CN107362369A - 一种自组装叶酸靶向纳米药物载体及其制备方法 - Google Patents

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王英飒
何静
雷建都
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Abstract

本发明公布了一种自组装叶酸靶向纳米粒子的制备方法，包括：八臂聚乙二醇与齐墩果酸进行酯化反应，得到八臂聚乙二醇‑齐墩果酸的结合物；叶酸用NHS活化，与乙二胺反应；进一步与八臂聚乙二醇‑齐墩果酸的结合物利用酰胺键进行化学连接；将叶酸修饰的八臂聚乙二醇‑齐墩果酸结合物用透析除去杂质，过滤后冷冻干燥，自组装得到叶酸修饰的纳米药物载体粒子。该纳米粒子具有双层结构，外层为亲水的聚乙二醇，内层为疏水的药物齐墩果酸。本发明的优点：采用聚乙二醇大大提高了载药量；增大了齐墩果酸的水溶性、稳定性和半衰期；可以实现药物对肿瘤细胞的靶向作用以及肿瘤细胞内的pH敏感释放；操作简单。

Description

一种自组装叶酸靶向纳米药物载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种自组装叶酸靶向纳米药物载体的制备方法。
背景技术
癌症已成为危害人类健康的主要疾病，治疗癌症的重要手段之一是化学药物治疗，抗癌药物在挽救生命、维护人类健康发挥着重要作用。但是药物在发挥抗肿瘤活性的同时，往往对人体正常细胞带来一定损伤，产生较大的毒副作用。有些药物水溶性较差，在实际应用中受到限制，需要加入增加水溶性的辅助物质，这些增溶后的药物常会引起较强的过敏反应，影响药物的使用和治疗效果。目前，世界各国研究者正致力于寻求解决途径。
齐墩果酸是一种五环三萜类化合物，以游离或结合成苷的形式广泛分布存在于中草药中。据不完全统计，有超过190种植物中含有齐墩果酸，如白花蛇舌草、连翘、丁香、女贞子、大枣等。齐墩果酸具有抗HIV、抗菌、抗癌、抗溃疡、治疗骨质疏松症等广泛的药理作用和生物活性。然而，由于齐墩果酸抗炎和抗肿瘤的活性较弱，并存在着药代动力学指标未达到临床标准，水溶性差等缺陷，影响了其在临床上的应用。
通过采用亲水性的聚乙二醇来修饰难溶性的药物能极大的提高药物的溶解性及稳定性。药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化，通常是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白质、多肽、小分子药物和脂质体上。聚乙二醇(PEG)是一种分子量较低的水溶性聚醚，是迄今为止已知高分子中蛋白和细胞吸收水平最低的高分子，由于无毒及良好的生物相容性，PEG已被FDA批准为体内注射用高分子。聚乙二醇修饰的药物与未修饰的药物相比，具有以下突出的优点：(l) 溶解性提高；(2)对肿瘤有更强的被动靶向作用；(3)半衰期延长；(4)最大血药浓度降低；(5)血药浓度波动较小；(6)酶降解作用减少；(7)免疫原性及抗原性减小；(8)毒性降低；(9) 生物活性增强；(10)用药频率减少。
为提高药物对肿瘤细胞的选择性，减少对正常组织细胞的毒副作用，通过配体-受体介导的主动靶向药物传递系统已经成为癌症治疗研究的热点。叶酸即维生素B9，由蝶呤啶、对氨基苯甲酸与谷氨酸结合而成。叶酸具有分子量较小、价格便宜、易于修饰，既溶于水，又溶于有机溶剂等特点。在生理条件下，叶酸常以还原型存在，是真核细胞碳代谢和核苷合成所必须的维生素。它既参与核酸合成中嘌呤和嘧啶的合成，又构成含铁血红蛋白的成分。由于动物细胞缺乏叶酸生物合成的关键酶,故必须摄取和运用外源性的叶酸。
本发明的目的是建立一种叶酸靶向纳米药物载体粒子的方法，首先通过八臂聚乙二醇与齐墩果酸进行酯化反应，得到八臂聚乙二醇-齐墩果酸的结合物增大药物的溶解性、稳定性以及半衰期；进一步靶向分子叶酸修饰，提高对肿瘤细胞的选择性，减少对正常组织细胞的毒副作用；最后通过自组装形成叶酸靶向纳米药物载体粒子。
发明内容
本发明的目的是建立一种叶酸靶向纳米药物载体的制备方法，该药物载体粒子具有以下优点：载药量高；稳定性好；可实现药物对癌细胞的靶向传递及癌细胞内pH敏感性释放。
叶酸-聚乙二醇-齐墩果酸结合物通过自组装形成的靶向纳米药物载体粒子具有双层结构，外层为亲水性的八臂羧基聚乙二醇，进一步通过靶向分子叶酸修饰；内层为疏水的小分子药物齐墩果酸。
所述的叶酸-聚乙二醇-齐墩果酸结合物为以下结构，见附图1。
