CN107362376A

CN107362376A - 放射性药物组合物

Info

Publication number: CN107362376A
Application number: CN201710610326.XA
Authority: CN
Inventors: D.J.巴内特
Original assignee: GE Healthcare Ltd
Current assignee: Sino Medical Co.,Ltd.
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2011-07-27
Publication date: 2017-11-21
Also published as: EP2598175A1; ES2804509T3; WO2012013701A1; DK2598175T3; EP2598175B1; CN103108659A; US20130129623A1; US20210060189A1; JP2013532674A; US11723991B2; HUE050033T2; US10758635B2; JP6244203B2

Abstract

本发明涉及^99mTc‑maraciclatide放射性药物组合物，其用辐射防护剂稳定。还描述用于制备放射性药物组合物的试剂盒，以及从试剂盒制备此类组合物的方法。本发明还包括用放射性药物组合物使哺乳动物体显像的方法。

Description

放射性药物组合物

本申请是申请日为2011年7月27日，申请号为201180046252.2，发明名称为“放射性药物组合物”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及用辐射防护剂稳定的^99mTc-maraciclatide放射性药物组合物。还描述用于制备放射性药物组合物的试剂盒，以及从试剂盒制备此类组合物的方法。本发明还包括用放射性药物组合物使哺乳动物体显像的方法。

发明背景

^99mTc-maraciclatide是^99mTc-NC100692的推荐INN (USA批准名称)。^99mTc-NC100692已描述于专利和出版物两者，作为靶向体内整合素受体的放射性药物。

WO 03/006491公开式(I)化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中：

G代表甘氨酸

D代表天冬氨酸

R₁代表-(CH₂)_n或-(CH₂)_n-C₆H₄-，其中

n代表正整数1至10，

h代表正整数1或2，

X₁代表氨基酸残基，其中所述氨基酸具备功能性侧链比如酸或胺，

X₂和X₄独立代表能够形成二硫键的氨基酸残基，

X₃代表精氨酸、N-甲基精氨酸或拟精氨酸(arginine mimetic)，

X₅代表疏水氨基酸或其衍生物，

X₆代表含巯基的氨基酸残基，

X₇不存在或代表生物调节物(biomodifier)部分，

Z₁代表抗肿瘤剂、螯合剂或报道分子(reporter)部分和

W₁不存在或代表间隔物部分。

WO 03/006491公开具有所示式的优选螯合部分，其中包括式I所述螯合剂共轭物的^99mTc络合物：

WO 03/006491未公开试剂盒。

Edwards等[Nucl.Med.Biol., 35, 365-375 (2008)]公开^99mTc-maraciclatide(^99mTc-NC100692)可从试剂盒制备。Edwards等声明每个冻干试剂盒都含有约44 nmolmaraciclatide (NC100692)，以及多种赋形剂包括缓冲剂、亚锡还原剂和亚甲基二膦酸(作为Sn²⁺增溶剂存在)。Edwards等报道在重构后20分钟测定各重构试剂盒的放射化学纯度(RCP)，发现至少为90%。在重构试剂盒使用期间发现RCP是稳定的。

本发明

锝-99m (^99mTc)是以6.02小时半衰期衰减为锝-99(⁹⁹Tc)的放射性同位素。放射性衰减伴随γ射线的发射，对于用现代γ照相机进行医学显像具有接近理想的能量。衰减产物，⁹⁹Tc，也是放射性的，以2.1×10⁵年的半衰期通过β-发射衰减(至稳定的同位素⁹⁹Ru)，但⁹⁹Tc的放射性发射不足以用于医学显像。

常规^99mTc“产生剂(generator)”包含放射性同位素⁹⁹Mo，它以66.2小时的半衰期衰减。从此种产生剂洗脱的锝的化学形式是^99mTc-过锝酸盐。约86%的 ⁹⁹Mo衰减产生^99mTc，但是约14%的 ⁹⁹Mo衰减直接产生⁹⁹Tc。因此，如果^99mTc产生剂在前次洗脱后非常短时间就洗脱，^99mTc含量将低，但将占总锝含量的约86%。在产生剂前次洗脱后随着时间推移，⁹⁹Tc既由⁹⁹Mo产生也由^99mTc至⁹⁹Tc的衰减产生。因此，随着产生剂洗脱之间时间间隔的增加，⁹⁹Tc/^99mTc比增加。⁹⁹Tc与^99mTc锝同位素在化学上相同，因此任何放射性药物制剂必须能够应付洗脱液中广泛的⁹⁹Tc化学内容物，以便能够在产生剂的可用寿命内有效地发挥功能。而且用新鲜^99mTc产生剂进行的洗脱可能具有较高的放射性浓度，从而具有较高浓度的因溶剂(水)辐解而产生的反应性自由基。因此可行的^99mTc放射性药物制剂必须能够即使在存在此类反应性自由基的情况下也提供令人满意的RCP性能。^99mTc产生剂的这些特征在大多数放射化学或核化学教科书中都有说明，不同洗脱液性质对^99mTc试剂盒性能可能带来的问题已由Saha, G. B. “Radiopharmaceuticals and Methods of Radiolabeling (放射性药物和放射性标记方法)”; Fundamentals of Nuclear Pharmacy(核药剂学原理) (第3版)中，第6章(80-108页)描述。

本发明人已发现由Edwards等(上文)报道的Maraciclatide试剂盒患于现有技术先前未认识到的多种问题：

(i) 用^99mTc-过锝酸盐将试剂盒重构后相对低的初始RCP；

(ii) 重构后稳定性不足；

(iii) 需要在-15至-20℃贮存和运输以维持试剂盒稳定性和性能；

(iv) 从试剂盒只能获得单患者剂量。

本发明提供改良的^99mTc-maraciclatide放射性药物组合物，其表现更可重现的初始放射化学纯度(RCP)和改良的重构后稳定性，以便在重构后6小时时保持RCP为85至90%。现有技术中没有认识到在某些放射性水平、放射性浓度或重构体积条件下^99mTc-maraciclatide制剂的不令人满意的RCP问题。此类条件是在使用商业放射性核素产生剂比如^99mTc产生剂的正常条件下可能出现的条件。

Berger [Int.J.Appl.Rad.Isotop., 33, 1341-1344 (1982)]公开广泛的抗氧化剂可用于稳定^99mTc-放射性药物。从此亚甲蓝和抗坏血酸已被突出显示为特别合适的稳定剂[Weisner等, Eur.J.Nucl.Med., 20, 661-666 (1993)和Liu等, Bioconj.Chem., 14(4), 1052-1056 (2003)]。

