CN107340336A - 一种散结镇痛药品的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种散结镇痛药品的检测方法，该方法包括步骤：1)将散结镇痛药品与提取溶剂混合提取，制得供试品溶液；2)将供试品溶液进行液相色谱质谱检测，得到指纹图谱；3)根据所述指纹图谱，标准曲线和散结镇痛药品供试品的质量，得到供试品中14种成分的含量。本发明采用UPLC/Q‑TOF MS方法，采用正负离子全扫描模式，使得多种化合物得以有效区分，不仅能对散结镇痛药品的成分进行定性和定量检测，还能同时检测散结镇痛药品中14种不同类别的成分；本发明方法的样品处理操作简单、样品用量少、精密度高，准确快速、稳定性高、重复性好并且回收率高，能够作为目前有效的全面控制散结镇痛药品质量的检测方法。

Description

一种散结镇痛药品的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析领域，尤其涉及一种散结镇痛药品的检测方法。
背景技术
散结镇痛药品是由三七、龙血竭、浙贝母和薏苡仁组成的成方制剂，其功能软坚散结，化瘀定痛，主要用于痰瘀互结兼气滞所致的继发性痛经、月经不调、盆腔包块、不孕，子宫内膜异位症等疾病，在临床使用中对子宫内膜异位症有良好的疗效。散结镇痛药品中的主要成分有皂苷类、酚酸类、生物碱类及油脂类等成分，这些成分对散结镇痛药品的药效至关重要。为了能够更好的控制药品的质量，保证药物的临床疗效，检测散结镇痛药品相关成分，建立全面评价该药品质量的方法成为本领域研究的热点。
目前关于散结镇痛药品的质量控制方法主要有皂苷类成分的含量测定和指纹图谱研究、黄酮类成分的指纹图谱研究、酚酸成分的指纹图谱研究和多指标成分定量测定。但是现有技术所公开的这些质量控制手段需要对散结镇痛药品中成分采用不同的方法进行分类，再分别或分类进行测定，从而导致能够一次性同时检测的成分种类单一，并且往往数量较少，不能达到快速且高效地全面评价药品质量的目的；此外，现有检测方法的前处理过程通常比较复杂，耗费试剂和人力较大。
发明内容
为解决现有存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种散结镇痛药品的检测方法，本发明提供的检测方法采用UPLC/Q-TOF MS(超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱连用技术)进行正负离子切换，不仅能对散结镇痛药品的成分进行定性和定量检测，还能够一次性同时检测药品中的14种不同类别的主要化合物成分，可作为目前全面控制散结镇痛药品质量的有效方法之一。
本发明提供了一种散结镇痛药品的检测方法，该方法包括以下步骤：
1)将散结镇痛药品供试品与提取溶剂混合，进行提取并过滤，取滤液并加入内标溶液，制得供试品溶液；
2)将所述供试品溶液进行液相色谱检测和质谱检测，得到供试品溶液的指纹图谱，其中，所述液相色谱检测中的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A和B的体积百分数之和为100％，所述液相色谱检测采用梯度洗脱程序；
3)根据所述供试品溶液的指纹图谱，标准曲线和散结镇痛药品供试品的质量，得到散结镇痛药品供试品中14种成分的含量，其中，所述标准曲线是以对照品浓度为横坐标，以对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，进行线性回归,并以1/X2为加系权数制得。
优选的，步骤1)所述的提取为超声提取、回流提取或涡旋提取；更优选的为回流提取。
优选的，步骤1)所述的回流提取，其提取时间为1～3小时；更优选的， 提取时间为2小时。
优选的，步骤1)所述的提取溶剂为醇类溶剂或乙腈类溶剂；更优选的，所述醇类溶剂为甲醇，所述乙腈类溶剂为醋酸乙腈；最优选的，所述醇类溶剂为70％甲醇(体积比)。
优选的，步骤1)所述的提取溶剂的用量为15～50ml；更优选的，用量为25ml。
优选的，步骤2)所述的液相色谱检测中的流动相A为乙腈，流动相B为水或0.1％甲酸水，优选的，所述流动相B为0.1％甲酸水溶液；
优选的，步骤2)所述梯度洗脱程序为：
0～14min内，所述流动相A的体积百分数从12％上升至25％，所述流动相B的体积百分数从88％下降至75％；
14～25min内，所述流动相A的体积百分数从25％上升至35％～45％，所述流动相B的体积百分数从75％下降至55％～65％；
25～50min内，所述流动相A的体积百分数从35％～45％上升至65％～100％，所述流动相B的体积百分数从55％～65％下降至0％～35％。
更优选的，梯度洗脱程序为：
0～14min内，所述流动相A的体积百分数从12％上升至25％，所述流动相B的体积百分数从88％下降至75％；
14～25min内，所述流动相A的体积百分数从25％上升至35％，所述流动相B的体积百分数从75％下降至65％；
25～50min内，所述流动相A的体积百分数从35％上升至65％，所述流动相B的体积百分数从65％下降至35％。
优选的，所述液相色谱的色谱柱为：色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(柱长为100mm,内径为3.0mm，粒径为1.8μm)或Thermo Syncronis C18(柱长为100mm,内径为3.0mm，粒径为1.7μm)；更优选的色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(柱长为100mm,内径为3.0mm，粒径为1.8μm)。
