CN107319004A - 外源蛋白酶在提高腐乳品质中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了外源蛋白酶在提高腐乳品质中的应用。本发明通过对在腐乳后酵阶段添加木瓜蛋白酶或皱胃酶的处理组与不加酶的对照组的pH、水分、总酸、氨基态氮、硬度和感官品质进行测定，评定外源蛋白酶的添加对腐乳成熟的影响。结果表明，在腐乳后酵过程中外源蛋白酶添加组的pH在第25d后均高于空白组；4％的木瓜蛋白酶、2％和4％的皱胃酶的添加可以使腐乳的氨基态氮含量显著增加；4％的木瓜蛋白酶和4％的皱胃酶的添加能够明显降低腐乳硬度；而且外源蛋白酶的添加还能改善腐乳的口感和内部颜色，提高香味和鲜味。本发明了解并研究了外源蛋白酶的添加对腐乳品质的影响，对酶促腐乳的工业化生产具有一定的指导意义。

Description

外源蛋白酶在提高腐乳品质中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及外源蛋白酶在提高腐乳品质中的应用。

背景技术

腐乳习惯上分为“红方”、“青方”、“白方”三种，是我国传统的发酵豆制品。因其味道鲜美，具有抗氧化和降血压等保健功能，深受消费者喜爱。腐乳发酵分为前酵和后酵，前酵是培养菌系和积累酶系的过程，一般为36-48h。后酵是酶系作用于腐乳毛坯的过程，时间较长，一般为3-6个月，发酵周期长，生产成本高，制约了其在我国的工业化生产。

近年来，针对缩短腐乳生产周期的研究较多，主要集中在对后酵进行处理。比如，加酶控温后酵，添加增香酵母、乳酸菌，高压电场和高频磁场处理等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提高腐乳品质、缩短腐乳生产周期。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了外源蛋白酶的新用途。

本发明提供了外源蛋白酶在如下a1)-a9)中任一种中的应用：

a1)提高腐乳品质；

a2)改善腐乳口感；

a3)改善腐乳内部颜色；

a4)提高腐乳香气和/或鲜味；

a5)降低腐乳硬度；

a6)增加腐乳氨基态氮含量；

a7)促进腐乳成熟；

a8)缩短腐乳生产周期；

a9)制备和/或生产腐乳；

为了解决上述技术问题，本发明又提供了外源蛋白酶在如下b1)-b9)中任一种中的应用：

b1)制备提高腐乳品质的产品；

b2)制备改善腐乳口感的产品；

b3)制备改善腐乳内部颜色的产品；

b4)制备提高腐乳香气和/或鲜味的产品；

b5)制备降低腐乳硬度的产品；

b6)制备增加腐乳氨基态氮含量的产品；

b7)制备促进腐乳成熟的产品；

b8)制备缩短腐乳生产周期的产品；

b9)制备生产腐乳的产品。

上述应用中，所述外源蛋白酶为木瓜蛋白酶或皱胃酶；

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品；所述产品的功能为如下a1) -a9)中任一种：

a1)提高腐乳品质；

a2)改善腐乳口感；

a3)改善腐乳内部颜色；

a4)提高腐乳香气和/或鲜味；

a5)降低腐乳硬度；

a6)增加腐乳氨基态氮含量；

a7)促进腐乳成熟；

a8)缩短腐乳生产周期；

a9)制备和/或生产腐乳。

本发明提供的产品的活性成分为木瓜蛋白酶或皱胃酶；

上述应用或产品中，

所述改善腐乳口感为改善腐乳口感细腻程度。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种腐乳的生产方法。

本发明提供的腐乳的生产方法包括在腐乳发酵的后酵阶段添加外源蛋白酶的步骤；所述外源蛋白酶为木瓜蛋白酶或皱胃酶。

上述方法中，所述木瓜蛋白酶或所述皱胃酶的添加量为腐乳毛坯中蛋白质含量的(1-5)％。在本发明的具体实施例中，所述木瓜蛋白酶或所述皱胃酶的添加量为腐乳毛坯中蛋白质含量的1％或2％或4％。所述后酵阶段是指后期发酵阶段。