本发明人也已明确众所周知的辐射防护剂抗坏血酸/抗坏血酸盐(酯)对^99mTc-maraciclatide的RCP实际上具有有害作用。另一种已知的辐射防护剂龙胆酸引起变色问题，这排除了其在本组合物中的用途。本发明提供解决这种先前没有认识到的问题的包含辐射防护剂的组合物。本发明的试剂盒具有以下优点：较高的初始RCP；重构后经过较长时间段更稳健的RCP；与各种商业^99mTc放射性药物产生剂和在一定范围洗脱条件下的相容性；每一试剂盒获得双患者剂量的便利(即以较高放射性水平成功地重构)；在冰箱(+5 ±3℃)而不是冷冻温度(-10至-20℃)贮存和运输的足够稳定性和至少3年的试剂盒保存期限稳定性。

发明详述

第一方面，本发明提供放射性药物组合物，所述组合物在生物相容性载体中包含：

(i) ^99mTc-maraciclatide；

(ii)选自对氨基苯甲酸或其与生物相容性阳离子的盐的辐射防护剂；

采用适合哺乳动物给药的形式。

术语“maraciclatide”指在科学文献中称为NC100692的化合物[D.Edwards等,Nucl.Med.Biol., 35, 365-375 (2008)]。化学名称是：1,5-戊二酸-(5-[2-羟基亚氨基-1,1-二甲基-丙基氨基]-3-(2-[2-羟基亚氨基-1,1-二甲基-丙基氨基]-乙基)-戊基)-酰胺5-[13-苄基-19-羧甲基-25-(3-胍基-丙基)-10-(4,7,10,16-四氧杂-14,18-二氧代-1,13,19-三氮杂十九基)-氨基甲酰基-3,6,12,15,18,21,24,27-八氧代-8,29,30-三硫杂-2,5,11,14,17,20,23,26-八氮杂-双环[14.11.4]三十一-4-基]戊基-酰胺。

Maraciclatide的化学结构如下：

Maraciclatide

Maraciclatide可以游离碱形式，或者以盐形式(如三氟乙酸盐)使用。

术语“放射性药物”具有其常规含义，指适合哺乳动物体内给药用于诊断或治疗的放射性化合物。

通过术语“辐射防护剂”指通过截留高反应性自由基(比如因水辐解产生的含氧自由基)抑制降解反应(比如氧化还原过程)的化合物。本发明的辐射防护剂适合地选自对氨基苯甲酸(即4-氨基苯甲酸)及其与生物相容性阳离子的盐。这些辐射防护剂可市售获得，包括以药物级纯度。优选使用药物级材料。

通过术语“生物相容性阳离子”(B^c)指与离子化、带负电荷基团形成盐的带正电荷反离子，其中所述带正电荷反离子还是非毒性的，因此适合给予哺乳动物体，特别是人体。合适的生物相容性阳离子实例包括：碱金属钠或钾；碱土金属钙和镁；和铵离子。优选的生物相容性阳离子是钠和钾，最优选钠。

“生物相容性载体”是一种流体，特别是液体，其中放射性药物可悬浮或优选溶解，以便组合物在生理学上可耐受，即可给予哺乳动物体并且无毒性或过度不适。生物相容性载体适宜的是可注射的载液比如无菌、无热原注射用水；水溶液比如盐水(其可有利地平衡以便用于注射的终产物等渗)；包含生物相容性缓冲剂(如磷酸盐缓冲剂)的水性缓冲溶液；一种或更多种渗透压调节物(如血浆阳离子与生物相容性反离子的盐)、糖(如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(如山梨醇或甘露醇)、二醇(如甘油)或其它非离子多元醇材料(如聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。优选生物相容性载体是无热原注射用水、等渗盐水或磷酸盐缓冲液。

通过短语“采用适合哺乳动物给药的形式”指一种组合物，它无菌、无热原，缺乏产生毒性或不良影响的化合物，在生物相容性pH (对于本发明的剂为约pH 4.0至10.5，优选6.5至9.5)和生理学上可相容的同渗重摩下配制。此类组合物缺乏冒可导致体内栓塞危险的颗粒，并且被配制以便在接触生物学流体(如血液)后不出现沉淀。此类组合物还只含生物学上可相容的赋形剂，优选等渗的。

优选哺乳动物是完整的活体哺乳动物体，更优选人受试者。优选可将放射性药物以最小侵入性的方式(即，即使在专业医学专家实施时对哺乳动物受试者也没有实质性健康危险)给予哺乳动物体。此类最小侵入性给药优选静脉内给予到所述受试者的周围静脉内，而不需要局部或全身麻醉。

术语“包含”在本申请自始至终具有其常规含义，意味着组合物必须具有列出的组分，但另外可存在其它的未指明的化合物或物质。术语“包含”包括优选子集“基本由……组成”，指组合物具有列出的组分，而不存在其它化合物或物质。

放射性药物组合物可含有另外的任选赋形剂比如：抗微生物防腐剂、pH-调节剂、填充剂、增溶剂或同渗重摩调节剂。

通过术语“抗微生物防腐剂”指抑制可能有害的微生物比如细菌、酵母或霉菌生长的剂。抗微生物防腐剂还可表现一些杀菌的性质，取决于采用的剂量。本发明的抗微生物防腐剂的主要作用是抑制任何此类微生物在药物组合物中生长。但是，抗微生物防腐剂还可任选用于在给药之前抑制可能有害的微生物在一种或更多种用于制备所述组合物的试剂盒组分中生长。合适的抗微生物防腐剂包括：对羟基苯甲酸酯，即对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯或其混合物；苄醇；乙醇，酚；甲酚；西曲溴铵和硫柳汞。优选抗微生物防腐剂是对羟基苯甲酸酯或乙醇。

术语“pH调节剂”指可用于确保组合物的pH在用于人或哺乳动物给药的可接受限度(对于本发明的剂为约pH 4.0至10.5，优选6.5至9.5)内的化合物或化合物混合物。合适的此类pH调节剂包括药学上可接受的缓冲剂，比如曲辛、磷酸盐、乙酸盐或TRIS [即三(羟甲基)氨基甲烷]，和药学上可接受的碱比如碳酸钠、碳酸氢钠或其混合物。当采用试剂盒形式的组合物时，pH调节剂可任选提供在单独的管瓶或容器中，以便试剂盒的使用者可调节pH作为多步程序的一部分。

通过术语“填充剂”指在制备和冻干期间可促进材料处理的药学上可接受的增量剂。合适的填充剂包括无机盐比如氯化钠和水溶性糖或糖醇比如蔗糖、麦芽糖、甘露醇或海藻糖。

通过术语“增溶剂”指存在于组合物中增加放射性药物在溶剂中的溶解度的添加剂。优选的此类溶剂是水性介质，因此增溶剂优选改善在水中的溶解度。合适的此类增溶剂包括：C_1-4醇；甘油；聚乙二醇(PEG)；丙二醇；聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯；脱水山梨醇单油酸酯；聚山梨酯(如Tween^TM)；聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)嵌段共聚物(Pluronics^TM)；环糊精(如α、β或γ环糊精、羟丙基-β-环糊精或羟丙基-γ-环糊精)和卵磷脂。