优选的，所述液相色谱的流速为0.4ml·min-1；优选的，所述液相色谱柱温为柱温为25℃～35℃，更优选的，所述液相色谱柱温为30℃。
优选的，所述液相色谱检测的质谱条件：采用ESI源，0～12.6min，正离子模式，12.6～50min，负离子模式；毛细管电压4000V，雾化气压力45psi，干燥气流速10L/min，加热毛细管温度350℃，Skimmer 65V，质量数扫描范围m/z 100～2500，源内碎片电压135V～250V，优选的，源内碎片电压为210V。
本发明步骤3)根据所述的标准曲线是以对照品浓度为横坐标(X)，对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标(Y)，进行线性回归，并以1/X2为加权系数，求得回归方程从而制得；再根据步骤2)测定的散结镇痛药品供试品指纹图谱，按照标准曲线，计算得到散结镇痛药品供试品所含成分的含量。
本发明的检测方法制备上述供试品溶液，通过梯度洗脱进行液相色谱检测质谱鉴定，并根据散结镇痛药品的主要成分的指纹图谱和标准曲线，对各成分含量进行计算。其中，由于散结镇痛药品中存在较多的同分异构体，为了避免同分异构体对测定的干扰和化合物共流出造成离子竞争而使指标成分响应减小 的情况，本发明采用正、负离子全扫描模式，使用优选的流动相系统、洗脱程序、色谱柱和柱温，使得多种化合物得以有效区分，其反映在相应的化合物成分色谱峰形较好，且各色谱峰之间具有较好的分离度，便于计算相应的峰面积，从而全面检测散结镇痛药品各不同类型的成分的含量。本发明所述的检测方法其样品处理操作简单、样品用量少、精密度高，准确快速、稳定性高、重复性好并且回收率高，能够作为目前最有效的全面控制散结镇痛药品质量的检测方法之一。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的对照品溶液的指纹图谱；
图2为本发明实施例1得到的供试品溶液的14种成分的指纹图谱；
图3为本发明实施例1制得的混合对照品溶液与供试品溶液TIC图；
图4为本发明实施例2得到的待测溶液的指纹图谱；
图5为本发明实施例3得到的待测溶液的指纹图谱；
图6为本发明实施例4得到的供试品溶液的指纹图谱；
图7为本发明实施例5得到的供试品溶液的指纹图谱；
图8为本发明实施例6得到的供试品溶液的指纹图谱；
图9为本发明实施例7得到的供试品溶液的指纹图谱；
图10为本发明实施例8得到的供试品溶液的指纹图谱；
图11为本发明实施例9得到的供试品溶液的指纹图谱；
图12A为本发明实施例12使用Thermo Syncronis C18色柱得到的供试品溶液的在负离子模式模式下的色谱；
图12B为本发明实施例1使用Agilent Zorbax SB-C18色柱得到的供试品溶液在负离子模式下的色谱；
图13A分别为本发明实施例12使用Thermo Syncronis C18色柱得到的供试品溶液的在正离子模式下的色谱；
图13B为本发明实施例1使用Agilent Zorbax SB-C18色柱得到的供试品溶液在正离子模式下的色谱；
图14A为本发明实施例13使用的梯度洗脱程序得到的供试品溶液在负离子模式下的色谱；
图14B为本发明实施例14使用的梯度洗脱程序得到的供试品溶液在负离子模式下的色谱；
图14C是本发明实施例1使用的洗脱程序得到的供试品溶液在负离子模式下的色谱；
图15A为本发明实施例13使用的梯度洗脱程序得到的供试品溶液在正离子模式下的色谱；
图15B为本发明实施例14使用的梯度洗脱程序得到的供试品溶液在正离子模式下的色谱；
图15C是本发明实施例1使用的洗脱程序得到的供试品溶液在正离子模式下的色谱；
图16A为本发明实施例15使用的流动相系统进行梯度洗脱得到的供试品溶液在负离子模式下的色谱；
图16B是本发明实施例13使用的流动相进行洗脱，得到的供试品溶液在负离子模式下的色谱；
图16C为本发明实施例16使用的流动相系统进行梯度洗脱得到的供试品溶液，在负离子模式下的色谱；
图17A为本发明实施例15使用的流动相系统进行梯度洗脱得到的供试品溶液在正离子模式下的色谱；
图17B是本发明实施例13使用的流动相进行洗脱，得到的供试品溶液在正离子模式下的色谱；
图17C为本发明实施例16使用的流动相系统进行梯度洗脱得到的供试品溶液，在正离子模式下的色谱；
图18A为本发明实施例17使用25℃的色谱柱温得到的供试品溶液，在负离子模式下的色谱；
图18B是本发明实施例1使用的柱温30℃，得到的供试品溶液在负离子模式下的色谱；
图18C为本发明实施例18使用35℃的色谱柱温得到的供试品溶液，在负离子模式下的色谱；
图19A为本发明实施例17使用25℃的色谱柱温得到的供试品溶液，在正离子模式下的色谱；
图19B是本发明实施例1使用的柱温30℃，得到的供试品溶液在正离子模式下的色谱；
图19C为本发明实施例18使用35℃的色谱柱温得到的供试品溶液，在正离子模式下的色谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例涉及的方法如无特别说明，均为常规方法，材料可以采用实施例中所述的优选材料或其他任何商业市售产品。
