CN107382974B - 一种嘧啶胺类化合物作为周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嘧啶胺类化合物作为周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂的应用，所述化合物具有为式(I)结构，优选的，其中R₁，R₂各自为氢、羟基、烷基，X为卤素。更优选的，R₁为氢、羟基，R₂为烷基，X为氟、氯、溴，特别优选的，R₁为氢、R₂为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基，X为氟。

Description

一种嘧啶胺类化合物作为周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂的 应用

技术领域

本发明属于药物化学的范畴，具体涉及一类含嘧啶胺类化合物合成及其作为周期蛋白依赖性激酶CDK4/6抑制剂在癌症治疗中的应用。

背景技术

周期蛋白依赖性激酶(CDKs)，在真核细胞的主要细胞周期状态转换过程中起到非常重要的调控与驱动作用。CDKs的分类有1～11，其中CDK4和6是细胞分裂周期的重要调节蛋白，可以磷酸化RB1从而使RB1失去抑制细胞生长的功能，可以诱发细胞由生长期(G1期)向DNA复制期(S1期)转变。细胞的无节制生长是癌症的主要特征标志之一，CDK4/CDK6的失调可以导致细胞的无节制生长从而导致各类增殖性疾病包括癌症。 CDK4/6抑制剂能够抑制这两种酶，从而阻断细胞继续分裂。因此，对CDK4/6的抑制可以通过RB1激活抑制细胞生长的机制，从而迟缓或抑制癌症细胞的增殖，对CDK4/6的干预成为一种肿瘤治疗策略，CDK4/6因此成为抗肿瘤的靶点之一。

Palbociclib，结构式如下

Palbociclib是美国辉瑞公司开发的一种新型口服靶向制剂，能够选择性抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(CDK4/6)，恢复细胞周期控制，阻断肿瘤细胞增殖，FDA于2013年4月授予Palbociclib治疗晚期或转移性ER+/HER2-乳腺癌的突破性疗法认定，于2014 年完成了Palbociclib的三期临床试验，并于2014年7月向FDA提出上市申请，FDA于 2014年10月13日正式受理其申请。FDA授予Palbociclib优先审查资格。Palbociclib已于 2015年2月3日获得FDA的上市许可，成为全球首个获得上市许可的CDK4/6抑制剂。

另有多种同类药品的报道，但现有技术均不同程度存在活性低，副作用大，治疗指数不高的缺陷，为了克服上述现有技术所存在的缺陷，本发明人进行了广泛的研究，设计合成了一类新的化合物，并测定了它们的抗肿瘤活性，通过生物活性测试结果显示，其生物活性优于Palbociclib的活性。最终发现，不同于以往文献报道的同类化合物，本发明的化合物具有更加优越的抗肿瘤活性和治疗指数。

发明内容

本发明涉及新的具有式(I)所示嘧啶胺化合物或其可药用盐：

其中R₁，R₂各自为氢、羟基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、环烷基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳氧基、芳硫基、杂环基、杂环氨基、环氧基、烷基环氧基、烷基氨基、二烷基氨基的含C₁至C₁₈的直链或支链基团；烷基的取代基包括一个或多个芳基、杂环基、环烷基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、杂环基氨基、烷酰基、环烷酰基、芳酰基、杂环酰基、羧基；芳基、杂环基以及环烷基的取代基包括一个或多个甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、氨基、乙烯基、烯丙基、羧基、酰基、氟、氯、溴、碘或磺酰胺。

X为卤素、取代或未取代氧(-OH、-OR’)、取代或未取代硫(-SH、-SR’)、取代或未取代氮(-NH₂、-NHR’、-NR’R”)，其中，R’和R”为烷基、烯基、烯丙基、炔基、卤代烷基、环烷基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳氧基、芳硫基、杂环基、杂环氨基、卤素、烷基氨基、二烷基氨基、胺氧化物、叠氮、硝基、氰基和异氰基、烷酰基、环烷酰基、芳酰基、杂环酰基。