优选增溶剂是环糊精、C_1-4醇、聚山梨酯和Pluronics^TM，更优选环糊精和C_2-4醇。当增溶剂是醇时，优选乙醇或丙醇，更优选乙醇。乙醇具有可能的几种作用，因为它还可发挥生物相容性载体、辐射防护剂或抗微生物防腐剂的功能。当增溶剂是环糊精时，优选γ环糊精，更优选羟丙基-β-环糊精(HPCD)。环糊精的浓度可为约0.1至约40 mg/ml，优选约5至约35 mg/ml，更优选20至30 mg/ml，最优选约25 mg/ml。

优选特征

本发明的辐射防护剂优选包含对氨基苯甲酸钠。还可存在另外的辐射防护剂。如果使用此类另外的辐射防护剂，优选不包含抗坏血酸或龙胆酸或其盐。更优选本发明的辐射防护剂基本由对氨基苯甲酸或其与生物相容性阳离子的盐组成。最优选本发明的辐射防护剂基本由对氨基苯甲酸钠组成。

第一方面的放射性药物组合物适宜地提供在药物级容器中。优选的此类容器是隔膜密封管瓶，其中用顶封(通常是铝)使气密式封闭物卷边。封闭物适合用于皮下针单次或多次穿刺(如卷边隔膜密封封闭物)而同时维持无菌完整性。此类容器具有另外的优点，如果期望的话封闭物可经受真空(如用以改变顶空气体或对溶液脱气)，和经受压力改变比如减压而不允许外部大气气体比如氧气或水蒸气进入。优选的多剂量容器包含装有多患者剂量的单个主体管瓶(如10至30 cm³体积)，从而可在制剂的有效寿命期间以各种时间间隔将单患者剂量抽入临床级注射器内，以适合临床情况。

第一方面的放射性药物组合物也可提供在注射器中。将预充式注射器设计为包含单人剂量，或者“单位剂量”，因此优选单次使用或其它适合临床使用的注射器。放射性药物注射器优选提供有注射器罩以使对操作者的辐射剂量最小化。

第二方面，本发明提供用于制备第一方面放射性药物组合物的试剂盒，其中所述试剂盒包含：

(i) Maraciclatide；

(iii)亚锡还原剂；

(iv)亚甲基二膦酸或其与生物相容性阳离子的盐。

通过术语“试剂盒”指一个或更多个药物级容器，包含必需的非放射性化学物以制备期望的放射性药物组合物，连同操作说明书一起。将试剂盒设计为用^99mTc重构以在最小限度处理的情况下得到适合人给药的溶液。本发明的试剂盒优选包含以单一冻干制剂在单一容器中的冻干组合物，所述冻干组合物包含所有试剂盒组分。

第二方面的试剂盒为非放射性。在试剂盒中辐射防护剂的优选方面如在第一方面(上文)描述。

术语“亚锡还原剂”具有其在^99mTc放射性药物试剂盒领域的常规含义，指Sn²⁺即Sn(II)氧化态的锡的盐。合适的此类盐可为水合或无水形式，包括：氯化亚锡、氟化亚锡和酒石酸亚锡。优选此类亚锡还原剂是氯化亚锡。

术语“亚甲基二膦酸”具有其常规化学含义，具有显示的化学结构：

亚甲基二膦酸(MDP)

优选将试剂盒冻干，设计为用来自^99mTc放射性同位素产生剂的无菌^99mTc-过锝酸盐(TcO₄ ^-)重构，以得到无需进一步处理即适合人给药的溶液。非放射性试剂盒可任选进一步包含另外的组分比如转换螯合剂(transchelator)、抗微生物防腐剂、pH调节剂或填充剂-如在上文第一方面限定。

第二方面的试剂盒优选进一步包含缓冲剂，缓冲剂包含碳酸氢钠和无水碳酸钠的混合物。

最优选的试剂盒配方如下(实施例8的配方C)：

组分	量/管瓶
		Maraciclatide	75μg
氯化亚锡二水合物	17.8 μg
		亚甲基二膦酸(MDP)	90 μg
对氨基苯甲酸(pABA), 钠盐	200 μg
		碳酸氢钠	1800 μg
无水碳酸钠	630 μg

第三方面，本发明提供第一方面放射性药物组合物的制备方法，所述方法包括下列任一种：

(i)将第二方面的试剂盒用生物相容性载体的供应来重构，接着将在生物相容性载体中的^99mTc的供应加至重构的试剂盒；或者

(ii)将第二方面的试剂盒用在生物相容性载体中的^99mTc的供应来重构。

第三方面中试剂盒的优选方面如在第二方面(上文)描述。

^99mTc的供应适合地为无菌形式，优选来自^99mTc放射性同位素产生剂的^99mTc-过锝酸盐(TcO₄ ^-)。此类产生剂可市售获得。

当使用选项(i)时，意指首先用无菌形式的非放射性生物相容性载体(如上文限定；如盐水)重构试剂盒，接着加入^99mTc。当使用选项(ii)时，意指通过将在生物相容性载体中的^99mTc直接加入试剂盒来重构试剂盒。优选选项(ii)，尤其是与单个的冻干试剂盒容器联合，因为这得到无需进一步处理即适合人给药的溶液。

第三方面的方法优选在室温，即不需加热。

第三方面的方法优选用于制备单位患者剂量，通过将放射性药物组合物抽入临床级注射器内，如在第一方面(上文)描述。

第四方面，本发明提供第二方面的试剂盒在第一方面的放射性药物组合物的制备中的用途。

第四方面中试剂盒和放射性药物组合物的优选方面分别如在第二和第一方面(上文)描述。

第五方面，本发明提供对氨基苯甲酸或其与生物相容性阳离子的盐的用途，作为辐射防护剂稳定下列任一种：

(i) ^99mTc-maraciclatide放射性药物组合物；

(ii)用于制备^99mTc-maraciclatide放射性药物组合物的试剂盒。

第五方面中的放射性药物组合物和试剂盒及其优选实施方案，分别优选如第一和第二方面(上文)描述。第五方面中辐射防护剂的优选实施方案如在第一方面(上文)描述。

第六方面，本发明提供第一方面的放射性药物组合物在哺乳动物体显像方法中的用途。

第六方面中放射性药物组合物的优选方面如在第一方面(上文)描述。优选哺乳动物是完整的哺乳动物受试者活体，更优选人受试者。显像方法优选用于辅助所述哺乳动物受试者的诊断方法。

第七方面，本发明提供哺乳动物体的显像方法，它包含使事先已给予第一方面放射性药物组合物的哺乳动物显像。第七方面中放射性药物组合物的优选方面如在第一方面(上文)描述。优选哺乳动物是完整的哺乳动物体活体，更优选人受试者。

