CN107338204A - 一株枯草芽孢杆菌jk‑xz8及其在防治樱花根癌病中的应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌jk‑xz8及其在防治樱花根癌病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌JK‑XZ8及其应用，该菌株的分类命名为枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）JK‑XZ8，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号是：CCTCC NO：M 2017216，保藏日期：2017年4月27日，保藏地址：中国武汉武汉大学。该枯草芽孢杆菌JK‑XZ8对樱花根癌病菌生长有较强抑制作用；盆栽和田间试验表明，JK‑XZ8菌株显著抑制了樱花根瘤的形成，并能够促进樱花的生长。本发明的JK‑XZ8菌株培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用于防治樱花根癌病的前景。

Description

一株枯草芽孢杆菌JK-XZ8及其在防治樱花根癌病中的应用
技术领域
本发明属于植物保护领域，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌JK-XZ8及其在防治樱花根癌病中的应用。
背景技术
樱花(Cerasus Mill.)是我国重要的观赏花木，被广泛用于美化公园、小区、道路等绿地，多年来樱花苗木需求量大，产业市场前景广阔。根癌病(Crown Gall)是由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的一种世界范围的细菌性病害。该病寄主范围广可危害93个科，331个属，643个不同种的植物。患根癌病的植株表现叶黄，势弱，果实产量或观赏性下降，严重时能导致植株死亡。在欧洲、北美、非洲和亚洲的一些国家与地区普遍发生。在我国，主要分布在河北、辽宁、吉林、山东、浙江、福建和河南等省区。重茬苗圃发病率在20％—100％之间不等，有的甚至造成毁园。根癌病菌可长时间存活在土壤中，从植株的伤口侵入，随苗木的调运进行远距离传播，是土传加苗传的植物细菌性病害。
目前对樱花根癌病的防治主要靠加强植物检疫和栽培管理，这些措施只能起到局部的控制作用，因此，寻找一种经济、安全、有效的防治措施是当务之急，生物防治不失为重要的辅助手段，其中拮抗细菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用。
Kerr(1972)从土壤杆菌中分离得到放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)K84菌株，这是应用较早且有效的生物制剂。K84菌株本身无致瘤性，它的质粒可以合成一种细菌素Agrocin 84，抑制多种有致病性的菌株，而对非致病性的菌株则无影响。另外，它还可以通过与病原菌竞争附着位点而控制病原菌的侵入。K84菌株中的控制细菌素合成的质粒可以整合到病原菌细胞中，从而使病原菌对K84产生抗性。陈晓英(1986)等从山东啤酒花(Humulus lupulus)冠瘿瘤中分离出的HLB-2菌株，无致病性，能产生细菌素抑制根瘤。同年，南非Webster报道从南非李树(Prunus L.)冠瘿中分离到J73菌株，产细菌素，本身是致病菌，但对葡萄不致病，且可通过产细菌素来抑制葡萄根癌病的发生。王关林(2004)等以放射土壤杆菌K84为供试菌株，对其进行紫外诱变，筛选出高产细菌素的菌株WJK84-1，通过樱桃接瘤试验表明，WJK84-1菌株和其产生的细菌素均可抑制根瘤发生，抑瘤率达到83.4％左右。陈凡(2007)等利用水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)H2X菌株对葡萄根癌病进行了防治，防效达到80.2％。王树芳(2013)等通过平板对峙方法筛选出耐氰放线菌(Actinomycetes sp.)G-19，对桃树根癌病有较好防治效果。高之蕾(2015)等从桃树根际土壤分离出两株粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，对根癌病抑制率达90％以上。目前报道的根癌病生防菌株较多，但是以芽孢杆菌为材料来防治根癌病未见报道。
芽孢杆菌(Bacillus spp.)是一类好氧或兼性厌氧杆状菌，它能产生抗逆性的芽孢，是典型的革兰氏阳性菌。尽管发现芽孢杆菌已长达一个多世纪的时间，但是对它的研究仍有待进一步深入。目前，大多数的研究集中于寻找特定基因功能并在需要的物种中克隆或者通过诱变、基因工程等生物手段改造它；再有研究热点就是研究芽孢杆菌的抗菌物质。能产生抗菌物质的芽孢杆菌种类有：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.lichenifomis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、环状芽孢杆菌(B.cirulans)和短芽孢杆菌(B.brevis)等。