本发明所述检测方法采用UPLC/Q-TOF MS对散结镇痛药品的14种不同类型的成分进行一次性同时检测，分离出散结镇痛药品中14种主要的活性成分，得到指纹图谱中各相应的活性成分的色谱峰的峰形较好且分离度高，便于计算色谱峰的峰面积从而计算各相应成分的含量，从而实现全面控制散结镇痛药品质量的目的，以下示范性地给出具体的相关做法。
本发明提供了一种散结镇痛药品的检测方法，包括以下步骤：
1)将散结镇痛药品供试品与提取溶剂混合，进行提取并过滤，取滤液并加入内标溶液，制得供试品溶液；
2)将所述供试品溶液进行液相色谱和质谱检测，得到供试品溶液的指纹图谱，其中，所述液相色谱检测中的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A和B的体积百分数之和为100％，所述液相色谱采用梯度洗脱程序完成；
3)根据所述供试品溶液的指纹图谱，标准曲线和散结镇痛药品供试品的质 量，得到散结镇痛药品供试品中14种成分的含量，其中，所述标准曲线是以散结镇痛药品供试品所含成分的对照品浓度为横坐标(X)，以相应的对照品的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标(Y)，进行线性回归，并以1/X2为加权系数，制得的线性曲线。
本发明方法使用上述步骤1)的技术方案制备供试品溶液，在散结镇痛药品供试品中精密加入醇类或乙腈类提取溶剂，进行成分提取并过滤，取上清液滤液加入相应的内标溶液，制得供试品溶液。本发明中所述提取试剂优选的采用甲醇，更优选的采用70％(体积比)甲醇；本发明提取方法优选的采用超声提取、回流提取或涡旋提取，更优选的采用回流提取；本发明所述提取溶剂用量优选的为15ml～50ml，更优选地为25mL；优选的，回流提取时间为1～3h，更优选的为2小时。本发明所述的内标物是根据14种待测样品成分分子结构进行选择的。
本发明对所述散结镇痛药品供试品的形态没有特殊的限制，对散结镇痛药品供试品溶液和提取溶剂的来源没有特殊的限制，可以市售购买，具体的，例如本发明可以采用江苏康缘药业股份有限公司的散结镇痛胶囊作为供试品。
本发明上述步骤2)中将得到的供试品溶液进行精密吸取，注入液相色谱仪进行液相色谱检测，其中进样量优选的为3μL。其中液相色谱中所述的流动相A为乙腈，所述流动相B为水或0.1％甲酸水，优选的，所述流动相B为0.1％甲酸水溶液；本发明中，所述的液相色谱检测的洗脱程序为梯度洗脱，所述洗脱程序具体为：
0～14min内，所述流动相A的体积百分数从12％上升至25％，所述流动相B的体积百分数从88％下降至75％；
14～25min内，所述流动相A的体积百分数从25％上升至35％～45％，所述流动相B的体积百分数从75％下降至55％～65％；
25～50min内，所述流动相A的体积百分数从35％～45％上升至65％～100％，所述流动相B的体积百分数从55％～65％下降至0％～35％。
更优选的，梯度洗脱程序为：
0～14min内，所述流动相A的体积百分数从12％上升至25％，所述流动相B的体积百分数从88％下降至75％；
14～25min内，所述流动相A的体积百分数从25％上升至35％，所述流动相B的体积百分数从75％下降至65％；
25～50min内，所述流动相A的体积百分数从35％上升至65％，所述流动相B的体积百分数从65％下降至35％。
本发明的色谱柱优选的使用：Agilent Zorbax SB-C18(柱长为100mm,内径为3.0mm，粒径为1.8μm)或Thermo Syncronis C18(柱长为100mm,内径为3.0mm，粒径为1.7μm)；更优选的使用Agilent Zorbax SB-C18(柱长为100mm,内径为3.0mm，粒径为1.8μm)色谱柱。
本发明所述流动相的流速优选为0.4ml·min-1；优选的，所述液相色谱柱温为柱温为25℃～35℃，更优选的，所述液相色谱柱温为30℃。
其中所述质谱检测的质谱条件为：采用ESI源，0～12.6min，正离子模式， 12.6～50min，负离子模式；毛细管电压4000V，雾化气压力45psi，干燥气流速10L/min，加热毛细管温度350℃，Skimmer 65V，质量数扫描范围m/z100～2500，源内碎片电压135V～250V，优选的，源内碎片电压为210V。
本发明方法上述步骤3)所述的标准曲线是将14种散结镇痛药品成分所对应的对照品，加入提取溶剂，配成特定质量浓度的混合对照品母液，分别稀释成不同浓度，并分别加入相应的内标溶液制成标准曲线溶液；再进行液相色谱和质谱检测，得到的14种对照样品相应的指纹图谱。以对照品浓度为横坐标(X)，以对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标(Y)，进行线性回归，并以1/X2为加权系数，求得回归方程，制作标准曲线。得到标准曲线后，本发明根据前述技术方案得到的供试品溶液的图谱，计算其各色谱峰的峰面积，将供试品溶液得到的各色谱峰的峰面积与内标峰面积之比带入标准曲线中Y值，求得X值即供试品溶液中各组分的质量浓度；再将供试品溶液中各组分的质量浓度乘以供试品溶液的体积，得到供试品溶液中各组分的质量；根据所述供试品溶液中各组分的质量和散结镇痛药品供试样品的质量，得到散结镇痛药品供试样品中所含组分的含量。