第六和第七方面的显像优选使患有其中表达整合素的疾病(比如血管生成、纤维化或炎症)的哺乳动物受试者显像。

本发明通过下面详述的非限制性实施例说明。实施例1至3提供本发明螯合剂1(有时也称为carba-Pn216)的合成。实施例4提供本发明的螯合剂1A——螯合剂1的活性酯-官能化版本的合成。实施例5提供本发明环肽的合成和螯合剂共轭。实施例6提供maraciclatide的合成。实施例7提供对辐射防护剂的选择的研究。实施例8提供关于优化所用辐射防护剂的量的数据。实施例9描述比较的试剂盒配方与现有技术试剂盒配方。实施例10提供对于本发明试剂盒的^99mTc产生剂相容性研究，显示它们在一定范围的条件下与一定范围的商业产生剂可相容。实施例11提供关于本发明试剂盒保存期限稳定性的数据。

缩写

使用常规单字母或3字母氨基酸缩写。

Ac: 乙酰基

Boc: 叔丁氧基羰基

tBu: 叔丁基

DMF: 二甲基甲酰胺

DMSO: 二甲基亚砜

Fmoc: 9-芴基甲氧基羰基

HATU: O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐

HBTU: O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐

HPLC: 高效液相层析

NMM: N-甲基吗啉

pABA: 对-氨基-苯甲酸钠盐

PBS: 磷酸盐缓冲盐水

PEG: 聚乙二醇, (OCH₂CH₂)_n的重复单元, 其中n是整数

tBu: 叔丁基

RCP: 放射化学纯度

RP-HPLC: 反相HPLC

TFA: 三氟乙酸

THF: 四氢呋喃

TIS: 三异丙基硅烷

TLC: 薄层层析

Trt: 三苯甲基。

本发明化合物

实施例1：1,1,1-三(2-氨基乙基)甲烷的合成。

步骤1(a): 3(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯。

将在甲苯(600ml)中的甲氧羰基亚甲基三苯基正膦(167g, 0.5mol)用3-酮戊二酸二甲酯(87g, 0.5mol)处理，在氮气气氛下将反应物在120℃油浴上加热至100℃持续36小时。然后将反应物真空浓缩，用40/60石油醚/乙醚(1:1, 600 ml)研磨油性残留物。沉淀出三苯基膦氧化物，倾析/滤出上清液。将真空蒸发的残留物在高真空Bpt (在0.2 torr下炉温180-200℃)下Kugelrohr蒸馏以得到3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯(89.08g,53%)。

NMR ¹H(CDCl₃): δ 3.31 (2H, s, CH₂), 3.7(9H, s, 3xOCH₃), 3.87 (2H, s,CH₂), 5.79 (1H, s, =CH, ) ppm.

NMR ¹³C(CDCl₃), δ 36.56,CH₃, 48.7, 2xCH₃, 52.09和52.5 (2xCH₂); 122.3和146.16 C=CH; 165.9, 170.0和170.5 3xCOO ppm。

步骤1(b)：3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯的氢化。

在氢气气氛(3.5 bar)下将在甲醇(200ml)中的3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯(89g, 267mmol)与(10%钯/炭:50%水) (9 g)一起振荡30小时。将溶液通过硅藻土(kieselguhr)过滤并真空浓缩以得到3-(甲氧基羰基甲基)戊二酸二甲酯，为油状物，收率(84.9g, 94 %)。

NMR ¹H(CDCl₃), δ 2.48 (6H, d, J=8Hz, 3xCH₂), 2.78 (1H, 六重峰(hextet),J=8Hz CH,) 3.7 (9H, s, 3xCH₃).

NMR ¹³C(CDCl₃), δ 28.6, CH; 37.50, 3xCH₃; 51.6, 3xCH₂; 172.28,3 x COO。

步骤1(c)：三甲酯还原和酯化为三乙酸酯。

在氮气气氛下在3颈2L圆底烧瓶中将在THF (400ml)中的氢化铝锂(20g, 588mmol)用在THF (200ml)中的三(甲氧基羰基甲基)甲烷(40g, 212 mmol)谨慎地处理1小时。出现强烈的放热反应，导致溶剂强烈回流。将反应物在90℃油浴上回流加热3天。通过谨慎地滴加乙酸(100ml)猝灭反应物直至氢的放出停止。将搅拌的反应混合物以一定速率用乙酸酐溶液(500ml)谨慎地处理以导致轻微回流。配备烧瓶用于蒸馏和搅拌，然后在90℃(油浴温度)加热以馏出THF。加入又一部分乙酸酐(300ml)，使反应物恢复回流状态，搅拌并在140℃油浴中加热5小时。让反应物冷却和过滤。将氧化铝沉淀物用乙酸乙酯洗涤，将合并滤液在旋转蒸发器上在50℃水浴温度下真空(5 mmHg)浓缩以得到油状物。使油状物吸收在乙酸乙酯(500ml)中，用饱和碳酸钾水溶液洗涤。将乙酸乙酯溶液分离，经硫酸钠干燥，真空浓缩以得到油状物。将油状物在高真空Kugelrohr蒸馏以得到三(2-乙酰氧基乙基)甲烷(45.3g, 95.9%)，为油状物。在0.1 mmHg沸点220℃。

NMR ¹H(CDCl₃), δ 1.66(7H, m, 3xCH₂, CH), 2.08(1H, s, 3xCH₃); 4.1(6H,t, 3xCH₂O).

NMR ¹³C(CDCl₃), δ 20.9, CH₃; 29.34, CH; 32.17, CH₂; 62.15, CH₂O; 171, CO。

步骤1(d)：从三乙酸酯去除乙酸酯基。

将在甲醇(200ml)的三(2-乙酰氧基乙基)甲烷(45.3g, 165mM)和880氨(100ml)中在80℃油浴上加热2天。将反应物用又一部分880氨(50ml)处理，在80℃于油浴中加热24小时。加入又一部分880氨(50ml)，将反应物在80℃加热24小时。然后真空浓缩反应物以除去所有溶剂，得到油状物。将其吸收在880氨(150ml)中并在80℃加热24小时。然后真空浓缩反应物以除去所有溶剂，得到油状物。Kugelrohr蒸馏得到乙酰胺bp 170-180 0.2mm。将含乙酰胺的球管清洗干净，继续蒸馏。在bp 220℃ 0.2mm蒸馏三(2-羟基乙基)甲烷(22.53g,92%)。

NMR ¹H(CDCl₃), δ 1.45(6H, q, 3xCH₂), 2.2(1H, 五重峰, CH); 3.7(6H, t3xCH₂OH); 5.5(3H, brs, 3xOH).