优选的，其中R₁，R₂各自代表的烷基选自：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、氨甲基、氨乙基、氨丙基、氨丁基、氨戊基、氯甲基、氯乙基、氯丙基、氰甲基、氰乙基、氰丙基、羟基、羟甲基、羟乙基、羟丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、芳氧基、杂环氧基、环烷氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、杂环硫基、烷酰基、环烷酰基、芳酰基、杂环酰基、羧基、烷氧羰基、氨酰基、烷基氨酰基、芳基氨酰基、二烷基氨酰基、二芳基氨酰基、杂环氨酰基、苄基、1-甲基-2苯基乙基、1- 苯基丙基、2-苯基丙基、3-苯基丙基、苯基丁基、苯基戊基、1-苄基-1-甲基乙基、芳甲基、芳乙基、芳丙基、芳丁基、杂环芳甲基、杂环芳乙基、杂环芳丙基、杂环芳丁基、氟、氯、溴、碘、氟甲氧基、氯甲氧基、溴甲氧基、氟乙氧基、氯乙氧基、溴乙氧基、氨甲氧基、氨乙氧基、氨丙氧基以及诸如硫、磷、硅和硒等杂原子。

本发明的式(I)所示嘧啶胺化合物或其可药用盐：优选的，R₁，R₂各自为氢、羟基、烷基，X为卤素。更优选的，R₁为氢、羟基，R₂为烷基，X为氟、氯、溴。特别优选的， R₁为氢、R₂为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基，X为氟。

本发明最优选的化合物选自结构式如下式的化合物，称为化合物1，化学名称：5-氟 -4-(1-异丙基-1H-吲哚-3-基)-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺

本发明的式(1)所示嘧啶胺化合物或其可药用盐：优选其药用盐的形式，所述药用盐包括与无机酸，如盐酸、硫酸形成的盐，与有机酸，如乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、草酸、琥珀酸、苯甲酸、酒石酸、富马酸、扁桃酸、抗坏血酸或苹果酸形成的盐，以及氨基酸，如丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸形成的盐或与磺酸，如甲磺酸、对甲苯磺酸形成的盐。

本发明的式(1)化合物也可以溶剂化物(如水合物)的形式存在，因此，这些溶剂化物(如水合物)也包括在本发明的化合物之内。

本发明还提供含有如上所定义的式(1)所示嘧啶胺化合物或其可药用盐或其水合物作为活性成分的药物组合物。

药物组合物含有的式(1)所示嘧啶胺化合物或其可药用盐在组合物中的重量比为0.1～ 99.9％，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1～99.9％。药物组合物以适合药用的制剂形式存在。药用的制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、混悬剂、注射剂、粉针剂、栓剂、霜剂、滴剂或贴剂。其中，所述片剂为糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂或缓释片剂；所述胶囊剂为硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂；所述粉针剂为冻干粉针剂。

本发明的药物组合物，作为制剂形式，每剂中含有的发明化合物的有效量为0.1～1000mg，所述每剂指的是，每一制剂单位，如片剂的每片，胶囊的每粒，也可指每次服用剂量，如每次服用100mg。

本发明的药物组合物在制备成粉剂、片剂、可分散粉剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和软膏形式的固体或半固体药物制剂时，可使用固体载体。可使用的固体载体优选为选自稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、膨胀剂等中的一种或多种物质，或可为包封物质。在粉状制剂中，在载体中含有5～70％的微粒化活性成分。适宜的固体载体包括碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、蔗糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低沸点蜡、可可脂等。由于它们易于给药，片剂，粉剂、扁囊剂和胶囊等代表最有利的口服固体制剂。

本发明的液体制剂包括溶液、悬液和乳液。例如，非胃肠道给药的注射制剂可为水或水-丙二醇溶液形式，调节其等渗度，pH等使适于活体的生理条件。液体制剂还可制成在聚乙二醇、水溶液中的溶液形式。可通过将活性成分溶解在水中，再加入适量的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂，来制备口服水溶液。可将微粒化的活性成分分散在粘性物质如天然和合成胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它已知悬浮剂中制备适于口服的水悬液。