上述方法在如下1)-8)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

1)提高腐乳品质；

2)改善腐乳口感；

3)改善腐乳内部颜色；

4)提高腐乳香气和/或鲜味；

5)降低腐乳硬度；

6)增加腐乳氨基态氮含量；

7)促进腐乳成熟；

8)缩短腐乳生产周期。

本发明通过对在腐乳后酵阶段添加木瓜蛋白酶或皱胃酶的处理组与不加酶的对照组的pH、水分、总酸、氨基态氮、硬度和感官品质进行测定，评定外源蛋白酶的添加对腐乳成熟的影响。结果表明，在腐乳后酵过程中外源蛋白酶添加组的pH在第25d 后均高于空白组；外源蛋白酶的添加对腐乳的水分和总酸变化的影响不明显；4％的木瓜蛋白酶、2％和4％的皱胃酶的添加可以使腐乳的氨基态氮含量显著增加；4％的木瓜蛋白酶和4％的皱胃酶的添加能够明显降低腐乳硬度；而且外源蛋白酶的添加还能改善腐乳的口感和内部颜色，提高香味和鲜味。本发明了解并研究了外源蛋白酶的添加对腐乳品质的影响，对酶促腐乳的工业化生产具有一定的指导意义。

附图说明

图1为不同浓度木瓜蛋白酶处理的腐乳pH在后酵过程中的变化。

图2为不同浓度皱胃酶处理的腐乳pH在后酵过程中的变化。

图3为不同浓度木瓜蛋白酶处理的腐乳水分含量在后酵过程中的变化。

图4为不同浓度皱胃酶处理的腐乳水分含量在后酵过程中的变化。

图5为不同浓度木瓜蛋白酶处理的腐乳总酸含量在后酵过程中的变化。

图6为不同浓度皱胃酶处理的腐乳总酸含量在后酵过程中的变化。

图7为不同浓度木瓜蛋白酶处理的腐乳氨基态氮含量在后酵过程中的变化。

图8为不同浓度皱胃酶处理的腐乳氨基态氮含量在后酵过程中的变化。

图9为不同浓度木瓜蛋白酶处理的腐乳硬度在后酵过程中的变化。

图10为不同浓度皱胃酶处理的腐乳硬度在后酵过程中的变化。

图11为腐乳感官评价。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的腐乳是中国北方某腐乳生产企业的产品。

下述实施例中的皱胃酶和木瓜蛋白酶是帝斯曼中国有限公司的产品；甲醛和硝酸银是广东汕头市西陇化工厂的产品；氢氧化钠是北京化工厂的产品；铬酸钾是天津市大茂化学试剂厂的产品。

下述实施例中的DHG-9053A电热恒温干燥箱是上海-恒科学仪器有限公司的产品；DHP-9052电热恒温培养箱是上海-恒科学仪器有限公司的产品；BSA2202S分析天平是德国赛多利斯公司的产品；PB-21pH计是德国赛多利斯公司；FTC质构仪是北京盈盛恒泰科技有限公司的产品。

实施例1、外源蛋白酶的添加对腐乳品质的影响

一、试验方法

1、酶促腐乳的制备

(1)将腐乳毛坯(尺寸为3.2cm×3.2cm×1.6cm)在30℃条件下发酵48h后，装于已灭菌的玻璃瓶中，每瓶12块，总质量约160g，得到前酵腐乳。

(2)按照腐乳质量和汤料为1:1的比例，向每瓶中加入160mL汤料(购自北京市王致和腐乳厂)，然后再分别加入蛋白酶，根据添加的蛋白酶和添加量的不同，分为如下处理组：