NMR ¹³C(CDCl₃), δ 22.13, CH; 33.95, 3xCH₂; 57.8, 3xCH₂OH。

步骤1(e)：三醇转化为三(甲磺酸酯)。

在氮气下向三(2-羟基乙基)甲烷(10g, 0.0676mol)在二氯甲烷(50ml)中的搅拌冰冷溶液内以一定速率缓慢滴入甲磺酰氯(40g, 0.349mol)在二氯甲烷(50ml)中的溶液，以便温度上升不超过15℃。然后以一定速率滴加溶于二氯甲烷(50ml)中的吡啶(21.4g,0.27mol, 4eq)，以便温度上升不超过15℃，放热反应。让反应物在室温搅拌24小时，然后用5N盐酸溶液(80ml)处理，层分离。用另外的二氯甲烷(50ml)萃取水层，将有机萃取物合并，经硫酸钠干燥，过滤和真空浓缩以得到被过量甲磺酰氯污染的三[2-(甲磺酰基氧基)乙基]甲烷。理论收率是25.8g。

NMR ¹H(CDCl₃), δ 4.3 (6H, t, 2xCH₂), 3.0 (9H, s, 3xCH₃), 2 (1H, 六重峰, CH), 1.85 (6H, q, 3xCH₂)。

步骤1(f)：1,1,1-三(2-叠氮基乙基)甲烷的制备。

将三[2-(甲磺酰基氧基)乙基]甲烷[来自步骤1(e), 被过量甲磺酰氯污染](25.8g, 67mmol, 理论值)在无水DMF (250ml)中的搅拌溶液在氮气下用叠氮钠(30.7g,0.47mol)分批处理15分钟。观察到放热，在冰浴上冷却反应物。30分钟后，将反应混合物在50℃油浴上加热24小时。反应物变为褐色。让反应物冷却，用稀碳酸钾溶液(200ml)处理，用40/60石油醚/乙醚10:1 (3x150ml)萃取3次。将有机萃取物用水(2x150ml)洗涤，经硫酸钠干燥并过滤。将乙醇(200ml)加至汽油/醚溶液以保持三叠氮化物在溶液中，真空减小体积至不小于200ml。加入乙醇(200ml)，真空再浓缩以除去最后的痕量汽油，剩下不小于200ml乙醇溶液。三叠氮化物的乙醇溶液直接用于步骤1(g)。

注意：切勿除去所有溶剂，因为叠氮化物有可能爆炸，应一直保持在稀溶液中。

将小于0.2ml的溶液真空蒸发以除去乙醇，对该小样品进行NMR：NMR ¹H(CDCl₃), δ3.35 (6H, t, 3xCH₂), 1.8 (1H, 七重峰, CH, ), 1.6 (6H, q, 3xCH₂)。

步骤1(g)：1,1,1-三(2-氨基乙基)甲烷的制备。

将在乙醇(200ml)中的三(2-叠氮基乙基)甲烷(15.06g, 0.0676 mol)，(假定来自前一反应100%收率)用10%钯/炭(2g, 50%水)处理和氢化12小时。每2小时对反应容器抽真空以除去从反应物放出的氮，用氢气再填充。取出样品进行NMR分析以证实三叠氮化物完全转化为三胺。

警告：未还原的叠氮化物在蒸馏后可能爆炸。将反应物用硅藻土垫过滤以除去催化剂，真空浓缩以得到三(2-氨基乙基)甲烷，为油状物。将其进一步通过Kugelrohr蒸馏bp.180-200°C在0.4mm/Hg纯化以得到无色油状物(8.1g, 82.7%总收率)。

NMR ¹H(CDCl₃), δ 2.72 (6H, t, 3xCH₂N), 1.41 (H, 七重峰, CH), 1.39 (6H,q, 3xCH₂).

NMR ¹³C(CDCl₃), δ 39.8 (CH₂NH2), 38.2 (CH₂), 31.0 (CH)。

实施例2：3-氯代-3-甲基-2-亚硝基丁烷的制备。

使2-甲基丁-2-烯(147ml, 1.4mol)和亚硝酸异戊酯(156ml, 1.16mol)的混合物在干冰(cardice)和甲醇浴中冷却至-30℃，用顶空搅拌器剧烈搅拌，以一定速率滴加浓盐酸(140ml, 1.68mol)处理，以便温度维持低于-20℃。这需要约1小时，因为有明显放热，必须注意防止过热。在添加结束时加入乙醇(100ml)以减小已形成的浆料的粘度，将反应物在-20至-10℃再搅拌2小时以完成反应。将沉淀物真空过滤收集，用4×30ml冷(-20℃)乙醇和100ml冰冷水洗涤，真空干燥以得到3-氯代-3-甲基-2-亚硝基丁烷，为白色固体。将乙醇滤液和洗涤液合并，用水(200ml)稀释，冷却，让其在-10℃静置1小时，此时又一批3-氯代-3-甲基-2-亚硝基丁烷结晶出来。将沉淀物过滤收集，用极少量的水洗涤，真空干燥以得到3-氯代-3-甲基-2-亚硝基丁烷总收率 (115g 0.85mol, 73%) 通过NMR纯度>98%。

NMR ¹H(CDCl₃), 作为异构体的混合物(异构体1, 90%) 1.5 d, (2H, CH₃), 1.65d, (4H, 2 xCH₃), 5.85,q, 和5.95,q, 以及1H. (异构体2, 10%), 1.76 s, (6H, 2xCH₃), 2.07(3H, CH₃)。

实施例3：双[N-(1,1-二甲基-2-N-羟基亚胺丙基)2-氨基乙基]-(2-氨基乙基)甲烷(螯合剂1)的合成。

在室温在氮气气氛下边剧烈搅拌边向三(2-氨基乙基)甲烷(实施例1; 4.047g,27.9mmol)在无水乙醇(30ml)中的溶液内加入无水碳酸钾(7.7g, 55.8mmol, 2eq)。使3-氯代-3-甲基-2-亚硝基丁烷 (实施例2; 7.56g, 55.8mol, 2eq)溶液溶于无水乙醇(100ml)中，将75ml该溶液缓慢滴入反应混合物内。反应之后在氧化硅上进行TLC [板在二氯甲烷，甲醇，浓(0.88sg)氨100/30/5中运行；通过喷洒水合茚三酮和加热使TLC板显影]。随着RF的增加依次看到单-、二-和三-烷化产物。以7.5-75%乙腈在3%氨水中的梯度用PRP反相柱进行分析HPLC。将反应物真空浓缩以除去乙醇，再悬浮于水(110ml)中。将含水浆料用醚(100ml)萃取以除去一些三烷化化合物和亲脂杂质，剩下单烷化和期望的二烷化产物在水层中。将水溶液用乙酸铵(2eq, 4.3g, 55.8mmol)缓冲以确保良好层析。将水溶液在4℃贮存过夜，然后通过自动制备HPLC纯化。

收率 (2.2g, 6.4mmol, 23%)。

质谱；阳离子10 V锥电压。实测值：344；计算值M+H= 344。

NMR ¹H(CDCl₃), δ 1.24(6H, s, 2xCH₃), 1.3(6H, s, 2xCH₃), 1.25-1.75(7H,m, 3xCH₂,CH), (3H, s, 2xCH₂), 2.58 (4H, m, CH₂N), 2.88(2H, t CH₂N), 5.0 (6H,s, NH₂, 2xNH, 2xOH).

