选益生菌可以是常规用于婴儿配方食品的益生菌中的任一种。优选地，益生菌是能够对变态反应提供额外或协同效应的益生菌。
可用于本发明的合适益生微生物的示例包括：酵母，诸如酵母属(Saccharomyces)、德巴利酵母属(Debaromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)和球拟酵母属(Torulopsis)；霉菌，例如曲霉属(曲霉)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)和青霉菌属(Penicillium)以及球拟酵母属(Torulopsis)；以及细菌，例如双歧杆菌属、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、消化链球菌属(Peptostrepococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、微球菌属(Micrococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)、气球菌属(Aerococcus)、酒球菌属(Oenococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)。合适的益生微生物的具体示例为：酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、消化乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus caseisubsp.casei)、干酪乳酸杆菌代田株(Lactobacillus casei Shirota)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbruckiisubsp.lactis)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus(Lactobacillus GG))、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、变异微球菌(Micrococcus varians)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)。
优选的益生细菌菌株包括：可以商标LGG购自芬兰维利奥公司(Valio Oy)的鼠李糖乳杆菌ATCC 53103，鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.3724，副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)CNCM 1-2116，尤其由丹麦汉森集团公司(Christian Hansen company)以商标Bb 12销售的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)CNCM 1-3446，以及由日本森永乳业株式会社(Morigana Milk Industry Co.Ltd.)以商标BB536销售的长双歧杆菌ATCC BAA-999。
益生菌在每g组合物或每mL组合物中的量可例如为103至1012cfu，更优选地为106至1011cfu，甚至更优选地为104至109cfu，最优选地为107至109cfu。
本领域的技术人员将理解，在不脱离本文所公开的本发明范围的前提下，他们可以自由地组合本文所述的本发明的所有特征。
现将通过非限制性实施例来描述本发明的各优选特征和实施方案。
除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围之类。此类技术在文献中有所阐述。参见例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition,Books 1-3,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第二版，第1-3册，冷泉港实验室出版社)；Ausubel,F.M.et al.(1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology,ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,NewYork,N.Y.)(Ausubel,F.M.等人，1995年和定期增补；《分子生物学实验指南》，第9、13和16章，纽约州纽约约翰·威利父子公司)；B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn,1996,DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons(B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn，1996年，《DNA分离和测序：基本技术》，约翰·威利父子公司)；J.M.Polak and James O’D.McGee,1990,In Situ Hybridization:Principles andPractice；Oxford University Press(J.M.Polak和James O’D.McGee，1990年，《原位杂交：原理和实践》，牛津大学出版社)；M.J.Gait(Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach,Irl Press(M.J.Gait编，1984年，《寡核苷酸合成：实用方法》，Irl出版社)；D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA StructurePart A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,AcademicPress(D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992年，《酶学方法：DNA结构A部分：DNA合成及物理分析》，《酶学方法》，学术出版社)；以及E.M.Shevach and W.Strober,1992 and periodicsupplements,Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York,NY(E.M.Shevach和W.Strober，1992年和定期增补，《免疫学实验指南》，纽约州纽约约翰·威利父子公司)。这些一般性文本中的每一个以引用的方式并入本文。
实施例
改良
和
是旨在用于具有食物变态反应和耐受不良的婴儿的深度水解婴儿配方食品。
Alfaré和Althéra在制造过程中利用的是猪胰酶制剂。
植物和微生物蛋白酶的预混物意外地被确定为EHP生产中替代胰酶的合适替代物，并同时保持了水解产物特别是深度水解产物(EHP)的生物和生理特性。具体地讲，菠萝蛋白酶、微生物碱性丝氨酸蛋白酶、来自曲霉的蛋白酶和来自芽孢杆菌的蛋白酶的组合的使用已被确定为胰酶的合适替代物。
本发明人已建立用于制备乳蛋白质水解物的方法，该方法包括用上述试剂水解乳基蛋白质材料。
实施例1—方法
用