鉴于芽孢杆菌种类丰富，寻找拮抗根癌病的菌株成为有效防治根癌病的生防途径之一。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株高效防治樱花根癌病的枯草芽孢杆菌JK-XZ8。本发明的另一目的是提供上述枯草芽孢杆菌JK-XZ8的应用。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢菌(Bacillus subtilis)JK-XZ8，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号是：CCTCC NO：M 2017216，保藏日期：2017年4月27日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
所述的枯草芽孢杆菌在拮抗樱花根癌病菌根癌土壤杆菌中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌在防治樱花根癌病中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌在促进樱花生长中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌的发酵液在拮抗樱花根癌病菌根癌土壤杆菌中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌的发酵液在防治樱花根癌病中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌的发酵液在促进樱花生长中的应用。
本发明提供的枯草芽孢杆菌，从樱花根际土壤筛选获得，其在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落圆或不规则形，奶油色或褐色，表明色暗，可以起皱；菌体直杆状，大小为1-3μm，常成短链；具椭圆形芽孢，且芽孢中生；革兰氏染色表现为阳性；甲基红试验、伴孢晶体、酪氨酸水解、卵黄试验呈阴性；V.P试验、淀粉水解、过氧化氢、柠檬酸盐试验均呈阳性。测得16SrDNA大部分序列1435bp，具体如SEQ ID No.1所示。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与JK-XZ8菌株相似性最高的是Bacillus subtilis同源性达到99％。构建进化树发现，JK-XZ8菌株与Bacillus subtilis同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近。
BIOLOG细菌自动鉴定系统以每种细菌形成各自特有的“代谢指纹”图谱为鉴定依据，选用四唑紫作为细菌能否利用供试碳源的指示剂，通过细菌对95种不同碳源的代谢情况鉴定菌种。与传统方法相比，该系统采用标准化程序，操作简便，自动化程度高，鉴定快速，且菌种数据库大，鉴定范围广，包括约2000种微生物，适合于环境、食品、工业、临床和动植物病原菌各类微生物的鉴定分析。通过BIOLOG系统对JK-XZ8菌株进行鉴定，该菌株在鉴定板培养16～24h时的读数相似值(SIM值)为0.625，大于0.50，符合BIOLOG系统关于理想结果的要求，而且鉴定结果的相似性(PROB)都为99％，因此该菌株利用BIOLOG系统，准确鉴定到了种，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，分类命名为：枯草芽孢杆菌(Bacilluscereus)JK-XZ8。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
1)枯草芽孢杆菌JK-XZ8为植物根际土壤细菌，对樱花根癌病菌抑制作用强，在植物病害生物防治中可起到重要的作用。该菌株具有对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；易于人工扩繁，便于生产应用；促进植物生长等优点，尤其是对樱花根癌病的防治具有重要意义。
2)枯草芽孢杆菌JK-XZ8培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1是枯草芽孢杆菌JK-XZ8对根癌土壤杆菌平板生长抑制情况图；图中，A是单接种樱花根癌病病原根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的带菌平板；B是在带病原菌平板上打孔接种的枯草芽孢杆菌JK-XZ8；
图2是枯草芽孢杆菌JK-XZ8在温室樱花苗上的防治效果图；图中，A是单接种根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；B是根癌土壤杆菌和枯草芽孢杆菌JK-XZ8混接；
图3是枯草芽孢杆菌JK-XZ8对田间樱花根系生长的影响图；图中，(A，a)是Agrobacterium radiobacter K84菌剂处理；(B，b)是枯草芽孢杆菌JK-XZ8处理；(C，c)是CK。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例中，