本发明所述计算色谱峰面积的方法没有特殊限制，可以使用本领域技术人员熟知的计算色谱峰面积的方法，如本发明优选的使用Agilent MassHunter软件进行计算。本发明优选的测定散结镇痛药品供试品中反映其药效质量的14种(白藜芦醇、7，4’-二羟基黄酮、紫檀茋、芹菜素、龙血素A、龙血素B、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1、贝母辛、贝母素乙和贝母素甲)主要成分的含量，从而实现散结镇痛药品的全面质量检测。
本发明检测方法测定的供试品溶液和对照品的稳定性、精密度良好，本发明方法具有良好的重复性，加样回收率良好准确性高，并且对散结镇痛药品供试品所含组分的测定具有高灵敏性。
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明提供的散结镇痛药品的检测方法进行详细描述，但不能将这些实施例理解为对本发明保护方法的限制。
以下实施例中，采用的仪器与试剂为：
Sartorius BSA224S-CW电子分析天平(德国赛多利斯公司)；
Mettler Toledo XP-6电子分析天平(德国梅特勒公司)；
KQ-250DB数控超声清洗仪(昆山超声仪器有限公司)；
Agilent 1290超高压液相色谱仪，Q-TOF检测器(安捷伦公司)；
Mili-Q超纯水仪(美国密理博公司)。
供试品：散结镇痛胶囊(江苏康缘药业股份有限公司)
对照品：贝母素甲、贝母素乙、贝母辛、人参皂苷Re(含量以92.7％计)、人参皂苷Rg1(含量以93.4％计)、人参皂苷Rd(含量以94.4％计)、人参皂苷Rb1(含量以92.9％计)、三七皂苷R1、7,4’-二羟基黄酮(含量以98.6％计)、龙血素A、龙血素B、白藜芦醇、芹菜素，上述对照品均购自中国食品药品检定研究院；紫檀茋(含量＞99％)，购自杭州广林生物医药科技有限公司。
内标物：延胡索乙素(含量以99.6％计)、汉黄芩素、知母皂苷BⅡ。均购自 中国食品药品检定研究院。
乙腈为色谱纯，默克公司；甲酸为色谱纯，RoE Scientific Inc；其它试剂均为分析纯。
实施例1
色谱条件：
色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(柱长为100mm,内径为3.0mm，粒径为1.8μm)；流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)梯度洗脱，线性洗脱程序如表1所示；流速：0.4ml·min-1；柱温：30℃；进样量：3μL。
表1：实施例1的梯度洗脱程序
质谱条件：
采用ESI源，0～12.6min，正离子模式，12.6～50min，负离子模式；毛细管电压4000V，雾化气压力45psi，干燥气流速10L/min，加热毛细管温度350℃，源内碎片电压：210V，Skimmer 65V，质量数扫描范围m/z 100～2500。
本发明检测的散结镇痛药品中14种主要化合物成分及选择的3个内标，其用于积分计算的提取离子信息见表2。
表2 14种化合物成分及3个内标提取离子信息
内标溶液的制备：
取内标物：延胡索乙素、汉黄芩素和知母皂苷BⅡ对照品适量，加入适量 70％甲醇，配成质量浓度分别114、192和536μg/ml的单标溶液。
标准曲线的制备：
分别取14种散结镇痛药品的对照品：白藜芦醇、7，4’-二羟基黄酮、紫檀茋、芹菜素、龙血素A、龙血素B、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1、贝母辛、贝母素乙和贝母素甲适量，加入适量70％甲醇，配成质量浓度分别为37.76、28.20、75.52、3.06、27.18、27.18、150.42、23.89、32.70、28.46、41.57、3.28、6.15、11.43μg/ml的混合对照品母液，再用70％甲醇倍倍稀释，共稀释6个浓度点。精密吸取每个浓度点对照品溶液900μl，按照表2所示分别在相应的对照品中精密加入相应的配制的内标溶液：延胡索乙素内标溶液10μl、汉黄芩素内标溶液50μl、知母皂苷BⅡ内标溶液10μl，混匀，得到标准溶液。
将得到的标准溶液按照本实施例的色谱条件和质谱条件进行测定，得到对照品溶液的指纹图谱(如图1所示)。
以对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标(Y)，对照品浓度为横坐标(X)，进行线性回归，并以1/X2为加权系数，求得回归方程(如表3所示)。
表3 14种化合物成分及3个内标的回归方程式
供试品溶液的制备：
取散结镇痛胶囊内容物适量，研细，取约0.25g，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂70％甲醇(体积比)25ml，称定重量，浸泡过夜，回流提取2h，放 冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液过0.22μm滤膜，精密量取续滤液900μl，分别精密加入制备的内标溶液：延胡索乙素内标溶液10μl、汉黄芩素内标溶液50μl、知母皂苷BⅡ内标溶液10μl，混匀待测。
将得到的供试品溶液按照本实施例的色谱条件和质谱条件进行测定，得到供试品溶液的14种成分的指纹图谱(如图2所示)。