NMR ¹H ((CD₃)₂SO) δ 1.1 4xCH; 1.29, 3xCH₂; 2.1 (4H, t, 2xCH₂);

NMR ¹³C((CD₃)₂SO), δ 9.0 (4xCH₃), 25.8 (2xCH₃), 31.0 2xCH₂, 34.6 CH₂, 56.82xCH₂N; 160.3, C=N。

HPLC条件：流速8ml/min用25mm PRP柱[A=3%氨溶液(sp.gr = 0.88)/水; B =乙腈].

每次运行装载3ml水溶液，以12.5-13.5 min时间窗收集。

实施例4：螯合剂1-戊二酸的四氟苯硫基酯(螯合剂1A)的合成。

(步骤4a) [螯合剂1]-戊二酸中间体的合成。

使螯合剂1 (100 mg, 0.29 mmol)溶于DMF (10 ml)中，边搅拌边分批加入戊二酐(33 mg, 0.29 mmol)。将反应物搅拌23小时以完全转化为期望的产物。RP-HPLC后以良好收率获得纯酸。

(步骤4b)螯合剂1A的合成。

向在DMF (2 ml)中的[螯合剂1]-戊二酸(来自步骤4a; 300 mg, 0.66 mmol)加入HATU (249 mg, 0.66 mmol)和NMM (132 µL, 1.32 mmol)。将混合物搅拌5分钟，然后加入四氟苯硫酚(0.66 mmol, 119 mg)。将溶液搅拌10分钟，然后将反应混合物用20 %乙腈/水(8 ml)稀释，通过RP-HPLC纯化产物，冷冻干燥后得到110 mg期望的产物。

实施例5：二硫化物[Cys^2-6]硫醚环[CH₂CO-Lys(螯合剂1-戊二酰基)-Cys²-Arg- Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-NH₂的合成。

(步骤5a) ClCH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-NH₂的合成

用1 mmol氨基酸盒以0.25 mmol规模用Rink Amide AM树脂为原料在ABI 433A自动肽合成仪上合成肽。在偶联之前用HBTU预活化氨基酸。用氯乙酸酐在DMF中的溶液使N-端胺基氯乙酰化30分钟。在含有TIS (5 %)、H₂O (5 %)和苯酚(2.5 %)的TFA中从树脂同时脱除肽和侧链保护基团(除tBu以外) 2小时。在后处理后获得295 mg粗肽(分析HPLC: 梯度, 5-50% B经过10分钟其中A = H₂O/0.1 % TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA; 柱, Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50 x 4.6 mm; 流速, 2 ml/min; 检测, UV 214 nm; 产物保留时间, 6.42min)。用质谱进行进一步的产物表征：预期, M+H在1118.5, 实测, 在1118.6)。

(步骤5b)硫醚环[CH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-NH₂的合成。

使295 mg ClCH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-NH₂溶于水/乙腈中。用氨溶液将混合物调节至pH 8，搅拌16小时。在后处理后获得217 mg粗肽(分析HPLC: 梯度, 5-50 % B经过10分钟其中A = H₂O/0.1 % TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA; 柱,Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50 x 4.6 mm; 流速, 2 ml/min; 检测, UV 214 nm; 产物保留时间, 6.18 min)。用质谱进行进一步的产物表征：预期, M+H在1882.5, 实测, 在1882.6)。

(步骤5c)二硫化物[Cys^2-6]硫醚环[CH₂CO-Lys-Cys²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe- Cys]-NH₂的合成。

将217 mg硫醚环[CH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-NH₂用茴香醚(500 µL)、DMSO (2 ml)和TFA (100 ml)的溶液处理60分钟，接着真空除去TFA，通过加入乙醚使肽沉淀。通过制备HPLC (Phenomenex Luna 10µ C18 (2) 250 x 50 mm柱)纯化粗材料(202 mg)，用0-30 % B, 其中A = H₂O/0.1 % TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA进行60分钟，流速为50 ml/min。冻干后获得112 mg纯材料(分析HPLC: 梯度, 5-50 % B经过10分钟其中A = H₂O/0.1 % TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA; 柱, Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50x 4.6 mm; 流速, 2 ml/min; 检测, UV 214 nm; 产物保留时间, 5.50 min)。用质谱进行进一步产物表征：预期, M+H在968, 实测, 在971)。

(步骤5d)二硫化物[Cys^2-6]硫醚环[CH₂CO-Lys(螯合剂1-戊二酰基)-Cys²-Arg- Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-NH₂的合成。

使9.7 mg二硫化物[Cys^2-6]硫醚环[CH₂CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-NH₂、9.1 mg螯合剂1A (实施例5)和6 µL NMM溶于DMF (0.5 ml)中。将混合物搅拌3小时。反应混合物通过制备HPLC (Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250 x 21.20 mm柱)的纯化，用0-30 % B, 其中A = H₂O/0.1 % TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA进行，经过40分钟，流速为10 ml/min。冻干后获得5.7 mg纯材料(分析HPLC: 梯度, 0-30 % B经过10分钟其中A = H₂O/0.1% TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA; 柱, Phenomenex Luna 3 µ C18 (2) 50 x 4.6 mm; 流速, 2 ml/min; 检测, UV 214 nm; 产物保留时间, 7.32 min)。用质谱进行进一步产物表征：预期, M+H在1407.7, 实测, 在1407.6)。

实施例6：二硫化物[Cys^2-6]硫醚环[CH₂CO-Lys(螯合剂1-戊二酰基)-Cys²-Arg- Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-(PEG)₃-NH₂ (Maraciclatide)的合成。

(步骤6a) 17-(Fmoc-氨基)-5-氧代-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸的合成。

用Fmoc化学将该构造单元与固相偶联。

1,11-二叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷。

将无水四乙二醇(19.4 g, 0.100 mol)和甲磺酰氯(25.2 g, 0.220 mol)在无水THF (100 ml)中的溶液保持在氩气下，在冰/水浴中冷却至0℃。用45分钟向烧瓶内滴加入三乙胺(22.6 g, 0.220 mol)在无水THF (25 ml)中的溶液。1小时后撤走冷却浴，继续搅拌4小时。加入水(60 ml)。向混合物内按顺序加入碳酸氢钠(6 g, 至pH 8)和叠氮钠(14.3 g,0.220 mmol)。蒸馏除去THF，使水溶液回流24小时(形成两层)。冷却混合物，加入醚(100ml)。用氯化钠使水相饱和。各相分离，用醚(4 x 50 ml)萃取水相。将合并的有机相用盐水(2 x 50 ml)洗涤和干燥(MgSO₄)。过滤和浓缩得到22.1 g (91%)黄色油状物。产物不再纯化即用于下一步。11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷胺。