为了易于给药及剂量均一，将上述药物制剂配制成剂量单位形式是特别有利的。制剂的剂量单位形式指适于作为单一剂量的物理分离单位，每个单位含有产生所期望的治疗效果的计算好的预定量的活性成分。这种剂量单位形式可为包装形式，如片剂、胶囊或装在小管或小瓶中的粉剂，或装在管或瓶中的软膏、凝胶或霜剂。

虽然剂量单位形式中所含活性成分的量可以变化，但一般根据所选择活性成分的效力，调节在1～1000mg范围内。

当本发明的式(1)所示嘧啶胺化合物或其可药用盐用作治疗药物时，本领域技术人员可按常规方法确定适于某种情况的优选剂量。一般，开始治疗的量低于活性成分的最佳剂量，然后逐渐增加给药剂量，直到达到最佳治疗效果。为治疗需要，总的日剂量可一次给药或分数次给药。

本发明的式(I)所示嘧啶胺化合物或其可药用盐可以采用以下方法制备

方法一：

先将左侧片段与中间母核连接，在将所得到的产物与右侧片段连接，反应式如下：

方法二：

先将右侧片段与中间母核连接，在将所得到的产物与左侧片段连接，反应式如下：

以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果

本实验例在于研究本发明化合物的体外活性及与现有技术相比的对比实验数据如下：

试验方法：MTT

1.细胞复苏：将冻存的细胞从液氮中取出，37℃水浴快速融化，将细胞转移到培养瓶中，加入含血清培养基在5％CO2，37℃培养箱中培养。

2.细胞传代：培养瓶中细胞长满后，用1mL 0.025％EDTA-胰酶消化传代培养，至P3代以后细胞用于试验。

3.细胞接种：将细胞消化后计数，用培养基将细胞稀释到目标浓度，接种到96孔板，100μL/ 孔。

4.加药：接种细胞过夜培养后加药，设5个浓度梯度，每个浓度3个复孔；设阴性对照孔和空白对照孔。每孔液体总量为200μL/孔。

5.加MTT：加药细胞分别培养24、48和72h后加MTT，10μL/孔。

6.显色：加MTT后4h内吸掉培养基，加DMSO溶解紫色结晶物质，150μL/孔，摇晃10min，用酶标仪在570nm条件下测定各孔OD值；

7.细胞生长抑制率计算公式：P＝[1-(Tx-T0)/(C-T0)]×100％

其中，C：阴性对照孔平均OD值

Tx：加药孔平均OD值

T0：空白孔平均OD值

8.IC50计算软件：originpro8

所用细胞株及细胞接种浓度：

MDA-MB-435细胞：接种数5000/孔

MDA-MB-231细胞：接种数目7500/孔

MCF-7细胞：接种数目5000/孔

实验结果：

1.MDA-MB-435细胞株：化合物1优于阳性药Palbociclib。

供试品对MDA-MB-435细胞株的抑制作用(IC50：μM)

MDA-MB-435	24h	48h	72h
				化合物1	8～40	16.75	7.61
Palbociclib	>200	40～200	40～200

2.MDA-MB-231细胞株：化合物1的作用效果优于阳性药Palbociclib。

供试品对MDA-MB-231细胞株的抑制作用(IC50：μM)

MDA-MB-231	24h	48h	72h
				化合物1	2～10	2～10	2～10
Palbociclib	>10	>10	>10

3.MCF-7细胞株：化合物1对MCF-7在48h的抑制作用优于阳性药Palbociclib。

供试品对MCF-7细胞株的抑制作用(IC50：μM)

MCF-7	24h	48h
			化合物1	2～10	2～10
Palbociclib	>10	>10

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：5-氟-4-(1-异丙基-1H-吲哚-3-基)-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物(1))的合成

反应条件：i)吲哚，MeMgBr，1,2-二氯乙烷，0℃→室温；ii)NaH，THF，0→35℃，48h；iii)Pd₂(dba)₃，Xantphos，DIPEA，二氧六环，100℃，48h；iv)氯化氢气体，乙酸乙酯，室温过夜。