根据得到的供试品溶液指纹图谱，以供试品各组分的峰面积与相应的内标峰面积之比，用制得的标准曲线计算供试品溶液中14种主要成分的含量。计算方法为：将得到的各色谱峰中指标成分峰面积与内标峰面积之比带入标准曲线中Y值，求得X值即供试品溶液中各组分的质量浓度；再将供试品溶液中各组分的质量浓度乘以供试品溶液的稀释倍数除以供试品取样量，计算结果见表4(表4示出了本发明实施例1～3得到的供试品溶液中主要成分的含量)。
本发明的检测方法对内标物做了优选使用，根据供试品成分分子结构，分别选用延胡索乙素、山奈素、芒柄花素、木犀草素、汉黄芩素、人参皂苷Ro和知母皂苷BⅡ为内标，根据内标保留时间及与供试品成分的分离度，发现延胡索乙素与供试品中贝母素甲、贝母素乙、贝母辛及其他化学成分无相互干扰，分离度良好，适合作为测定贝母素甲、贝母素乙和贝母辛的内标；汉黄芩素与供试品中白藜芦醇、7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、芹菜素和紫檀茋及其他化学成分无相互干扰，分离度良好，适合作为测定这6个成分的内标。知母皂苷BⅡ与供试品中人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1及其他化学成分无相互干扰，分离度良好，适合作为测定这5个皂苷类成分的内标。因此，本发明优选的使用胡索乙素、汉黄芩素和知母皂苷BⅡ作为检测溶液的内标使用(内标选择结果如表2所示)。
本发明的检测方法制得的混合对照品溶液与供试品溶液TIC图分别如图3A和图3B所示。
实施例2
采用实施例1相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例采用超声提取的方法替换实施例1中的回流提取的方法，本实施例超声提取方法为超声提取(250W,40KHz)1h。
检测结果如图4所示，图4为本发明实施例2得到的待测溶液的指纹图谱。
实施例3
采用实施例1相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例采用涡旋混合提取的方法替换实施例1中的回流提取的方法，本实施例涡旋提取方法为置涡旋混合器上涡旋10min。
检测结果如图5和表4所示，图5为本发明实施例3得到的待测溶液的指纹图谱，表4为本发明实施例1～3得到的供试品溶液中主要成分的含量。
表4实施例1～3使用三种提取方式分别测得供试品各成分含量(mg/g)
实施例4
采用实施例2相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例采用提取溶剂甲醇替换实施例2中的提取溶剂70％甲醇(体积比)，本实施例加入提取溶剂甲醇25ml。
检测结果如图6和表5所示，图6为本发明实施例4得到的供试品溶液的指纹图谱，表5为本发明实施例4～7得到的供试品溶液中主要成分的含量。
实施例5
采用实施例2相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据 得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例采用提取溶剂50％甲醇(体积比)替换实施例2中的提取溶剂70％甲醇(体积比)，本实施例加入提取溶剂50％甲醇25ml。
检测结果如图7和表5所示，图7为本发明实施例5得到的供试品溶液的指纹图谱，表5为本发明实施例4～7得到的供试品溶液中主要成分的含量。
实施例6
采用实施例2相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例采用提取溶剂甲醇-氯仿替换实施例2中的提取溶剂70％甲醇(体积比)，本实施例加入提取溶剂甲醇-氯仿(体积比4：1)混合溶液25ml。
检测结果如图8和表5所示，图8为本发明实施例6得到的供试品溶液的指纹图谱，表5为本发明实施例4～7得到的供试品溶液中主要成分的含量。
实施例7
采用实施例2相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例采用提取溶剂1％醋酸乙腈(体积比)替换实施例2中的提取溶剂70％甲醇(体积比)，本实施例加入提取溶剂1％醋酸乙腈25ml。
检测结果如图9和表5所示，图9为本发明实施例7得到的供试品溶液的指纹图谱，表5为本发明实施例4～7得到的供试品溶液中主要成分的含量。
表5.实施例4～7使用的提取溶剂分别测得供试品各成分含量(mg/g)
实施例8
采用实施例1相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例采用回流提取时间1h替换实施例1中的回流提取2h。
检测结果如图10和表6所示，图10为本发明实施例8得到的供试品溶液的指纹图谱，表6为本发明实施例8～9得到的供试品溶液中主要成分的含量。
实施例9
采用实施例1相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例采用回流提取时间3h替换实施例1中的回流提取2h。
检测结果如图11和表6所示，图11为本发明实施例9得到的供试品溶液的指纹图谱，表6为本发明实施例8～9得到的供试品溶液中主要成分的含量。
表6实施例8～9使用的回流提取时间分别测得供试品各成分含量(mg/g)
实施例10
采用实施例1相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例中使用提取溶剂70％甲醇的用量为15ml替换实施例1中使用用量25ml。
检测结果如表7所示，表7为本发明实施例10～11得到的供试品溶液中主要成分的含量。
