CN107349439A - 一种正电子标记纳米探针及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种正电子标记纳米探针68Ga‑NOTA‑DGL‑PEG‑RGDyC及其制备方法，所述正电子标记纳米探针68Ga‑NOTA‑DGL‑PEG‑RGDyC具有很高的放化纯度、良好的体外稳定性和水溶性，有利于68Ga‑NOTA‑DGL‑PEG‑RGDyC在小鼠活体中的血液循环。本发明所述68Ga‑NOTA‑DGL‑PEG‑RGDyC的制备方法，通过合成树状大分子多聚赖氨酸衍生物NOTA‑DGL‑PEG‑RGDyC，并用正电子核素68Ga进行标记，探索了一条简单、快速、放化产率高的正电子标记纳米分子探针途径，为基因治疗、药物递释和生物成像提供了新的研究方向。

Description

一种正电子标记纳米探针及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及正电子标记纳米探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC及其制备方法与用途，属于医学领域。
背景技术
纳米材料由于其特殊的体积及结构使其具有一些特殊性质，例如表面活性好、低毒性、催化能力高以及不易受体内和细胞内各种酶降解等。纳米材料的种类非常丰富，用于分子影像学研究领域的纳米材料可分为有机和无机两大类，其中有机纳米材料包括树状聚合物、脂质体、胶团、铁蛋白等；无机纳米材料包括量子点、氧化铁、金纳米颗粒、超顺磁稀土离子等。树状大分子是1985年由美国密歇根化学研究所的Tomalia等和南佛罗里达大学的Newkome等几乎同时独立开发的一类新型高分子材料。从其诞生到现在，虽然只有短短的三十年，由于其新奇的结构、独特的性能和潜在的应用前景而备受关注。
树状大分子多聚赖氨酸(Dendrigraft poly-L-lysine，DGL)是近年来新开发的一种树枝状高分子，除了具备树枝状高分子的共有特性，如双亲性、内部空腔和荷正电性，还易于降解成生物可利用的氨基酸，具有良好的生物相容性，抗菌性，无免疫原，和低毒性。此外，由于结构不太拥挤，他们的树突状框架能够携带大量的分子物。例如DGL最近作为纳米磁共振成像造影剂(与钆配合物混合后)，作为穿越血脑屏障的基因递释载体，或通过脂质体和细胞膜转运，这些例子表明这类新型大分子可用于大部分树枝状大分子的应用开发如基因治疗、药物递释和生物成像。
近年来，68Ga标记多肽的正电子发射体已经开始展开应用。68Ga不依赖加速器生产，由68Ge/68Ga发生器制备，制备方法简便，能够在15min内达到95％以上的放射性标记产率，且68Ga的半衰期为67.6min，其核素性质优良，血液清楚较快，病人受到的辐射相对较少，因此近年来成为正电子药物研究的重点研究对象。对于树状大分子多聚赖氨酸中的放射性标记研究较少，因此本研究进行了68Ga对DGL标记方法的探讨。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺陷而提供一种新型的正电子标记纳米探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC，所述探针具有良好的稳定性和生物相容性，可在活体血液中循环、放化产率高，所述正电子标记纳米分子探针的制备方法简单、快速。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种正电子标记纳米探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC。
另外，本发明公开一种正电子标记纳米探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的制备方法，其采用68Ga对前体NOTA-DGL-PEG-RGDyC进行放射性标记，即得正电子标记纳米探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC。
优选的，所述正电子标记纳米探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的制备方法包括以下步骤：(1)取适量稀盐酸对锗-镓发生器进行淋洗，收集洗脱液，选取活度最大的洗脱液；(2)向步骤(1)所得的活度最大的洗脱液中加入醋酸钠溶液，调整pH，然后加入到NOTA-DGL-PEG-RGDyC醋酸钠缓冲液中；(3)将步骤(2)所得混合溶液进行避光反应，反应结束即得68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC。
优选的，所述步骤(1)中稀盐酸的浓度为0.05mol/L，对锗-镓发生器进行淋洗的淋洗流率1ml/min。
优选的，所述步骤(2)中醋酸钠溶液的浓度为1.0mol/L。
优选的，所述步骤(2)中调整pH到4.0-4.2。
优选的，所述步骤(3)中避光反应的条件为在70℃下避光反应10min。