在室温用3小时向1,11-二叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷(20.8 g, 0.085 mol)在5%盐酸(200 ml)中的机械剧烈搅拌混悬液内加入三苯基膦(19.9 g, 0.073 mol)在醚(150ml)中的溶液。将反应混合物再搅拌24小时。各相分离，用二氯甲烷(3 x 40 ml)萃取水相。使水相在冰/水浴中冷却，通过加入KOH将pH调节至约12。将产物萃取入二氯甲烷(5 x 50ml)内。干燥(MgSO₄)合并的有机相。过滤和蒸发得到14.0 g (88%)黄色油状物。MALDI-TOF质谱(基质: α-氰基-4-羟基肉桂酸)分析如预期地得到219的M+H峰。用¹H (500 MHz)和¹³C(125 MHz) NMR光谱的进一步表征证实该结构。

17-叠氮基-5-氧代-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸。

向11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷胺(10.9 g, 50.0 mmol)在二氯甲烷(100 ml)中的溶液内加入二羟乙酸酐(6.38 g, 55.0 mmol)。将反应混合物搅拌过夜。HPLC分析(柱Vydac 218TP54; 溶剂: A = 水/0.1% TFA和B = 乙腈/0.1% TFA; 梯度4-16% B经过20分钟; 流速1.0 ml/min; UV检测在214和284 nm)，显示原料完全转化为产物，保留时间18.3分钟。使溶液浓缩以得到定量收率的黄色浆。通过LC-MS (ES电离)分析产物，如预期地在335得到[MH]+。¹H (500 MHz)和¹³C (125 MHz) NMR光谱与结构一致。产物不再纯化即用于下一步。

17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸。

用H₂(g)-Pd/C (10%)还原17-叠氮基-5-氧代-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸(8.36 g, 25.0 mmol)在水(100 ml)中的溶液。进行反应直至LC-MS分析显示原料完全转化(柱Vydac 218TP54; 溶剂: A = 水/0.1% TFA和B = 乙腈/0.1% TFA; 梯度4-16% B经过20分钟; 流速1.0 ml/min; UV检测在214和284 nm, ES电离在335得到原料的M+H，在309得到产物的M+H)。将溶液过滤，直接用于下一步。

17-(Fmoc-氨基)-5-氧代-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸。

向上文17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七酸(对应于25.0 mmol氨基酸)的水溶液内加入碳酸氢钠(5.04 g, 60.0 mmol)和二氧六环(40 ml)。滴加Fmoc-氯化物(7.11 g, 0.275 mol)在二氧六环(40 ml)中的溶液。将反应混合物搅拌过夜。(旋转蒸发器)蒸发掉二氧六环，用乙酸乙酯萃取水相。通过添加盐酸酸化水相，将沉淀的材料萃取入氯仿内。将有机相干燥(MgSO₄)，过滤和浓缩以得到11.3 g (85%)黄色浆。通过LC-MS分析(柱Vydac 218TP54; 溶剂: A = 水/0.1% TFA 和B = 乙腈/0.1% TFA; 梯度40-60% B经过20分钟; 流速1.0 ml/min; UV检测在214和254 nm, ES电离如预期地得到在531的M+H，对于5,8分钟的产物峰)证实结构。分析显示副产物含量非常低，所述材料不再纯化即使用。

(步骤6b) ClCH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(PEG)₃-NH₂ 的合成。

使PEG单元与Rink Amide AM树脂人工偶联，从0.25 mmol规模开始，通过HATU活化介导。用1 mmol氨基酸盒在ABI 433A自动肽合成仪上组装其余的肽。在偶联之前用HBTU预活化氨基酸。用氯乙酸酐在DMF中的溶液使N-端胺基氯乙酰化30分钟。

在含有TIS (5 %)、H₂O (5 %)和苯酚(2.5 %)的TFA中从树脂同时脱除肽和侧链保护基团(除了tBu以外) 2小时。在后处理后获得322mg粗肽(分析HPLC: 梯度, 5-50 % B经过10分钟其中A = H₂O/0.1 % TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA; 柱, Phenomenex Luna 3µ C18(2) 50 x 4.6 mm; 流速, 2 ml/min; 检测, UV 214 nm; 产物保留时间, 6.37 min)。用质谱进行进一步产物表征：预期, M+H在1409, 实测, 在1415)。

(步骤6c) 硫醚环[CH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]- (PEG)₃-NH₂的合成。

使322 mg ClCH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(PEG)₃-NH₂溶于水/乙腈中。用氨溶液将混合物调节至pH 8并搅拌16小时。

在后处理后获得粗肽(分析HPLC: 梯度, 5-50 % B经过10分钟其中A = H₂O/0.1% TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA; 柱, Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50 x 4.6 mm; 流速,2 ml/min; 检测, UV 214 nm; 产物保留时间, 6.22 min)。用质谱进行进一步产物表征：预期, M+H在1373, 实测, 在1378)。

(步骤6d) 二硫化物[Cys^2-6]硫醚环[CH₂CO-Lys-Cys²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe- Cys]-(PEG)₃-NH₂的合成。

将硫醚环[CH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(PEG)₃-NH₂用茴香醚(200 µL)、DMSO (2 ml)和TFA (100 ml)的溶液处理60分钟，接着真空除去TFA，加入乙醚使肽沉淀。通过制备HPLC (Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250 x 21.20 mm柱)纯化70mg粗材料，用0-30 % B, 其中A = H₂O/0.1 % TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA进行, 经过40分钟，流速为10 ml/min。在冻干后获得46 mg纯材料(分析HPLC: 梯度, 0-30 % B经过10分钟其中A = H₂O/0.1 % TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA; 柱, Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50x 4.6 mm; 流速, 2 ml/min; 检测, UV 214 nm; 产物保留时间, 6.80 min)。用质谱进行进一步产物表征：预期, M+H在1258.5, 实测, 在1258.8)。

(步骤6e) 二硫化物[Cys^2-6]硫醚环[CH₂CO-Lys(螯合剂1-戊二酰基)-Cys²-Arg- Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-(PEG)₃-NH₂的合成。

使13 mg [Cys^2-6]环[CH₂CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-(PEG)₃-NH₂、9.6 mg螯合剂1A和8 µL NMM溶于DMF (0.5 ml)中。将混合物搅拌2小时30分钟。通过制备HPLC (Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250 x 21.20 mm柱)纯化反应混合物，使用0-30 %B, 其中A = H₂O/0.1 % TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA进行, 经过40分钟，以10 ml/min流速。在冻干后获得14.2 mg粗材料(分析HPLC: 梯度, 0-30 % B经过10分钟其中A = H₂O/0.1 %TFA和B = CH₃CN/0.1 % TFA; 柱, Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50 x 4.6 mm; 流速, 2ml/min; 检测, UV 214 nm; 产物保留时间, 7.87 min)。用质谱进行进一步产物表征：预期, M+H在1697.8, 实测, 在1697.9)。