实施例11
采用实施例1相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例中使用提取溶剂70％甲醇的用量为50ml替换实施例1中使用用量25ml。
检测结果如表7所示，表7为本发明实施例10～11得到的供试品溶液中主要成分的含量。
表7实施例10～11使用的提取溶剂用量分别测得供试品各成分含量(mg/g)
实施例12
采用实施例1相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例中使用Thermo Syncronis C18(柱长为100mm,内径为3.0mm，粒径为1.7μm)色谱柱替换实施例1中使用的Agilent Zorbax SB-C18(柱长为100mm,内径为3.0mm，粒径为1.8μm)色谱柱。
检测结果如图12和图13所示，图12A和图13A分别为本发明实施例12使用Thermo Syncronis C18色柱得到的供试品溶液的在负离子模式和正离子模式下的色谱；图12B和图13B分别为本发明实施例1使用Agilent Zorbax SB-C18色柱得到的供试品溶液在负离子模式和正离子模式下的色谱。本发明发现色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(柱长为100mm,内径为3.0mm，粒径为1.8μm)各色谱峰分离较好、峰形较好，作为本发明优选的色谱柱使用。
实施例13
采用实施例1相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例液相色谱检测中采用的梯度洗脱程序如表8所示，替换实施例1中的梯度洗脱程序。
表8：实施例13的梯度洗脱程序
检测结果如图14、图15所示，图14A和图15A分别为本发明实施例13使用的梯度洗脱程序得到的供试品溶液在负离子模式和正离子模式下的色谱；图14C和图15C分别是本发明实施例1使用的洗脱程序得到的供试品溶液在负离子模式和正离子模式下的色谱。
实施例14
采用实施例1相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例液相色谱检测中采用的梯度洗脱程序如表9所示，替换实施例1中的梯度洗脱程序。
表9：实施例14的梯度洗脱程序
检测结果如图14、图15所示，图14B图15B分别为本发明实施例14使用的梯度洗脱程序得到的供试品溶液在负离子模式和正离子模式下的色谱；图14C和图15C分别是本发明实施例1使用的洗脱程序得到的供试品溶液在负离子模式和正离子模式下的色谱量。
实施例15
采用实施例13相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例液相色谱检测中采用梯度洗脱的流动相为乙腈(A)-水(B)替换实施例13中的乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)进行洗脱。
检测结果如图16、图17所示，图16A和图17A分别为本发明实施例15使用的流动相系统进行梯度洗脱得到的供试品溶液，在负离子模式和正离子模式下的色谱；图16B和图17B分别是本发明实施例13使用的流动相进行洗脱，得到的供试品溶液在负离子模式和正离子模式下的色谱。
实施例16
采用实施例13相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例液相色谱检测中采用梯度洗脱的流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸水(含10mM乙酸铵)(B)替换实施例13中的乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)进行洗脱。
检测结果如图16、图17所示，图16C和图17C分别为本发明实施例16使用的流动相系统进行梯度洗脱得到的供试品溶液，在负离子模式和正离子模式下的色谱；图16B和图17B分别是本发明实施例13使用的流动相进行洗脱，得到的供试品溶液在负离子模式和正离子模式下的色谱。
实施例17
采用实施例1相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例液相色谱检测中色谱柱的柱温使用25℃替换实施例1中的柱温30℃。
检测结果如图18、图19所示，图18A和图19A分别为本发明实施例17使用的色谱柱温得到的供试品溶液，在负离子模式和正离子模式下的色谱；图 18B和图19B分别是本发明实施例1使用的柱温30℃，得到的供试品溶液在负离子模式和正离子模式下的色谱。
本发明实施例采用不同时间段进行正负离子切换扫描，柱温会影响色谱峰的出峰顺序和保留时间。由图18A和19A可见，色谱柱温为柱温为25℃时即能使化学成分同分异构体得到较好的分离，但液相色谱柱温为30℃时分离效果更好。
实施例18
采用实施例1相同的技术方案检测得到的供试品溶液的指纹图谱，并根据得到的指纹图谱计算色谱峰，并根据标准曲线计算供试品中14种主要成分的含量；不同的是，本实施例液相色谱检测中色谱柱的柱温使用35℃替换实施例1中的柱温30℃。
检测结果如图18、图19所示，图18C和图19C分别为本发明实施例18使用的色谱柱温得到的供试品溶液，在负离子模式和正离子模式下的色谱；图18B和图19B分别是本发明实施例1使用的柱温30℃，得到的供试品溶液在负离子模式和正离子模式下的色谱。