优选的，所述前体NOTA-DGL-PEG-RGDyC的制备方法包括以下步骤：(1)将NHS-PEG-MAL和RGDyC溶解在醋酸钠缓冲液中，室温下避光反应；(2)将DGL G3溶于硼酸缓冲液中，搅拌至完全溶解；(3)将步骤(1)中溶解好的混合溶液与步骤(2)中溶解好的DGL G3溶液进行混合，室温下避光反应充分；(4)然后将步骤(3)所得混合溶液的pH调至7.0，加入过量β-巯基乙醇，室温下反应除掉未反应的MAL基团，超滤去除未反应的NHS-PEG-MAL及RGDyC，即得DGL-PEG-RGDyC溶液；(5)将NOTA-NHS溶于无水DMSO中充分溶解，然后加入步骤(4)中的DGL-PEG-RGDyC溶液，避光搅拌反应结束即得前体NOTA-DGL-PEG-RGDyC。
优选的，所述前体NOTA-DGL-PEG-RGDyC的制备方法还包括步骤(6)反应结束后在0.5mol/L、pH＝4.0的醋酸钠缓冲液中透析步骤(5)所得的前体，即可得到较纯的前体NOTA-DGL-PEG-RGDyC。
另一方面，本发明公开一种正电子标记纳米探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC作为正电子标记纳米探针在基因治疗、药物递释和生物成像中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明所述正电子标记纳米探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC具有很高的放化纯度、良好的体外稳定性和水溶性，有利于68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在小鼠活体中的血液循环。本发明所述68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的制备方法，通过合成树状大分子多聚赖氨酸衍生物NOTA-DGL-PEG-RGDyC，并用正电子核素68Ga进行标记，探索了一条简单、快速、放化产率高的正电子标记纳米分子探针途径，为基因治疗、药物递释和生物成像提供了新的研究方向。
附图说明
图1为DGL-PEG-RGDyC在水中的1H NMR谱结果，其中A为DGL 1H NMR谱，B为DGL-PEG1H NMR谱，C为DGL-PEG-RGDyC 1H NMR谱；
图2为NOTA-DGL、NOTA-DGL-PEG-RGDyC的马尔文纳米粒度电位仪检测结果，其中A为NOTA-DGL的检测结果，B为NOTA-DGL-PEG-RGDyC的检测结果；
图3为68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC纸层析法检测结果，其中A为PD10柱纯化前，B为PD10柱纯化后；
图4为68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC体外稳定性实验结果；
图5为68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在A459细胞及U87MG细胞内摄取及洗脱实验结果；
图6为68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在正常小鼠的体内生物学分布结果；
图7为68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在荷U87MG肿瘤鼠的体内生物学分布结果；
图8为68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC荷瘤裸鼠Micro-PET/CT显像，A为经尾静脉注射68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC后120min成像，B为瘤内注射68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC后120min成像，其中箭头所指为肿瘤。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。
1.材料与方法
1.1前体NOTA-DGL-PEG-RGDyC的合成
(1)DGL-PEG-RGDyC的合成。分别称取20mg NHS-PEG-MAL和2mg RGDyC，溶解在1mL醋酸钠缓冲液(0.1M pH≈6.0)，室温下避光搅拌反应5min。称量5mg的DGL G3溶于500μL的硼酸缓冲液(0.05M pH≈9.0)，充分溶解后与上述反应液混合，在室温下避光搅拌反应14h。反应结束后，将pH调至7.0，加入过量的β-巯基乙醇，室温下反应2h，以除掉未反应的MAL基团。反应结束后，通过超滤(MWCO 10000；4500rpm,15min,共8times)的方法去除未反应的NHS-PEG-MAL及RGDyC。
