CN1073572A - 一种液体发酵生产富含锗的灵芝菌丝体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用液体发酵生产富含锗的灵芝菌 丝体的方法。它采用吸收富集锗能力较强的灵芝属 的菌种作发酵菌株，通过逐级扩大培养，大量增殖灵 芝菌丝体。由于在发酵培养基中添加了8～12ppm (按重量计)的锗，从而获得了富含锗的发酵产物—— 灵芝菌丝体。该发酵产品可直接用作保健食品的添 加剂，也可提取出有效成分使用。

Description

本发明涉及微生物液体发酵领域。

微量元素锗（Ge）对人体健康影响极大。无机锗是很难被人直接利用和吸收的，只有存在于灵芝、人参、枸杞子等生物有机体中的锗才能很好地被人吸收利用。但上述生物有机体中锗的含量有限，且上述生物有机体的栽培比较麻烦，生长周期也较长，不适合于工业化大生产。而目前利用液体发酵（又称液体培养、深层发酵和深层培养）大量培养大型真菌的菌丝体工艺已很成熟。（中国专利CN  1034957A）这使迅速、经济地获得大量富含锗的有机体细胞成为可能。

本发明的目的就是利用液体发酵方法大量繁殖某些能吸收、富集锗元素，并为人体所食用的生物有机体细胞，如灵芝菌丝体，以解决人类食物结构中锗元素摄入不足的问题。

本发明所采用的工艺步骤如下：

一、发酵菌种的选择

已知一些名贵中药材如灵芝子实体、人参、枸杞子等的细胞中都含有一定数量的锗。这表明它们的细胞具有从环境中吸收、富集锗的能力。通过测定又得知这几种药材中以灵芝含锗量最高（是人参的3-6倍），说明灵芝细胞吸收锗的能力相对较强。另外灵芝属微生物中的大型真菌，它的菌丝体是可以通过液体发酵繁殖的，便于工业化大生产，因此我们选择了灵芝属的菌株作为发酵菌种。

二、锗源的选择、发酵培养基中锗元素的加入量及锗的测定

1.锗源的选择：单质锗（锗粉或锗块）或锗的化合物（如锗的氧化物及锗盐、锗酸），只要能直接溶于水或经过氧化剂或酸、碱处理后能溶于水的，都可选作为锗源。

如锗粉不溶于水，可用10%的过氧化氢在pH7-8的条件下促使其溶于水。

又如，二氧化锗有一定的溶解度，可直接溶于水形成一定浓度的溶液。也可用0.5～5.0N的氢氧化钠溶液溶解，或用1N的硫酸、酒石酸、草酸溶液溶解后配成一定浓度的溶液。

2.发酵培养基中锗元素的加入量：

根据含锗溶液锗元素的浓度，取一定体积的溶液，加入到发酵培养基中，使发酵培养基中按重量计锗元素的浓度为8ppm-12ppm。

3.锗的测定：采用日本岛津AA-670型原子吸收仪石墨炉原子吸收法测定。

三、液体发酵操作步骤如下：

a.菌种活化：将冷藏的菌种接种到斜面培养基上，于24-28℃温箱中培养活化7-10天，直到斜面长满菌丝为止。

要求斜面培养基中应含有适合灵芝菌丝体利用的碳源（如葡萄糖、蔗糖、淀粉、麦夫皮等）、氮源（如豆饼、蛋白胨、麦夫皮、铵盐等）、维生素（如酵母膏、V_B1）、钾和磷等。

b.一级摇瓶培养（500ml）：在500ml的三角瓶中装入100ml摇瓶培养基，灭菌后，冷却至室温，在无菌条件下移入斜面菌种，于24°-28℃摇床培养7-10天，摇床为往复式，每分钟振动100-200次。摇瓶培养基成份要求含有碳源（如葡萄糖、蔗糖、麦夫皮、马铃薯浸出液等）、氮源（如豆饼粉、麦夫皮浸出液、铵盐等）、钾离子及维生素（如V_B1等），PH6.0-6.5。

c.二级摇瓶培养（500ml）

在5000ml的三角瓶中装入1000-1500ml培养基（成份同“b”），灭菌，接入“b”培养物，然后于24°-28℃摇床培养2-3天。

d.一级种子罐培养菌种（50L）

在50L不锈钢种子罐中注入30-35L培养基（成份同“b”），实罐消毒后冷却至24°-28℃，利用压差法接入“c”培养物，然后通元菌空气（通气量为1∶0.3～0.6），培养温度为24°-28℃，搅拌转速100-200r.p.m，培养2天。

e.二级种子罐进一步增殖菌种（500L）

在500L罐中装入300L-350L培养基（成份同“b”），实罐消毒后冷却至24°-28℃，然后将一级种子罐培养物压入罐中，随后进行通气培养。通气比为1∶0.3-0.6，搅拌速度100-200r.p.m，温度为24°-28℃，时间为2天。

f.5000L发酵罐大量培养富锗菌丝体

发酵罐容积5000L，装料3000-3500L，培养基中碳源尽可能采用廉价原料，如淀粉、麦夫皮等，其它成份同“b”，PH6.0～6.5。实罐消毒后冷却至24°-28℃，然后从接种口以无菌操作注入含锗元素的溶液，使锗在发酵液总量中浓度达8-12p.p.m，开动搅拌几分钟，取样检查PH值，用稀硫酸或稀氢氧化钠溶液将PH值调到6.0-6.5，然后用无菌压缩空气将“e”培养物压入发酵罐，接着进行通气培养。培养温度、搅拌速度、通气比、发酵时间均同“e”。

g.菌丝体的收集与处理：

发酵醪用离心或板框压滤的方法收集菌丝体，并用无离子水洗去菌丝体表面吸附的无机锗，然后使菌丝于50°-70℃烘干，并粉碎到一定粒度（可过80-200目的铜筛网）。所得粉末即为含锗量达3000ppm以上的菌丝体。该产物可直接用作保健食品的添加剂。