1％木瓜蛋白酶处理组：木瓜蛋白酶的添加量为腐乳毛坯中蛋白质含量的1％(质量分数)；

2％木瓜蛋白酶处理组：木瓜蛋白酶的添加量为腐乳毛坯中蛋白质含量的2％(质量分数)；

4％木瓜蛋白酶处理组：木瓜蛋白酶的添加量为腐乳毛坯中蛋白质含量的4％(质量分数)；

1％皱胃酶处理组：皱胃酶的添加量为腐乳毛坯中蛋白质含量的1％(质量分数)；

2％皱胃酶处理组：皱胃酶的添加量为腐乳毛坯中蛋白质含量的2％(质量分数)；

4％皱胃酶处理组：皱胃酶的添加量为腐乳毛坯中蛋白质含量的4％(质量分数)。

上述腐乳毛坯中蛋白质含量是指腐乳毛坯中粗蛋白质的含量，粗蛋白含量的检测方法为凯氏定氮法。本发明的腐乳毛坯中粗蛋白质的含量为25％(质量分数)。

加入酶制剂后密封玻璃瓶，于28℃条件下进行后酵培养，分别得到酶促腐乳。每个处理组的酶促腐乳制作3个平行样。同时以不添加任何蛋白酶作为空白组。

2、取样

每个酶促腐乳样品于后酵5d、10d、15d、20d、25d、30d、35d、40d时，取 3块用于理化分析和感官评价。

3、理化指标的测定

分别检测每个酶促腐乳样品的如下理化指标：pH、水分含量、总酸、氨基态氮、硬度。检测方法如下：pH：精确称取样品3.000g，加入蒸馏水27mL，高速匀浆后，用pH计测定悬浮液的pH值。水分含量：采用常压恒重法，具体步骤参照SB/T 10170-2007中的方法。总酸：采用滴定法，具体步骤参照SB/T 10170-2007中的方法。氨基态氮：采用甲醛滴定法，具体步骤参照SB/T 10170-2007中的方法。硬度：利用质构仪测定，具体参数：探头型号P/0.5，测前下压和测试速度为60mm/min，压缩比例为30％，触发力为2.5N。

4、感官评价

采用定量描述对每个酶促腐乳样品的进行感官评价。具体步骤如下：选定11名感官评价人员，采用5分制，结合SB/T 10170-2007中的感官评定要求制定评分标准，评分标准具体如表1所示。

表1、腐乳感官评分标准

项目	分数
		1块形完整	完整5分/膏状1分
2质地硬度	适中5分/过于坚硬或柔软1分
		3口感细腻/粗糙	细腻5分/粗糙1分
4外部颜色	鲜红色5分/暗色或毛坯色1分
		5内部颜色	乳黄色5分/乳白色1分
6主要香气毛坯味/腐乳香气	腐乳香气5分/毛坯气味1分
		7鲜味	鲜度高5分/无鲜味或鲜度不高1分
8苦味	无苦味5分/有苦味1分

二、实验结果

1、发酵过程中样品pH的变化

发酵过程中样品pH的变化如图1和图2所示。由图1和图2看出：腐乳后酵过程中pH值总体呈下降趋势，空白组中，pH值在第5d明显下降，之后保持稳定，在第25d再次下降后保持平稳，最低达到6.39。木瓜蛋白酶处理组中，pH值在第0d 至第20d的变化趋势与空白组基本保持一致，第25d时4％木瓜蛋白酶处理组pH 值下降至6.51后保持稳定，但是高于空白组，1％和2％木瓜蛋白酶处理组pH值均在第30d显著下降之后略有升高，第40d时分别达到6.50和6.54。皱胃酶处理组中， 1％皱胃酶处理组的pH值在第5d下降明显，至第25d保持下降趋势，之后略有升高。2％和4％皱胃酶处理组的pH值在第25d之前与空白组变化趋势基本保持一致，之后保持稳定，但pH值始终高于空白组。

引起腐乳在发酵过程中pH降低的主要原因是乳酸菌等微生物发酵产生乳酸、醋酸、琥珀酸等有机酸、蛋白质分解后酸性氨基酸的释放、碳水化合物和脂肪酸的分解。 pH升高则是由于蛋白质分解产生氨基酸，氨基酸进一步脱氨基作用产生氨。加入木瓜蛋白酶或皱胃酶的实验组中，木瓜蛋白酶和皱胃酶的添加加速了腐乳中蛋白质的分解，产生了比空白组更多的游离氨基酸和氨，因此在处理25d后木瓜蛋白酶组和皱胃酶组的pH值高于空白组。

2、发酵过程中样品水分含量的变化

发酵过程中样品水分含量的变化如图3和图4所示。由图3和图4看出：腐乳后酵过程中水分含量总体呈缓慢上升趋势，空白组水分含量在第5d时下降后呈上升趋势，达到63.2％，第15d至第30d，呈下降趋势后上升。木瓜蛋白酶处理组中，相比于空白组不同的是，在第15d时腐乳中水分含量仍呈缓慢上升趋势，除1％木瓜蛋白酶处理组的水分含量在第25d后逐渐降低，其余处理组水分含量均趋于稳定。皱胃酶蛋白酶处理组中，腐乳水分含量变化趋势总体与空白组一致，其中1％皱胃酶处理组的水分含量在第25d后有较大的波动。根据SB/T 10170-2007《腐乳》，在后期发酵结束后，成品腐乳的水分含量≤72％即符合标准，本发明的木瓜蛋白酶处理组或皱胃酶处理组发酵得到的腐乳均符合标准。

腐乳前期发酵结束后水分含量为45％左右，在腐乳后酵阶段，随着汤料中水分的迁移，其水分含量迅速上升。本发明中的蛋白酶处理组与空白组存在差异，其主要原因是木瓜蛋白酶和皱胃酶使腐乳表面覆膜蛋白质水解为肽、氨基酸等小分子物质，增加了腐乳的渗透性，促进了水分的迁移。