其中：聚乙二醇为八臂羧基聚乙二醇；
本发明的技术方案：
1)八臂聚乙二醇修饰齐墩果酸，见附图2；
2)叶酸修饰八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物，见附图3；
3)纳米粒子的制备
用沉淀法自组装制备纳米粒子。具体方法：将合成的叶酸-聚乙二醇-齐墩果酸聚结合物溶于DMSO中，逐滴加入到轻微搅拌水溶液中，纯水透析3h；过滤后，冷冻干燥得到靶向纳米药物粒子。
本发明的优点：
1)通过聚乙二醇的改性可以对齐墩果酸提供保护，提高了其水溶性，降低毒性；
2)延长了齐墩果酸在生物体内的半衰期，保证了药物的缓释；
3)工艺简单，易于操作。
具体实施方式：
下面给出的实例对本发明进行具体描述，但不限制本发明，本发明的范围由权利要求限定。
实施例1：
八臂聚乙二醇(10 KDa)-齐墩果酸结合物的合成：向干燥的三口瓶中持续通入N2；将0.5 g齐墩果酸，1.4 g八臂羧基聚乙二醇(Mw 10,000)溶于20 mL二氯甲烷中，再添加0.1 gEDC，0.13 g DMAP，0 ℃下搅拌溶解，搅拌反应1小时，然后室温搅拌反应24 h；待反应结束后，旋蒸除去溶剂，用冰乙醚沉淀，过滤后得到八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物粗品；用DMF/IPA (1:4 (v/v))重结晶，滤去不溶物，产物用乙醚沉淀，过滤，产物真空干燥，得到纯度95%以上的八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物；
叶酸-聚乙二醇-齐墩果酸结合物的合成：将22 mg 叶酸、19 mg EDC和12 mg NHS 溶于5 mL DMSO中在50 ℃ 下搅拌反应6 h；反应生成叶酸-NHS，在室温下加入25 mg吡啶和39mg 乙二胺，反应24 h；反应的产物加入过量的乙腈，产生沉淀；沉淀过滤然后用乙醚洗，真空干燥，得到黄色粉末即为叶酸-NHS。叶酸-NHS和1.3 g八臂聚乙二醇-齐墩果酸溶于20 mL的乙腈中，然后再加入19 mg EDC、1.5 mg DMAP和12 mg NHS，搅拌反应8 h；透析除去未反应的叶酸- NHS，冷干得到叶酸-聚乙二醇-齐墩果酸结合物；
纳米粒子的制备：用沉淀法来制备纳米粒子；将叶酸-聚乙二醇-齐墩果酸结合物溶解于少量DMSO中，逐滴加入到搅拌的水溶液中；然后将溶液移至透析袋中透析，冷冻干燥得到纳米药物载体粒子。
实施例2：
八臂聚乙二醇(20 KDa)-齐墩果酸结合物的合成：向干燥的三口瓶中持续通入N2；将0.5 g齐墩果酸，2.8 g八臂羧基聚乙二醇(Mw 20,000)溶于20 mL二氯甲烷中，再添加0.1 gEDC，0.13 g DMAP，0 ℃ 下搅拌溶解，搅拌反应1小时，然后室温搅拌反应24 h；待反应结束后，旋蒸除去溶剂，用冰乙醚沉淀，过滤后得到八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物粗品；用DMF/IPA (1:4 (v/v))重结晶，滤去不溶物，产物用乙醚沉淀，过滤，产物真空干燥，得到纯度95%以上的八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物；
叶酸-聚乙二醇-齐墩果酸结合物的合成：将22 mg 叶酸、19 mg EDC和12 mg NHS 溶于5 mL DMSO中在50 ℃ 下搅拌反应6 h；反应生成叶酸-NHS，在室温下加入25 mg吡啶和39mg 乙二胺，反应24 h；反应的产物加入过量的乙腈，产生沉淀；沉淀过滤然后用乙醚洗，真空干燥，得到黄色粉末即为叶酸-NHS。叶酸-NHS和2.6 g八臂聚乙二醇-齐墩果酸溶于20 mL的乙腈中，然后再加入19 mg EDC、1.5 mg DMAP和12 mg NHS，搅拌反应8 h；透析除去未反应的叶酸- NHS，冷干得到叶酸-聚乙二醇-齐墩果酸结合物；
纳米粒子的制备：用沉淀法来制备纳米粒子；将叶酸-聚乙二醇-齐墩果酸结合物溶解于少量DMSO中，逐滴加入到搅拌的水溶液中；然后将溶液移至透析袋中透析，冷冻干燥得到纳米药物载体粒子。
附图说明：
图1为叶酸-聚乙二醇-齐墩果酸结合物的结构式；
图2为八臂聚乙二醇修饰齐墩果酸的示意图；
图3为叶酸修饰八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物的示意图；
图4为实施例1制备的纳米药物载体的透射电镜图。