菠萝蛋白酶、来自米曲霉的亮氨酸氨肽酶、来自米曲霉的曲霉胃蛋白酶1和来自枯草芽孢杆菌的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶水解500kg Bipro(分离乳清蛋白)。
酶失活通过加热处理(90℃下加热5分钟)来实现，并且通过微滤和超滤去除所有残留的完整蛋白质和大肽。
实施例2—水解程度
NPN/TN％
水解程度使用非蛋白氮和总氮之间的比例(NPN/TN％)来测定。非蛋白氮级分通过蛋白质的酸沉淀获得。蛋白质水解后，产生的肽将归入“非蛋白氮”部分。因此，NPN/TN含量随水解程度的增大而增加。目标为在水解物中NPN/TN>＝95％，过滤后NPN/TN>＝99％。
SDS-PAGE
水解程度也采用快速凝胶电泳系统和银染通过SDS-PAGE电泳测定，以鉴定水解物中和过滤后任何残留的完整蛋白质和大肽(高于10kDa)。在样品变性(用SDS和加热处理)、还原(用DTT处理以还原二硫键)和酰化(加入碘乙酰胺以封阻硫醇基团)后，用聚丙烯酰胺凝胶分离样品中存在的总蛋白质和肽。尽管水解后仍存在一些完整的蛋白质和大肽，但过滤之后，通过将含2μg氮/μL溶液的样品溶液加样于凝胶上没有检测到与残留蛋白质和大肽相关的条带。
BLG-ELISA
使用可商购自拜发公司(r-Biopharm)的对β-乳球蛋白特异的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，通过测定β-乳球蛋白的抗原性来评估残留抗原性的缺失情况。目标为在基于乳清的水解物中低于该试剂盒的检测限，即0.01mgβ-乳球蛋白当量/g蛋白质。
肽谱
对于通过水解产生并存在于过滤后的最终产物中的肽，使用体积排阻色谱法(SE-HPLC)基于其分子量进行表征。在样品溶解于0.1％TFA水溶液后，使用Superdex Peptide10/300GL体积排阻色谱柱(Superdex Peptide 10/300 GL Size-Exclusion column)以0.1％v/v TFA、30％v/v ACN水溶液作为流动相，得到可溶性肽的分子量分布(和中值)。肽的分子量分布在以下范围内测定：肽>2400Da、1200至2400Da、600至1200Da、240至600Da和<240Da。中值是这样的分子量：50％的肽具有高于该值的分子量。
游离AA/总AA％
水解时释放的游离氨基酸使用游离氨基酸和总氨基酸之间的比例(游离AA/总AA％)来测定。游离氨基酸含量通过采用离子交换色谱法(IEC)分离水性样品提取物中存在的游离氨基并用茚三酮试剂柱后衍生之后进行光度检测来获得。总氨基酸含量通过在氮气下在6mol/L盐酸(HCl)中水解测试部分(在水解前将胱氨酸过氧化成半胱氨酸并且将蛋氨酸过氧化成蛋氨酸砜以对酸稳定的氨基酸进行定量)并通过如上所述的离子交换色谱法分离单独的氨基酸来获得。
使用本发明的酶共混物的三个实验的结果示于表1中。
表1
所有结果都在目标值内。
Claims (24)
1.用于制备乳蛋白质水解物的方法，包括用微生物碱性丝氨酸蛋白酶联合菠萝蛋白酶、来自曲霉(Aspergillus)的蛋白酶和来自芽孢杆菌(Bacillus)的蛋白酶水解乳基蛋白质材料。
2.根据权利要求1所述的用于制备乳蛋白质水解物的方法，包括用微生物碱性丝氨酸蛋白酶联合菠萝蛋白酶、来自曲霉的两种蛋白酶和来自芽孢杆菌的蛋白酶水解乳基蛋白质材料。
3.根据权利要求2所述的用于制备乳蛋白质水解物的方法，其中所述来自曲霉的两种蛋白酶为亮氨酸氨肽酶和曲霉胃蛋白酶1，并且/或者来自芽孢杆菌的所述蛋白酶为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中性蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括：
(iii)第一水解步骤，包括用所述微生物碱性丝氨酸蛋白酶水解所述乳基蛋白质材料；以及
(iv)第二水解步骤，包括用所述菠萝蛋白酶、所述亮氨酸氨肽酶、所述曲霉胃蛋白酶1和所述枯草芽孢杆菌中性蛋白酶水解所述乳蛋白。
5.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备乳蛋白质水解物的方法，其中所述曲霉为米曲霉(Aspergillus oryzae)，并且/或者所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述微生物碱性丝氨酸蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述枯草杆菌蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述碱性丝氨酸蛋白酶源自芽孢杆菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述芽孢杆菌是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的用于制备乳蛋白质水解物的方法，包括用来自地衣芽孢杆菌的微生物碱性丝氨酸蛋白酶联合菠萝蛋白酶、来自米曲霉的亮氨酸氨肽酶、来自米曲霉的曲霉胃蛋白酶1和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶水解乳基蛋白质材料。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述碱性丝氨酸蛋白酶为AlcalaseTM。
12.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述乳基蛋白质材料为乳清蛋白、酪蛋白或两者的混合物。
13.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述乳基蛋白质材料为乳清蛋白。
14.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述水解物进一步经受酶失活、微滤和/或超滤。
15.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述蛋白质水解物为深度水解产物，其具有大于95％的NPN/TN％。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述蛋白质水解物具有大于99％的NPN/TN％。
17.包含通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的乳基蛋白质水解物的组合物。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述组合物为婴儿配方食品、儿童食品补充剂或成人营养组合物。
19.根据权利要求17所述的组合物，其中所述组合物为较大婴儿配方食品。
20.根据权利要求17所述的组合物，其中所述组合物为婴孩食物配方食品。
21.根据权利要求17-20中任何一项所述的组合物，其中所述组合物为低变应原性组合物。
22.微生物碱性丝氨酸蛋白酶联合菠萝蛋白酶、来自曲霉(Aspergillus)的蛋白酶和来自芽孢杆菌(Bacillus)的蛋白酶在制备包含乳基蛋白质材料水解物的组合物中的用途。
23.根据权利要求1至16中任一项所述的方法获得的乳蛋白质水解物在制备婴儿配方食品中的用途。
24.根据权利要求17至20中任何一项所述的组合物在制备用于减少或预防牛乳蛋白质变态反应(CMA)的产品中的用途。
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