(2)NOTA-DGL-PEG-RGDyC的合成。称取4.3mg的NOTA-NHS溶于5mL的无水DMSO中，充分溶解后加入(1)中的DGL-PEG-RGDyC溶液，在室温下避光搅拌反应24h。反应结束后在0.5mol/L pH＝4.0的醋酸钠缓冲液中透析(3d,共换液5次)，得到浓度为1mg/mL的NOTA-DGL-PEG-RGDyC溶液。
1.2 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的制备
取0.05mol/L HCl 2.5ml对锗-镓发生器进行淋洗，流率1ml/min，收集洗脱液，每支0.5ml共5支。分别进行活度检测，选取活度最大的1支洗脱液，加入32.5μL 1.0mol/L醋酸钠溶液，将pH调整到4.0-4.2，然后加入200μL NOTA-DGL-PEG-RGDyC醋酸钠缓冲液中，70℃下避光反应10min，即得68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC。
1.3 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的鉴定和纯化
采用薄层纸层析法(Thin Layer Chromatography，TLC)对标记物进行鉴定,分离纯化采用PD10纯化柱。取1μL标记物点样，展开剂为0.9％的生理盐水。用0.01mol/L的PBS溶液25mL平衡PD10柱，加入500μL反应混合物，然后用5mL的0.9％生理盐水进行淋洗。取10个EP管，分别编号为1-10。每个EP管接淋洗液0.5mL。淋洗完毕后，测量每个EP管放射性活度，取放射性活度最高的淋洗液进行Radio-TLC测定放化纯度。若放化纯度＞99％，则进行体内外生物学实验。
1.4基本理化性质的测定
将制备的放射性纳米分子探针溶于PBS缓冲液中，目测观察其颜色、澄清度、透明度。取少量样品用标准pH试纸分析其pH值。
1.5脂水分配系数测定
取分离纯化后的68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC 10μL，分别加入三个EP管(含有0.5mL正辛醇及0.5mL 0.01mol/L的PBS缓冲液)中，密封后在室温下涡旋2min，3000r/min离心5分钟。用加样枪依次从3个EP管中取有机相及水相各10μL置于γ计数管中，进行γ计数，重复三次。用公式Log P＝Log(γ计数正辛醇/γ计数PBS)计算平均Log P值。
1.6 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的体外稳定性评价
取20μL(约2.03MBq)的68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC溶液，置于0.5mL的PBS缓冲液(pH＝7.4，0.01mol/L)，在37℃下孵育30min、60min、90min及120min后取100μL测定其放射化学纯度，以观察其在PBS缓冲液中的稳定性，重复三次。为测68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC溶液在小牛血清中的稳定性，亦在37℃下孵育30min、60min、90min及120min，之后用等体积的PBS稀释胎牛血清，密封后在室温下涡旋2min，1000r/min条件下离心5min，取上清液用Radio-TLC进行分析。
1.7 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在A549和U87MG细胞中的摄取和洗脱实验
(1)细胞摄取实验：在24孔板中每孔加入5×104个人肺腺癌细胞株A549或人脑胶质瘤细胞株U87MG，培养过夜后使细胞贴壁，隔天除去培养基，每孔加入3μL含26KBq 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的PBS溶液，空白对照组加入3μLPBS溶液(不含68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC)，分别在37℃下孵育20min、40min、80mim及120min后，每孔用0.5mL冰冻的PBS洗3次，然后用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化细胞，收集细胞悬液后用γ计数仪测量放射性计数。细胞摄取数据全部经过衰减校正后用细胞结合率即百分加入剂量表示，实验设三个平行，重复3次。
(2)细胞洗脱实验：在24孔板中每孔加入5×104个A549或U87MG，在37℃下与185KBq/孔的68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC共同孵育1h使其充分内在化。然后去培养基，用冰冻的PBS冲洗3次，再加入无血清培养液在37℃下孵育0min、20min、40min、80mim及120min。之后每孔用0.5mL冰冻的PBS冲洗3次，最后用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化细胞，收集细胞悬液后用γ计数仪测量放射性计数。细胞洗脱数据全部经过衰减校正后用细胞滞留率即百分加入剂量表示，实验设三个平行，重复3次。