实施例7：辐射防护剂的选择。

对于冷冻干燥试剂盒，评价三种辐射防护剂pABA、龙胆酸和抗坏血酸在放射性标记效率和放射性稳定化方面的效果。配方与配方A (见实施例9)相同，除了加入辐射防护剂和增加量的碳酸钠以维持pH接近9.3，见表2：

表2：辐射防护剂配方

pABA, μg/管瓶	龙胆酸, μg/管瓶	抗坏血酸, μg/管瓶	碳酸钠, μg/管瓶
				350	-	-	830
-	1000	-	1530
				-	-	500	930

配方A在重构后20分钟具有约90-91%的RCP，在4小时时下降至82-85%，在重构后8小时为75-82%。

含抗坏血酸的冷冻干燥试剂盒具有差的放射性标记效率——在重构后20分钟和4小时两者RCP都是80%。

含龙胆酸的冷冻干燥试剂盒显示良好的放射性标记效率，在重构后20分钟为94%，和良好的放射性稳定化作用，在重构后4小时RCP是90%。但是，一段时间后重构的试剂盒溶液变色(变为粉红色)。在溶液化学实验中观察到类似变色。

含pABA的冷冻干燥试剂盒显示良好的放射性标记效率，RCP稳定。在重构后20分钟和4小时两者RCP值都接近90%，甚至在重构后8小时也维持稳定性(见实施例8)。与配方A相比观察不到新的放射性杂质。

实施例8：辐射防护剂量的优化。

为了优化pABA在配方中的量，制备具有3种pABA水平[100至600 μg/管瓶]和2种pH水平[8.7至9.3]的析因设计。其它试剂盒组分的水平如配方A。碳酸钠水平用于调节pH。

表3 pABA优化研究的RCP结果

分析在表3显示的来自析因设计的结果，显示关于初始RCP和放射性稳定化能力的最佳pABA量为200至350 μg/管瓶。

另外两批分别具有200 μg (#9批次; 630 μg Na₂CO₃pH 9.3)和300 µg (#10批次; 800 μg Na₂CO₃ pH 9.3) pABA的材料，在初始时间点和稳定期间得到非常相似的RCP值。结果显示，关于放射性标记效率或放射性稳定化能力，含200和300 μg pABA的冷冻干燥试剂盒之间无显著差异。

实施例9：比较的冻干试剂盒配方。

如下制备冻干试剂盒，以比较现有技术的Edwards等 [Nucl.Med.Biol., 35,365-375 (2008)]的试剂盒和本发明的稳定化试剂盒：

表1：试剂盒配方

	配方A	配方C
			组分	每管瓶量(μg)	每管瓶量(μg)
Maraciclatide	75	75
			氯化亚锡二水合物	17.8	17.8
亚甲基二膦酸钠盐	90	90
			对氨基苯甲酸(pABA)钠盐	0	200
碳酸氢钠	1800	1800
			无水碳酸钠	530	630

实施例10：产生剂相容性研究。

已进行两项产生剂相容性研究以调查配方C的相容性。在第一项中研究的产生剂是：Technelite锝-99m，无菌产生剂[Bristol Myers Squibb Medical Imaging], Drytec锝-99m, 无菌产生剂[GE Heathcare, UK], Ultra-Technekow DTE产生剂[TycoHealthcare Mallinckrodt, USA]和ISOTEC Mo-99-Tc-99m, 无菌产生剂[AmershamHealth, Norway]。测试样品是配方C (实施例8的#9批次)。所有样品都用3.1 GBq/6 ml的产生剂洗脱液重构。研究的产生剂变量是产生剂龄(洗脱之间的时间)和洗脱液龄(洗脱后的时间)。

在这第一项研究中所有四种产生剂都与配方C相容。RCP值只有小差异，1.6%。对所有四种产生剂而言，洗脱液龄对RCP和重构后稳定性两者都具有负面效应。

实施例11：冷冻干燥试剂盒的稳定性。

对在不同温度[-20℃、5℃和25℃]贮存的几批试剂盒进行保存期限稳定性测试，在一些温度贮存至多12个月。测定在不同温度条件下贮存后的RCP。

配方A试剂盒

5°贮存12个月：在重构后4小时RCP为87%

25°贮存3个月：在重构后4小时RCP为87%

配方C试剂盒

5°贮存12个月：在重构后4小时RCP为91.7%

25°贮存3个月：在重构后4小时RCP为91.5%

25°贮存6个月：在重构后4小时RCP为>90%。

当在5℃贮存时配方C的保存期限为至少50个月，而配方A必须贮存于-20℃以确保充分的试剂盒RCP性能。

Claims

1.一种放射性药物组合物，所述组合物在生物相容性载体中包含

(i) ^99mTc-maraciclatide；

(ii) 辐射防护剂，其选自对氨基苯甲酸或其与生物相容性阳离子的盐；

采用适合哺乳动物给药的形式，

其中所述对氨基苯甲酸或其与生物相容性阳离子的盐的摩尔量为maraciclatide的28倍至85倍。

2.权利要求1的放射性药物组合物，其中辐射防护剂是对氨基苯甲酸钠。

3.权利要求1或权利要求2的放射性药物组合物，其中将放射性药物提供在注射器中。

4.权利要求1或权利要求2的放射性药物组合物，其中将放射性药物提供在配备封闭物的管瓶中。

5.一种用于制备权利要求1至4中任一项的放射性药物组合物的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i) Maraciclatide；

(ii)辐射防护剂，其选自对氨基苯甲酸或其与生物相容性阳离子的盐；

(iii)亚锡还原剂；

(iv)亚甲基二膦酸或其与生物相容性阳离子的盐，

6.权利要求5的试剂盒，其中将所有试剂盒组分一起冻干。

7.权利要求5或权利要求6的试剂盒，所述试剂盒进一步包含缓冲剂。

8.权利要求5至7中任一项的试剂盒，其中亚锡还原剂是氯化亚锡。

9.一种权利要求1至4中任一项的放射性药物组合物的制备方法，所述方法包括下列任一种：

(i)将权利要求5至8中任一项的试剂盒用生物相容性载体的供应来重构，接着将在生物相容性载体中的^99mTc的供应加至重构的试剂盒；或者

(ii)将权利要求5至8中任一项的试剂盒用在生物相容性载体中的^99mTc的供应来重构。

10.权利要求1至4中任一项的放射性药物组合物，其用于使哺乳动物体显像的方法。

11.权利要求1至4中任一项的放射性药物组合物，其用于使哺乳动物体显像的方法，所述方法包括使事先已给予放射性药物组合物的哺乳动物显像。

12.权利要求11的放射性药物组合物，其中哺乳动物患有其中表达整合素的疾病。