3、发酵过程中样品总酸的变化

发酵过程中样品总酸的变化如图5和图6所示。由图5和图6看出：腐乳后酵中总酸总体呈上升趋势，然后趋于稳定。参照SB/T 10170-2007《腐乳》，成品红腐乳总酸含量标准规定≤1.3g/100g，本发明中空白组、木瓜蛋白酶处理组和皱胃酶处理组均符合标准。其中空白组中，总酸含量在后酵阶段第0d至第20d迅速上升，在第20d 至第30d时存在明显的下降，之后呈先上升后下降的趋势。木瓜蛋白酶处理组中，第 10d至第25d时总酸的含量和上升速率都低于空白组，其中4％木瓜蛋白酶处理组的总酸含量在第20d至第25d之间下降后缓慢上升，第40d时总酸含量到达0.59mg/100 g左右，与空白组一致。1％和2％木瓜蛋白酶处理组均基本呈上升趋势，而1％木瓜蛋白酶处理组在第40d时呈下降趋势，下降至0.54mg/100g。皱胃酶处理组中，除4％皱胃酶处理组在第25d至第30d时明显上升后，迅速降低以外，1％和2％皱胃酶处理组的腐乳总酸含量变化趋势基本与空白组一致，发酵前20d迅速上升，在第20d后缓慢下降。

腐乳在后酵过程中，总酸含量上升的主要原因为汤料的灌入使得腐乳瓶中呈缺氧状态，产生乳酸。并且微生物大量分泌淀粉酶和脂肪酶，将腐乳中的碳水化合物和脂肪水解为有机酸和脂肪酸等物质，从而使得腐乳总酸含量上升。而后酵过程中总酸含量的下降可能与酶促腐乳内部发生的酯化反应有关，能够消耗部分酸性化合物。

4、发酵过程中样品氨基态氮的变化

发酵过程中样品氨基态氮的变化如图7和图8所示。由图7和图8看出：腐乳后酵过程中氨基态氮的含量总体呈上升趋势，最后趋于平稳。根据SB/T 10170-2007《腐乳》，成品红腐乳的氨基态氮含量≥0.42mg/100g即符合标准，本发明中空白组、木瓜蛋白酶和皱胃酶处理组均在第15d时达到标准要求。其中空白组中腐乳的氨基态氮的含量随着发酵的进行逐渐上升，前15d氨基态氮含量迅速增长，第15d至第20d时增长缓慢后，然后又迅速上升，在第30d后逐渐趋于稳定，达到0.55mg/100g。

木瓜蛋白酶处理组中，1％和2％木瓜蛋白酶处理组的氨基态氮的含量变化与空白组无明显差异，4％木瓜蛋白酶处理组的氨基态氮含量在整个后酵过程中均明显高于空白组。皱胃酶处理组中，2％和4％皱胃酶处理组的氨基态氮的含量均高于空白组，其中1％皱胃酶处理组虽然在第10d前氨基态氮含量的上升速率明显高于空白组，但是之后基本与空白组保持一致。氨基态氮是指氨基酸形式的氮，其含量与氨基酸含量呈正比关系，因此氨基态氮的含量表明了氨基酸的含量和蛋白水解程度。结果表明，4 ％的木瓜蛋白酶和2％、4％的皱胃酶的添加均促进了蛋白质的分解，均能在一定程度上缩短腐乳生产周期。

5、发酵过程中样品硬度的变化

发酵过程中样品硬度的变化如图9和图10所示。由图9和图10看出：腐乳后酵过程中硬度总体呈下降趋势，空白组第0d至第5d硬度迅速下降至34.11N，之后第 5d至第15d趋于稳定，最后随着后酵的进行逐渐下降，最低达到26.04N。木瓜蛋白酶处理组中，1％、2％和4％木瓜蛋白酶处理组的硬度下降速率均大于空白组，并且逐渐减小。其中1％和2％木瓜蛋白酶处理组的硬度变化趋势基本一致，4％木瓜蛋白酶处理组的硬度下降速率最快，在发酵结束第40d时硬度达到最小值(22.87N)，明显低于空白组。皱胃酶处理组中，各处理组的硬度下降速率也均大于空白组，其中4％皱胃酶处理组的硬度下降速率在后酵前20d低于1％和2％皱胃酶处理组，但第20d 至发酵结束期间，硬度快速下降，下降速率大于1％和2％皱胃酶处理组。