1.8 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在正常小鼠的体内生物学分布
昆明小鼠禁食禁水12小时，分别对正常小鼠进行标记、分组(共12只，分为4组，每组3只)，对计数管进行标号及称重。注射器抽取50-75μL示踪剂，测放射性活度，将每支注射器进行编号，且编号与小鼠编号相一致。用2％异氟烷将小鼠麻醉，然后用酒精擦拭小鼠尾部，经尾静脉注射示踪剂。分别于注射示踪剂5min、30min、60min及120min后进行眼球取血，之后行断颈处死及主要器官(心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、胰、脑、肌肉、骨骼、皮毛)解剖，PBS缓冲液清洗干净晾干后分别置于相应编号的空计数管内。对所有装有脏器组织的计数管进行称重，脏器组织重量＝总重量-空计数管重量。用γ计数仪对装有脏器组织的计数管进行γ计数，经衰减校正后计算每克组织的放射性计数，用每克组织百分注射剂量(ID％/g)表示。
1.9 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在荷U87MG肿瘤鼠的体内生物学分布
在2％异氟烷麻醉状态下将每只荷U87MG肿瘤鼠通过尾静脉注射约1.85MBq(50μCi)的68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC。在注射显像剂1小时后经断颈处死荷U87MG肿瘤鼠，解剖并分离肿瘤和主要脏器，并将其放入空计数管后进行称重(总重量)，然后用γ计数仪测量放射性计数，肿瘤和正常脏器的放射性摄取用ID％/g表示，具体实验步骤如1.8。
1.10 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在荷U87MG肿瘤鼠的Micro-PET显像
荷U87MG荷瘤鼠在2％异氟烷麻醉下分别经尾静脉约1.85MBq(50μCi)的68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC，分别于注射显像剂15min、60min、120min后采集静态图像。在衰减校正后的全身冠状位图像上勾画肿瘤及主要脏器的感兴趣区，测量放射性摄取值，用％ID/g表示。PET显像结束后将动物行断颈处死，遵循动物福利原则。
2.结论
2.1 NOTA-DGL-PEG-RGDyC的表征
(1)DGL-PEG-RGDyC的表征。为验证DGL-PEG-RGDyC的成功合成，分别将DGL、DGL-PEG、DGL-PEG-RGDyC冻干产物各取3mg，溶于重水中，充分溶解后进行1H NMR谱检测。DGL在1HNMR谱(图1A)中，4.7ppm处代表水峰，1-1.8ppm处代表赖氨酸基团的3CH2，2.8ppm处代表epsilon CH2，4.1ppm处代表主链CH。而在DGL-PEG的1H NMR谱(图1B)中，3.4-3.6ppm处出现PEG的主峰(O-CH2-CH2)，6.2ppm处出现MAL的特征峰，说明DGL与NHS-PEG-MAL成功反应生成DGL-PEG。在DGL-PEG-RGDyC 1H NMR(图1C)谱中，PEG主峰仍存在，原MAL特征峰消失，在6.7-7.8ppm处出现新的小峰，说明DGL-PEG中的MAL基团成功与RGDyC的巯基反应，生成DGL-PEG-RGDyC。
(2)NOTA-DGL-PEG-RGDyC的表征。将合成产物NOTA-DGL、NOTA-DGL-PEG-RGDyC进行通过马尔文纳米粒度电位仪检测其在水中的粒径大小，结果如图2所示，NOTA-DGL的粒径大小为(35.02±1.53)nm，而NOTA-DGL-PEG-RGDyC的粒径大小为(139.3±16.9)nm，较NOTA-DGL较明显增大，说明NOTA-DGL-PEG-RGDyC成功合成。
2.2 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的标记及质量控制
如图3所示，68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的放化产率在50-75％之间,经PD10纯化柱分离纯化后放化纯度大于98％，pH值介于4.0-4.2之间为无色、透明、澄清的溶液，无其他重金属污染。将200μL的68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC探针经尾静脉注射正常KM小鼠体内(n＝3)，观察7天，均未出现KM小鼠死亡的现象，说明此纳米探针无明显毒性。
2.3脂水分配系数测定
脂水分配系数实验是为了测量其亲脂程度，经测定68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的LogP＝Log[(脂相γ计数-背景平均γ计数)/(水相γ计数-背景平均γ计数)]＝-3.04，说明此纳米分子探针呈亲水性。