本发明实施例采用不同时间段进行正负离子切换扫描，柱温会影响色谱峰的出峰顺序和保留时间。由图18C和19C可见，色谱柱温为柱温为35℃时也能 使化学成分同分异构体得到较好的分离，但柱温为30℃时分离效果更好。
实施例19
以上按照实施例1～18的色谱条件进行检测，本发明由其结果发现，图谱中14种指标成分在正离子模式下均有较好的响应，负离子模式下贝母素甲、贝母素乙和贝母辛均无明显响应；正离子模式下除贝母素甲、贝母素乙和贝母辛外，其他化合物[M+H]+离子响应较小，大部分为[M+Na]+离子，选择[M+Na]+离子进行定量可能会不稳定。因此，在定量测定时，本发明优选的采用贝母素甲、贝母素乙和贝母辛为正离子模式测定，其他11个化合物选择负离子模式测定。
质谱条件：采用ESI源，0～12.6min，正离子模式，12.6～50min，负离子模式；毛细管电压4000V，雾化气压力45psi，干燥气流速10L/min，加热毛细管温度350℃，Skimmer 65V，质量数扫描范围m/z 100～2500。
在该质谱条件下，为了获得较好的离子传输效果，对源内碎片电压进行优化，本发明优选135V、175V、210V和250V。结果发现：源内碎片电压为135V和175V时部分化合物[M-H]-丰度较低而加和离子丰度较高；源内碎片电压为210V时，14种化合物成分除人参皂苷Rg1为[M+COOH]-离子外，其他化合物均为[M+H]+或[M-H]-离子，且响应均较好；源内碎片电压为250V时，部分化合物发生裂解，致使[M+H]+或[M-H]-响应较低。因此，本发明优选地使用源内碎片电压210V。
因此，本发明优选采用的质谱条件为：采用ESI源，0～12.6min，正离子模式，12.6～50min，负离子模式；毛细管电压4000V，雾化气压力45psi，干燥气流速10L/min，加热毛细管温度350℃，源内碎片电压：210V，Skimmer 65V，质量数扫描范围m/z 100～2500。
方法验证：
实施例20-线性范围考察
取散结镇痛药品的14种对照样品：白藜芦醇、7，4’-二羟基黄酮、紫檀茋、芹菜素、龙血素A、龙血素B、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1、贝母辛、贝母素乙和贝母素甲对照品适量，加入适 量70％甲醇，配成质量浓度分别为37.76、28.20、75.52、3.06、27.18、27.18、150.42、23.89、32.70、28.46、41.57、3.28、6.15、11.43μg/ml的混合对照品母液，再用70％甲醇倍倍稀释，共稀释6个浓度点。精密吸取每个浓度点对照品溶液900μl，分别精密加入实施例1配置的内标溶液：延胡索乙素内标溶液10μl、汉黄芩素内标溶液50μl、知母皂苷BⅡ内标溶液10μl，混匀，即得对照品溶液。
按实施例1的条件进行色谱和质谱测定得到相应的指纹图谱。
以得到的色谱中对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标(Y)，对照品浓度为横坐标(X)，进行线性回归，并以1/X2为加权系数，求得回归方程。
本发明14种主要化合物成分线性范围、回归方程和相关系数见表10。
实施例21-定量限和检测限
将实施例20制备的混合对照品溶液用70％甲醇稀释进行测定，已S/N＝10为定量限，S/N＝3为检测限，14种化学成分定量限与检测限见表10。
表10. 14种化学成分线性范围、回归方程、相关系数、定量限和检测限
实施例22-日内精密度和日间精密度试验
取同一对照品溶液(实施例20所述的混合对照品母液用70％甲醇稀释8倍)连续测定6次(日内精密度)，连续测定3天、每天连续测定2次(日间精密度)，以对照品峰面积与内标峰面积之比计算RSD值，结果见表11。
实施例23-溶液稳定性试验
取散结镇痛胶囊内容物适量，研细，取约0.25g，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂70％甲醇(体积比)25ml，称定重量，浸泡过夜，回流提取2h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液过0.22μm滤膜，精密量取续滤液900μl，分别精密加入制备的内标溶液：延胡索乙素内标溶液10μl、汉黄芩素内标溶液50μl、知母皂苷BⅡ内标溶液10μl，混匀。，分别于第0h、5h、10h、15h、20h进样测定，以对照品峰面积与内标峰面积之比计算RSD值，结果见表11。
表11. 14种化学成分精密度和溶液稳定性结果
实施例24-重复性试验
取散结镇痛胶囊内容物适量，研细，取约0.25g，共6份，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇溶液25ml，称定重量，浸泡过夜，回流提取2h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液过0.22μm滤膜，精密量取续滤液900μl，分别精密加入实施例1制备的内标溶液：延胡索乙素内标溶液10μl、汉黄芩素内标溶液50μl、知母皂苷BⅡ内标溶液10μl，混匀，制得供试品溶液。
按实施例1的条件进行色谱和质谱测定得到相应的指纹图谱。以供试品各组分的峰面积与内标峰面积之比用标准曲线进行计算，结果见表12。