枯草芽孢杆菌JK-XZ8斜面保存方法为：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)：3g牛肉膏，5gNacl，10g蛋白胨，15g琼脂；4℃冷库长期保存。
枯草芽孢杆菌JK-XZ8活化方法为：牛肉膏蛋白胨(NB)：3g牛肉膏，5gNacl，10g蛋白胨；28℃恒温摇床180r/min摇培24h。
枯草芽孢杆菌JK-XZ8发酵液制备方法为：NB培养基(25L)：75g牛肉膏，125gNacl，250g蛋白胨)，以50L自动发酵罐(上海国强公司生产)，按5％接种量，28℃发酵24h。
枯草芽孢杆菌JK-XZ8菌悬液制备方法为：将发酵罐制备的发酵液和水1:5V/V稀释，制得菌悬液。
实施例1枯草芽孢杆菌JK-XZ8对樱花根癌病原根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)平板抑菌作用。
将NA琼脂培养基放入灭菌锅灭菌(121℃/20min)，待NA培养基冷却到50℃时，将活化的樱花根癌病原菌株与NA琼脂培养基按5％V/V均匀混合，制成带菌平板，每个平板用8mm打孔器打三个孔，每个孔中用移液枪注入50uL活化的枯草芽孢杆菌JK-XZ8，放入28℃恒温培养箱培养48h。观察JK-XZ8对病原菌生长的抑制情况(图1)，测量菌落直径，计算抑菌率。试验结果表明，枯草芽孢杆菌JK-XZ8对根癌土壤杆菌有较强的抑制作用，与对照相比，抑菌率达到82.6％(表1)。
表1 JK-XZ8对樱花根癌病病原菌的抑制
注：CK(A.tumefaciens)：病原菌单独培养；JK-XZ8+A.tumefaciens：枯草芽孢杆菌JK-XZ8和病原菌共同生长。
实施例2枯草芽孢杆菌JK-XZ8对温室樱花苗根癌病的防治效果。
将一年生樱花苗种植于灭菌土中，置于25℃温室培养15d，选取长势相近的樱花进行接种(每个处理18个重复)。每株樱花接樱花根癌病原菌(NA液体培养基，培养24h)2mL，接种斜面保存的枯草芽孢杆菌JK-XZ8于50mL锥形瓶中28℃/200rpm培养48h，测OD600nm值，用无菌水将蜡状芽孢杆菌稀释到浓度1×108cfu，制成菌悬液备用。用无菌手术刀于樱花主根划1cm创口，以无菌棉球吸取根癌土壤杆菌包裹于创口处；7d后用无菌移液管吸取10mL枯草芽孢杆菌JK-XZ8菌悬液紧贴樱花苗根系将其注入土壤，然后覆土填平至塑料盆。以单接根癌土壤杆菌的樱花苗作为发病对照，6个月后观察并统计樱花的发病率和病瘤直径。试验结果表明枯草芽孢杆菌JK-XZ8在温室樱花苗根癌病防治上有显著的效果(表2、图2)。
表2枯草芽孢杆菌JK-XZ8对温室樱花苗根癌病的防治效果
注：A.tumefaciens：单接种病原菌；A.tumefaciens+JK-XZ8：病原菌和拮抗菌混接。
实施例3枯草芽孢杆菌JK-XZ8对田间樱花根癌病的防治效果。
将枯草芽孢杆菌JK-XZ8活化，制备发酵培养基(25L：75g牛肉膏，125g氯化钠，250g蛋白胨)，以50L自动发酵罐(上海国强公司生产)按5％接种量发酵24h，制成的枯草芽孢杆菌JK-XZ8发酵液浓度约为1×108cfu，以10L无菌桶封装放4℃恒温冷藏室备用，并且购买市售对根癌病防效好的放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)K84菌剂(购自中国农业大学)作为防效对照。
田间防治试验首先选取三年生长势相似且感病的樱花(每个处理50株)，起根并去除根部土壤，用灭菌手工刀对樱花根部病瘤进行人工切除，伤口处用75％酒精消毒。将供试细菌发酵液与水1:5稀释(使土壤中细菌密度约为107cfu/mL)后加少量土拌成泥浆对伤口进行涂抹。种植一个月后，进行复施处理。复施：在每株樱花根部离主径20cm处挖15cm深土坑，将菌悬液(约107cfu/mL)以500mL/株灌根，之后覆土，以切瘤但不施用菌剂处理的樱花作为发病对照。6个月后起根调查不同处理樱花发病率。试验结果表明，相对于K84菌剂处理的樱花，JK-XZ8菌株处理的发病率更低(表3)，说明枯草芽孢杆菌JK-XZ8在田间樱花根癌病防治上有显著的效果。
表3田间不同处理樱花根癌病发病状况
实施例4枯草芽孢杆菌JK-XZ8对促进田间樱花生长的作用。
具体方法步骤同实施例3，处理6个月后测量樱花的树高(cm)和胸径(mm)，试验结果表明：相较于未施菌处理的樱花和K84菌剂处理的樱花，枯草芽孢杆菌JK-XZ8对樱花无论是树高还是胸径生长均有显著促进作用(图3、表4)。
表4枯草芽孢杆菌JK-XZ8对樱花生长的影响
实施例5：枯草芽孢杆菌JK-XZ8对苜蓿的接种试验。
将JK-XZ8接种到NB培养基中，28℃下震荡(180mrp)培养24h，用无菌水调节菌悬液浓度到109左右用于接种。参照Laura的方法(Laura et al.，2002)，将紫花苜蓿种子用98％浓硫酸浸泡20分钟(约10mL浸300颗种子)，用500mL灭菌水清洗4次，然后泡在60mL灭菌水中，32℃下震荡(150prm)浸种6～8小时，再清洗2次，换水后同样条件培养过夜。次日再用灭菌水清洗2次后(每次60mL水)，用无菌镊子将种子摆放到1％的水琼脂平板上等待接种，每皿摆放20粒种子。7d后将水琼脂平板上的苜蓿幼苗用接种针在子叶上刺一个小孔，取20mL准备好的菌悬液点在伤口处，每菌株接种3个重复，每重复20株幼苗，设2种CK处理，其中1个不作任何处理，另l个针刺接种无菌水。接种后的种子在37℃、70％相对湿度、定时光照(12h光照，12h黑暗)条件的人工气候箱中培养，7天后检查发病率。