2.4 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的Radio-TLC分析及体外稳定性实验
Radio-TLC分析结果显示，GaCl3的Rf值约为1，68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的Rf值为0.07。体外稳定性研究结果显示，其在0.01mol/L pH值7.4PBS溶液及小牛血清中静置2h，放化纯均>95％。上述实验表明，68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC具有较好的体外稳定性，标记化合物的比活度为30GBq/μmol。
2.5细胞摄取及洗脱实验
为测定68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的细胞结合及细胞滞留特性，分别用A549及U87MG进行细胞摄取及洗脱实验。结果表明A549及U87MG细胞能快速、高效地结合68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC，如图5所示，且随着孵育时间延长，显像剂对两种细胞结合力进一步增强，在孵育2h时达到高峰，且U87MG细胞的结合力高于A549细胞。在细胞洗脱实验中，68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在两种细胞中均表现为随时间的延长缓慢下降，其中在A549细胞中排泄一直较缓慢；而在U87MG细胞中前20min排泄较快，随后排泄缓慢，说明68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在细胞内排泄缓慢，而在2h末仍有显像剂滞留，且在U87MG细胞中的滞留高于A549细胞。
2.6 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在正常小鼠的体内生物学分布
68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在正常昆明小鼠的体内生物学分布结果如图6所示，结果显示：在注射显像剂后，血液的ID％/g随时间的延长而降低，特别是注射后5min与注射后30min对比明显，说明68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在血液中前30min的清除速度较快，随后清除速度减慢。在注射显像剂5min、30min、60min及120min后，放射性摄取主要聚集在肝脏和脾脏，且放射性摄取在肝脏和脾脏随着时间的延长有所升高，而在其他主要器官如心、肺、肾等随着时间的延长有所下降。说明68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC是通过肝脏代谢，而非经肾脏排泄。
2.7 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在荷U87MG肿瘤鼠的体内生物学分布
纳米分子探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在U87MG肿瘤鼠经尾静脉注射1小时后，其在肿瘤组织及主要脏器中的放射性摄取程度如图7所示，结果表明：注射显像剂1小时后，U87MG肿瘤组织摄取值为(0.27±0.09)ID％/g，低于其他主要脏器组织。显像剂在肝脏和脾脏放射性摄取较高，分别为(64.27±8.0)ID％/g及(12.90±4.95)ID％/g。
2.8 68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在U87MG荷瘤鼠的Micro-PET显像
通过Micro PET/CT显像可观察68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC在U87MG荷瘤鼠中的体内药代动力学特性，如图8所示，经尾静脉注射68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC后，显像剂主要分布在肝脏，其次是心脏，瘤结节未见明显摄取。在注射显像剂15min、60min及120min后瘤组织的摄取值ID％/g分别为(7.9±0.73)、(4.27±0.83)和(5.90±2.37)。而瘤内注射结果显示，显像剂68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC主要分布在瘤结节内，全身其他组织及脏器均未见明显摄取。在瘤内注射显像剂15min、60min及120min后，瘤组织的摄取值ID％/g分别是(192.6±57.3)、(195.2±47.0)及(183.9±48.5)。
3.结论分析