表12. 14种化合物成分重复性试验结果
实施例25-加样回收率试验
取散结镇痛胶囊内容物适量，研细，取约0.125g，共6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品适量，再补加70％甲醇溶液至25ml，称定重量，浸泡 过夜，回流提取2h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液过0.22μm滤膜，精密量取续滤液900μl，分别精密加入实施例1制备的内标溶液：延胡索乙素内标溶液10μl、汉黄芩素内标溶液50μl、知母皂苷BⅡ内标溶液10μl，混匀，制得供试品溶液。
按实施例1的条件进行色谱和质谱测定得到相应的指纹图谱。
以供试品组分峰面积与内标峰面积之比用标准曲线进行计算供试品含量后，再按以下公式计算：
式中A为供试品所含被测成分量；
B为加入对照品量；
C为实测值。
表13加样回收率试验结果(n＝6)
以上方法验证的结果表明，本发明所述的检测方法稳定性精确度良好，重复性和准确性也均较好，回收率比较高，能够实现散结镇痛药品质量的全面检测。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种散结镇痛药品的检测方法，包括以下步骤：
1)将散结镇痛药品供试品与提取溶剂混合，进行提取并过滤，取滤液并加入内标溶液，制得供试品溶液；
2)将所述供试品溶液进行液相色谱检测和质谱检测，得到供试品溶液的指纹图谱，其中，所述液相色谱检测中的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A和B的体积百分数之和为100％，所述液相色谱检测采用梯度洗脱程序；
3)根据所述供试品溶液的指纹图谱，标准曲线和散结镇痛药品供试品的质量，得到散结镇痛药品供试品中14种成分的含量，其中，所述标准曲线是以对照品浓度为横坐标，以对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，进行线性回归制得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的提取为超声提取、回流提取或涡旋提取；优选的为回流提取。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的回流提取时间为1～3小时；优选的，回流提取时间为2小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的提取溶剂为醇类溶剂或乙腈类溶剂；优选的，所述醇类溶剂为甲醇，所述乙腈类溶剂为醋酸乙腈；更优选的，所述醇类溶剂为70％甲醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的提取溶剂的用量为15～50ml；优选的，用量为25ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的液相色谱检测中的流动相A为乙腈，流动相B为水或0.1％甲酸水，优选的，所述流动相B为0.1％甲酸水溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述梯度洗脱程序为：
0～14min内，所述流动相A的体积百分数从12％上升至25％，所述流动相B的体积百分数从88％下降至75％；
14～25min内，所述流动相A的体积百分数从25％上升至35％～45％，所述流动相B的体积百分数从75％下降至55％～65％；
25～50min内，所述流动相A的体积百分数从35％～45％上升至65％～100％，所述流动相B的体积百分数从55％～65％下降至0％～35％；
更优选的，梯度洗脱程序为：
0～14min内，所述流动相A的体积百分数从12％上升至25％，所述流动相B的体积百分数从88％下降至75％；
14～25min内，所述流动相A的体积百分数从25％上升至35％，所述流动相B的体积百分数从75％下降至65％；
25～50min内，所述流动相A的体积百分数从35％上升至65％，所述流动相B的体积百分数从65％下降至35％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述液相色谱的色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱或Thermo Syncronis C18柱；优选的为Agilent Zorbax SB-C18柱。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述液相色谱的流速为0.4ml·min-1，所述液相色谱柱温为柱温为25℃～35℃，优选的，所述液相色谱柱温为30℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述质谱检测的条件为：采用ESI源，0～12.6min，正离子模式，12.6～50min，负离子模式；毛细管电压4000V，雾化气压力45psi，干燥气流速10L/min，加热毛细管温度350℃，Skimmer 65V，质量数扫描范围m/z 100～2500，源内碎片电压135V～250V，优选的，源内碎片电压为210V。
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