第一步：3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-1H-吲哚(中间体1)的合成

1.17g吲哚(10.0mmoL)溶于15mL的1,2-二氯乙烷中，加入7.5ml甲基溴化镁(15mmoL，2M的THF溶液)，降温至0度，缓慢加入1.66g的2,4-二氯-5-氟嘧啶(10.0mmoL) 溶于15mL的1,2-二氯乙烷的溶液，保持0度1小时后，回温至室温反应1小时，持续搅拌下加入30ml水，析出大量固体，过滤，分别使用水、10％柠檬酸和乙酸乙酯洗涤滤饼，烘干得到1.7g的3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-1H-吲哚(中间体1)。

第二步：3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-1-异丙基-1H-吲哚(中间体2)的合成

1.7g的3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-1H-吲哚(6.88mmoL)溶于30mL四氢呋喃，降温至0 度，加入0.28g氢化钠(7.0mmoL)，搅拌半小时，加入1.41g碘代异丙烷(8.24mmoL)，加热至35度，反应48小时后，降至室温，加水淬灭反应，使用30mL乙酸乙酯萃取分液，有机相用饱和食盐水洗，硫酸钠干燥，过滤后旋干得到2.1g的3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-1- 异丙基-1H-吲哚(中间体2)。

第三步：4-(6-((5-氟-4-(1-异丙基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(中间体3)的合成

1.75g的3-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-1-异丙基-1H-吲哚(6.0mmoL)和1.84g的4-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(6.6mmoL)溶于30ml二氧六环中，在氮气保护下加入332 mg三(二亚苄基丙酮)二钯(0.6mmoL)、1.45g的N,N-二异丙基乙胺(12mmoL)和694.3 mg的4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(1.2mmoL)，加热至100度反应48小时，将反应液旋干，分别加入50ml乙酸乙酯和50ml水，分液，有机相用饱和食盐水洗，硫酸钠干燥，使用硅胶柱纯化得到2.10g的4-(6-((5-氟-4-(1-异丙基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基) 吡啶-3-基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(中间体3)

第四步：5-氟-4-(1-异丙基-1H-吲哚-3-基)-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物 (1))的合成

2.1g的4-(6-((5-氟-4-(1-异丙基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(0.38mmoL)溶于30ml乙酸乙酯，通入干燥的氯化氢气体10分钟，在25度下搅拌过夜。将反应液浓缩得到黄色固体，加入25ml乙酸乙酯打浆，过滤得到1.98g的5-氟-4-(1-异丙基-1H-吲哚-3-基)-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物(1))。MS-ESI (m/z):Calcd:430.22(M–H)；Found:430.00，¹H NMR(300MHz,D₂O)δ8.14(d,1H,J＝7.8 Hz),7.93(s,1H),7.84(d,1H,J＝3.3Hz),7.44(dd,1H,J₁＝9.6Hz,J₂＝2.4Hz),7.19(d,1H,J ＝7.8Hz),6.91-7.02(m,2H),6.85(s,1H),6.57(d,1H,J＝9.6Hz),4.43-4.52(m,1H),3.33-3.35(m,4H),3.20-3.22(m,4H),1.43(d,6H,J＝6.6Hz)。

Claims (4)

1.一种具有以下结构的嘧啶胺类化合物或其可药用盐：

其中，R₁为氢、R₂为异丙基，X为氟。

2.根据权利要求1所述的化合物或其可药用盐，其中，所述可药用盐包括与盐酸、硫酸形成的盐，或与乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、草酸、琥珀酸、苯甲酸、酒石酸、富马酸、扁桃酸、抗坏血酸或苹果酸形成的盐，以及与氨基酸形成的盐或与甲磺酸、对甲苯磺酸形成的盐。

3.含有权利要求1所述的化合物或其可药用盐并将其作为活性成分的药物组合物。

4.权利要求1所述的化合物或其可药用盐的制备方法，步骤如下：