苜蓿接种结果显示，无论是CK还是接种处理，均无发病症状(接种点附近坏死、黄化和根畸)出现。苜蓿是代替小白鼠作为测定Bcc对动物毒性的模式植物(Steve et al.，2003)，用苜蓿模型可简单快捷的检测出Bcc菌株对哺乳动物是否具有致病性。上述试验结果说明枯草芽孢杆菌JK-XZ8对哺乳动物没有毒害性。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 一株枯草芽孢杆菌JK-XZ8及其在防治樱花根癌病中的应用
<130> 100
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1435
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 1
gggtgctatc tgcaagtcga gcgaatggat taagagcttg ctcttatgaa gttagcggcg 60
gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc cataagactg ggataactcc gggaaaccgg 120
ggctaatacc ggataacatt ttgaactgca tggttcgaaa ttgaaaggcg gcttcggctg 180
tcacttatgg atggacccgc gtcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc 240
aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag 300
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gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagc 540
gcgcgcaggt ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat 600
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actccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960
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tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tgatcttagt tgccatcatt aagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga 1140
ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200
caatggacgg tacaaagagc tgcaagaccg cgaggtggag ctaatctcat aaaaccgttc 1260
tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320
atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga 1380
gagtttgtaa cacccgaagt cggtggggta acctttttgg agccagccgc gtaag 1435

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）JK-XZ8，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号是：CCTCC NO：M 2017216，保藏日期：2017年4月27日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在拮抗樱花根癌病菌根癌土壤杆菌中的应用。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在防治樱花根癌病中的应用。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在促进樱花生长中的应用。
5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵液在拮抗樱花根癌病菌根癌土壤杆菌中的应用。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵液在防治樱花根癌病中的应用。
7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵液在促进樱花生长中的应用。
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