Claims (5)

1.一种自组装叶酸靶向纳米药物载体及其制备方法，其结构特征在于：由粒径为100～200 nm的纳米粒子组成，由叶酸-八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物通过自组装形成，所述的纳米药物载体粒子的制备步骤如下：
(1)八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物的制备：以齐墩果酸为原料，在N2保护下，将齐墩果酸、八臂聚乙二醇溶于二氯甲烷中，0 ℃下加入有机碱碳二亚胺(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为催化剂反应1小时，然后移至室温下反应24 h；待反应结束后，旋蒸除去溶剂，冰乙醚沉淀，过滤后得到八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物粗品；二甲基甲酰胺(DMF)–异丙醇(IPA)重结晶、过滤，冰乙醚沉淀过滤后真空干燥，然后得到纯度95%以上的八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物；
(2)叶酸利用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，然后在吡啶的作用下与乙二胺反应；最后与(1)所述的八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物进行化学连接，得到叶酸-八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物，进一步采用透析的方法除去杂质；
(3)采用沉淀法制备纳米粒子，将叶酸-八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，逐滴加入到轻微搅拌的水溶液中；然后将叶酸-八臂聚乙二醇-齐墩果酸结合物溶液移至透析袋中纯水透析3h，滤膜过滤后，冷冻干燥得到靶向纳米药物粒子。
2.根据权利要求1所述自组装靶向纳米药物载体粒子及其制备方法，其特征在于，所述的八臂聚乙二醇为八臂羧基聚乙二醇，分子量为10000~40000道尔顿。
3.根据权利要求1所述自组装靶向纳米药物载体粒子及其制备方法，其特征在于，所述的有机碱EDC和DMAP与齐墩果酸的摩尔比都为1:1。
4.根据权利要求1所述纳米药物载体粒子及其制备方法，其特征在于，所述的的DMF与IPA的比例为1:4。
5.根据权利要求1所述自组装靶向纳米药物载体粒子及其制备方法，其特征还在于，所述的纳米粒子具有双层结构，外层为亲水性的八臂聚乙二醇，内层为疏水的小分子药物齐墩果酸。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107970453A (zh) * 2017-12-05 2018-05-01 北京林业大学 一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法
CN112641762A (zh) * 2021-01-05 2021-04-13 吉林大学 一种八臂聚乙二醇齐墩果酸药物载体的纳米粒子及制备方法

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