本发明通过合成了树状大分子多聚赖氨酸衍生物NOTA-DGL-PEG-RGDyC，并用正电子核素68Ga进行了成功标记，该方法探索了一条简单、快速、放化产率高的正电子标记纳米分子探针途径。在正常小鼠的体内生物学分布表明，68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC纳米分子探针在正常鼠体内主要分布于肝脏和脾脏，其次为肾脏、肺脏、心脏，其他主要器官未见明显放射性摄取。而在U87MG荷瘤鼠活体成像及体内生物学分布中也显示出纳米探针主要集聚于肝脏及脾脏，肿瘤内未见明显摄取。主要原因可能在于：1.68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC作为纳米探针，由于水动力学检测出纳米粒径为(139.3±16.9)nm，由于尺寸过大易于被网状内皮系统吞噬，因此造成肝脏内的大量摄取。2.可能由于68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC纳米探针的靶向性欠佳，可能是由于RGDyC的数量不够多造成靶向性较低，也有可能RGDyC本身对U87MG胶质瘤的靶向性低造成肿瘤摄取及成像效果不理想。
后期研究我们将从以下两方面进行改进：1.选取纳米尺寸较小的纳米分子作为载体，如PAMAM或氧化铁纳米等，使得修饰后的纳米尺寸适合在肿瘤部位积聚，最大可能减少肝、脾等网状内皮系统的摄取。2.进一步增加纳米探针的肿瘤主动靶向性，增加RGDyC的数量或使用可激活细胞穿膜肽ACPP等对脑胶质瘤具有更大靶向性的多肽
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质。

Claims (10)

1.一种正电子标记纳米探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC。
2.一种如权利要求1所述正电子标记纳米探针的制备方法，其特征在于，采用68Ga对前体NOTA-DGL-PEG-RGDyC进行放射性标记，即得正电子标记纳米探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC。
3.如权利要求2所述正电子标记纳米探针的制备方法，其特征在于，所述正电子标记纳米探针68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC的制备方法包括以下步骤：(1)取适量稀盐酸对锗-镓发生器进行淋洗，收集洗脱液，选取活度最大的洗脱液；(2)向步骤(1)所得的活度最大的洗脱液中加入醋酸钠溶液，调整pH，然后加入到NOTA-DGL-PEG-RGDyC醋酸钠缓冲液中；(3)将步骤(2)所得混合溶液进行避光反应，反应结束即得68Ga-NOTA-DGL-PEG-RGDyC。
4.如权利要求3所述正电子标记纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中稀盐酸的浓度为0.05mol/L，对锗-镓发生器进行淋洗的淋洗流率1ml/min。
5.如权利要求3所述正电子标记纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中醋酸钠溶液的浓度为1.0mol/L。
6.如权利要求3所述正电子标记纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中调整pH到4.0-4.2。
7.如权利要求3所述正电子标记纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中避光反应的条件为在70℃下避光反应10min。
8.如权利要求2所述正电子标记纳米探针的制备方法，其特征在于，所述前体NOTA-DGL-PEG-RGDyC的制备方法包括以下步骤：(1)将NHS-PEG-MAL和RGDyC溶解在醋酸钠缓冲液中，室温下避光反应；(2)将DGL G3溶于硼酸缓冲液中，搅拌至完全溶解；(3)将步骤(1)中溶解好的混合溶液与步骤(2)中溶解好的DGL G3溶液进行混合，室温下避光反应充分；(4)然后将步骤(3)所得混合溶液的pH调至7.0，加入过量β-巯基乙醇，室温下反应除掉未反应的MAL基团，超滤去除未反应的NHS-PEG-MAL及RGDyC，即得DGL-PEG-RGDyC溶液；(5)将NOTA-NHS溶于无水DMSO中充分溶解，然后加入步骤(4)中的DGL-PEG-RGDyC溶液，避光搅拌反应结束即得前体NOTA-DGL-PEG-RGDyC。
9.如权利要求8所述正电子标记纳米探针的制备方法，其特征在于，所述前体NOTA-DGL-PEG-RGDyC的制备方法还包括步骤(6)反应结束后在0.5mol/L、pH＝4.0的醋酸钠缓冲液中透析步骤(5)所得的前体，即可得到较纯的前体NOTA-DGL-PEG-RGDyC。
10.如权利要求1所述正电子标记纳米探针作为正电子标记纳米探针在基因治疗、药物递释和生物成像中的应用。
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