本发明由于采用了适于工业化大生产的工艺路线，简单地将无机锗溶液加入到灵芝菌丝体的发酵培养基中，发酵培养基廉价易得，经过培养可迅速得到大量富含有机锗的灵芝菌丝体，并能为人食用。这与天然中草药灵芝子实体、人参、枸杞子相比，不仅在有机锗含量上还是在生产周期上皆具有明显优势。从而为人类更经济、迅速地获得富含锗的营养保健品提供了可能。

下面结合实施例，进一步说明本发明方法的技术与步骤。

实施例1：

一、菌种的选择：以大型真菌中灵芝属（Ganoderma）的灵芝种（G、lucidum）作为发酵菌株。

二、锗溶液的配制及发酵液中锗的含量：

选锗粉为锗源，按发酵液总体积3500L，锗浓度10ppm计，称出需加入锗粉的重量35克，用足量的10%过氧化氢溶解后，全部按步骤加入到5000L发酵罐中。

三、液体发酵的步骤：

a.菌种活化：将冷藏的灵芝种菌株接于试管斜面培养基上，于28℃培养10天，至斜面长满菌丝，待用。

斜面培养基成份：葡萄糖2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.2%，KH₂PO₄0.1%，琼脂2%，其余为自来水，PH自然。

b.在500ml的三角瓶中装入100ml摇瓶培养基（其成份为：葡萄糖2%，麦夫皮浸出液10%，硫酸铵0.2%，KH₂PO₄0.2%，PH6.3）。灭菌后冷却至室温，在无菌操作下接入斜面菌种。置于往复式摇床上以每分钟振动150次的频率在26℃下培养8天。

c.在5000ml三角瓶中装入1500ml摇瓶培养基（成份同实施例1中“b”），灭菌冷却后，在无菌室中接入上一步培养的菌液，然后在26℃于150p.p.m的往复式摇床上培养3天。

d.往50L不锈钢一级种子罐中注入35L种子罐培养基（成份同实施例1中“b”），实罐消毒后冷却至26℃，利用压差法接入前一步“c”的培养物，然后通入无菌空气，通气比是1∶0.5，搅拌转速150r.p.m，26℃下培养2天。

e.在500L二级种子罐中，装料350L（成份同实施例1中“b”），实罐消毒后，冷却至26℃，然后用无菌空气将一级种子罐培养物压入，通无菌空气培养，通气比为1∶0.5，温度26℃，搅拌速度150r.p.m，时间2天。

f.在5000L发酵罐中装入3500L发酵培养基（其成份为葡萄糖1.5%，麦夫皮浸出液10%，红薯粉0.5%，KH₂PO₄0.2%，（NH₄）₂SO₄0.2%，PH6.5），实罐消毒后冷却至26℃，然后从接种口以无菌操作注入该实施例配制的含锗溶液，使发酵培养基总量中锗含量达10p.p.m。开动搅拌几分钟，取样测PH为7.1，用0.05N硫酸溶液调至PH6.5，然后用无菌空气将二级种子罐中培养物压入，并进行通气培养，温度始终保持26℃，搅拌转速150r.p.m，通气比1∶0.5，培养2天。

g.将发酵醪泵入板框压滤机过滤除去水份，过滤完毕后再泵入少量70℃无离子水洗涤菌丝，当流出液中检查不出锗元素以后停止洗涤，用无菌压缩空气吹干滤饼，拆开板框收集滤饼，摊在搪瓷盘中用远红外线加热干燥，待水分降至5%以下停止加热。收集干菌丝，得到本发明方法生产的发酵产品，含锗3000ppm以上的灵芝菌丝体。将此干菌丝用粉碎机粉碎，过120目筛网，网下粉末可作为保健食品添加剂。

实施例2

除采用的锗源和菌种不同外，其余皆同实施例1。

该实施例采用灵芝属中的紫芝（G·joponicum），锗源用二氧化锗。由于二氧化锗在水中有一定的溶解度，所以可以固体形态直接投入发酵罐中。

Claims (6)

1、一种液体发酵生产富含锗的灵芝菌丝体的方法，该方法采用了担子菌纲(Basidiomycetes)、多孔菌科(Polyporaceae)、灵芝属(Ganoderma)的菌种为发酵菌株，采取菌种由斜面到三角瓶到种子罐到发酵罐逐级扩大培养的工艺步骤，实现灵芝菌丝体的大量增殖，本方法的特征在于在发酵罐的发酵培养基中添加了含锗元素的溶液，锗在培养基总量中的浓度按重量计为8ppm～12ppm。

2、按1所述的灵芝属的菌种，是灵芝种（G·lucidum）。

3、按1所述的发酵培养基中添加了含锗元素的溶液，锗在发酵培养基中的浓度按重量计为10ppm。

4、按1所述的含锗元素的溶液是由单质锗或锗的化合物直接溶于水配制而成，或者是经过氧化剂处理、酸处理、碱处理后溶于水配制而成。

5、按4所述的单质锗为锗粉。

6、按4所述的锗的化合物为二氧化锗。