腐乳的质构与腐乳的组成、结构和成熟度等密切相关，质构是评价腐乳品质的一项重要指标。利用质构指标评价腐乳质量可以避免因感官评价重现性不佳，主观判断带来的误差。其中硬度是指冲传样品时的压力最大值。本发明的实验结果表明，随着各浓度的木瓜蛋白酶和皱胃酶的添加，腐乳中的蛋白质在相关酶的作用下加速降解，导致硬度明显降低。其中4％木瓜蛋白酶处理组和4％皱胃酶处理组对腐乳后酵硬度的影响最为明显，因此，感官评价中分别选取4％的木瓜蛋白酶或皱胃酶作为实验组。

6、酶促腐乳感官评价

酶促腐乳感官评价结果如表2和图11所示。由图11可知：添加蛋白酶组的腐乳块形完整度和外部颜色与空白组无显著性差异。空白组质地硬度得分为3.27分，而木瓜蛋白酶处理组和皱胃酶处理组的得分均高于空白组(分别为3.64分和4.00分)。并且木瓜蛋白酶处理组(4.18分)和皱胃酶处理组(4.64分)的口感细腻得分也均高于空白组(3.27分)。以上说明添加外源蛋白酶降低了腐乳的质地硬度，这与质构分析的结果一致，并且改善了腐乳的口感细腻程度，其中皱胃酶处理组最为明显。内部颜色、主要香气和鲜味方面，木瓜蛋白酶处理组与皱胃酶处理组得分无显著性差异，并且均高于空白组。说明添加外源蛋白酶都可以改善腐乳内部颜色，提高腐乳香气和鲜味。木瓜蛋白酶处理组的苦味得分(4.09分)高于空白组和皱胃酶组(均为3.64分)，可能与木瓜蛋白酶分解腐乳中蛋白质产生苦味氨基酸等有关。外源蛋白酶分解腐乳中的蛋白质可以产生苦味氨基酸和挥发性香味物质，并且腐乳表面毛坯层的分解也有利于汤料的渗入，进而改善腐乳内部颜色，促进腐乳成熟。

表2、酶促腐乳感官评价结果

注：C组为未加入酶的空白组，A3为4％木瓜蛋白酶处理组，B3为4％皱胃酶处理组；数值均以均值和标准差表示，样本数n＝11；同一列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

Claims (8)

1.外源蛋白酶在如下a1)-a9)中任一种中的应用：

a1)提高腐乳品质；

a2)改善腐乳口感；

a3)改善腐乳内部颜色；

a4)提高腐乳香气和/或鲜味；

a5)降低腐乳硬度；

a6)增加腐乳氨基态氮含量；

a7)促进腐乳成熟；

a8)缩短腐乳生产周期；

a9)制备和/或生产腐乳；

所述外源蛋白酶为木瓜蛋白酶或皱胃酶。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述改善腐乳口感为改善腐乳口感细腻程度。

3.外源蛋白酶在如下b1)-b9)中任一种中的应用：

b1)制备提高腐乳品质的产品；

b2)制备改善腐乳口感的产品；

b3)制备改善腐乳内部颜色的产品；

b4)制备提高腐乳香气和/或鲜味的产品；

b5)制备降低腐乳硬度的产品；

b6)制备增加腐乳氨基态氮含量的产品；

b7)制备促进腐乳成熟的产品；

b8)制备缩短腐乳生产周期的产品；

b9)制备生产腐乳的产品；

所述外源蛋白酶为木瓜蛋白酶或皱胃酶。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述改善腐乳口感为改善腐乳口感细腻程度。

5.一种产品，其活性成分为木瓜蛋白酶或皱胃酶；

所述产品的功能为如下a1)-a9)中任一种：

a1)提高腐乳品质；

a2)改善腐乳口感；

a3)改善腐乳内部颜色；

a4)提高腐乳香气和/或鲜味；

a5)降低腐乳硬度；

a6)增加腐乳氨基态氮含量；

a7)促进腐乳成熟；

a8)缩短腐乳生产周期；

a9)制备和/或生产腐乳。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：

所述改善腐乳口感为改善腐乳口感细腻程度。

7.一种腐乳的生产方法，包括在腐乳发酵的后酵阶段添加外源蛋白酶的步骤；

或，所述外源蛋白酶为木瓜蛋白酶或皱胃酶。

8.权利要求7所述的方法在如下1)-8)中任一种中的应用：

1)提高腐乳品质；

2)改善腐乳口感；

3)改善腐乳内部颜色；

4)提高腐乳香气和/或鲜味；

5)降低腐乳硬度；

6)增加腐乳氨基态氮含量；

7)促进腐乳成熟；

8)缩短腐乳生产周期。