CN107311927A

CN107311927A - 一种双光子荧光探针10‑甲基‑2‑氨基‑吖啶酮及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107311927A
Application number: CN201710662060.3A
Authority: CN
Inventors: 陈敬华; 何文慧; 夏垚坤; 王亮亮; 兰建明; 吴芳; 李春艳; 闫安
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2017-11-03
Anticipated expiration: 2037-08-04
Also published as: CN107311927B

Abstract

本发明公开了一种双光子荧光探针10‑甲基‑2‑氨基‑吖啶酮及其制备方法和应用，并以此为荧光探针，用于细胞和斑马鱼的活体成像，所述10‑甲基‑2‑氨基吖啶酮的结构式为。该化合物具有良好的水溶性，其发射波长为绿光波段，且有良好的双光子活性，可以很好的减少生物自体荧光和自吸收，成功的用于与细胞和斑马鱼的成像。同时，该化合物具有良好的电化学活性，有望作为一种新型的电化学指示剂，用于电化学传感领域。

Description

一种双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机合成领域，具体涉及一种双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮及其制备方法和应用。

背景技术

双光子激发分子是一个非线性过程：是指强光激发下，分子通过同时吸收和结合两个低能量的光子(两个光子的能量可以相同也可以不同)，诱导分子跃迁到激发电子态的过程。1931年，Gppert-Mayer等人首次提出双光子吸收过程的概念，理论上推测双光子吸收的存在。但是，直到60年代初激光器出现后，才由 Kaiser 等首先从实验上证实双光子吸收过程。1990年，美国康奈尔大学 Denk等提出将双光子激发现象应用到共聚焦激光扫描显微镜中，开辟了双光子荧光显微和成像这个崭新的领域。1997年，美国伯乐公司首次制造出商业化的双光子显微镜。双光子显微镜的出现，立刻引起了广大学者的关注。双光子显微镜（Two-photon microscopy），结合了共聚焦激光扫描显微镜和双光子激发技术的一种新技术近红外光激发、自发荧光低、高分辨率，光损伤小，3D可视化，对生物样本穿透能力强，光漂白和光毒性小、能够延长活细胞和组织的观测时间等优点，并迅速被应用于生物系统上，包括小分子检测、金属离子检测、DNA检测、氨基酸检测、蛋白质检测等。近年来，双光子吸收材料在诸多领域，尤其是双光子荧光成像中的应用得到了广泛的关注。

传统的单光子荧光的激发波长主要在紫外或可见光区，由于其光损伤大，二维性，瑞利散射高，空间分辨率差等缺点，限制了其在生物领域的成像。而双光子荧光的激发波长是单光子激发的两倍，双光子吸收的能量远低于单光子吸收能量。相比于单光子荧光，它具有近红外激发、自发荧光干扰小、分辨率高，光损伤小，3D可视化，穿透生物样本的能力强，光漂白和光毒性小、能够延长活体观察时间等优点，很快被应用于生物系统，包括小分子检测、金属离子检测、DNA检测、氨基酸检测、蛋白质检测等。目前报道的双光子荧光探针有：商业化探针、金属离子探针、有机探针、纳米探针等。商业化的双光子荧光探针如：香豆素类、尼罗红、菁类染料等，数量少且大多双光子吸收截面小，难以满足实际应用的需要。当下为了使双光子荧光显微技术获得更大的应用，开发有效的双光子荧光探针是十分必要的。

吖啶酮及衍生物是一类含氮杂环类有机化合物，由于其自身的大环共轭体系及刚性平面结构使之成为一种荧光极强的物质，因此它是一种很有应用价值的荧光染料且经过合理的修饰可以较好地与体内物质结合。目前，报道的吖啶酮衍生物类荧光化合物大多数为单光子荧光，而有关该类化合物的双光子荧光探针则少有人报道，使得它不能广泛的应用于生物医学领域。因此，设计和合成一个具有双光子活性的吖啶酮类化合物，在荧光分析领域具有更大的应用前景。下面所述的为本发明人设计和合成一种新型的具有高的水溶性和双光子活性的吖啶酮类衍生物-“10-甲基-2-氨基-吖啶酮”，并以此为双光子荧光探针，用于细胞和斑马鱼的活体成像。该化合物的发射波长为绿光波段，有良好的细胞通透性，可以很好的减少生物自体荧光和自吸收。同时，研究了该化合物的电化学性质，发现其在金电极和玻璃导电电极(ITO)上均具有良好的电化学活性，有望作为一种新型的电化学指示剂，用于电化学传感领域。结合该化合物的光电性质，有望构建一个光电合一的传感平台，可以更广泛的用于生物医学领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮及其制备方法和用途，提供一种基于吖啶酮母核，设计和合成一种具有双光子活性的吖啶酮衍生物，并成功用于体内外（细胞和斑马鱼）成像。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮，其结构式为；其制备方法具体包括以下步骤：

（1）取1.6277 g氢氧化钾加入无水乙醇中，加热使氢氧化钾溶解，形成乙醇钾混合液，趁热加入0.4811 g吖啶酮，升温至110~140℃蒸去乙醇；

（2）随后加入20 mL N, N-二甲基甲酰胺(DMF)，升温至165℃使DMF沸腾，此时缓慢加入10 mL碘甲烷，加热40 min，趁热倒入冰水中，冷却后有黄绿色固体析出，再经抽滤、洗涤和烘干，并用无水乙醇进一步重结晶纯化，得黄绿色针状固体，即10-甲基-吖啶酮；

（3）称取步骤（2）得到的10-甲基-吖啶酮固体0.2105 g于三颈烧瓶中，加入6 mL 99wt%的冰醋酸，并升温至40℃使固体溶解，再依次滴加2 mL浓硝酸和2 mL 99 wt%的冰醋酸，搅拌加热至58~60℃，反应2 h；趁热倾入冰水中，冷却后有金黄色固体析出，再经抽滤、洗涤和烘干，得金黄色固体，即10-甲基-2-硝基-吖啶酮；

（4）称取步骤（3）得到的10-甲基-2-硝基-吖啶酮固体100 mg于圆底烧瓶中，加入5 mL乙醇和2.5 mL的Na₂S溶液（30 wt%），随后加水至50 mL，在通入N₂条件下，加热至130℃，反应4 h；趁热倾入冰水，冷却后有土黄色固体析出，再经抽滤、洗涤、烘干和高效液相法分离提纯，得到土黄色针状固体，即10-甲基-2-氨基-吖啶酮（MAA）。

步骤（4）中所述的高效液相法分离提纯的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-双蒸水溶液为流动相；检测波长为254 nm；采用二元高压梯度洗脱模式；柱温为40℃；流速为2.000 mL/min；进样体积为200 µL，10-甲基-2-氨基-吖啶酮的出峰时间为9.0 min，纯度为80-90 %。

本发明还保护了双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮在体内外活体成像上的应用；双光子荧光成像条件为：以810 nm激光激发，功率为40 mW，进行成像。

具体地，所述双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮用于细胞和斑马鱼的成像。

本发明还保护了双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮在电化学传感器上的应用。具体地，（1）金电极方面，首先将金电极进行预处理，随后将其分别置于100 µM的吖啶酮和10-甲基-2-氨基-吖啶酮的 pH 5.0的醋酸钠缓冲溶液中，在通氮气2 min后，用循环伏安法对该体系进行研究和测定；所述循环伏安法测定条件如下：扫描电压范围为 -0.4 V ~ +0.4 V；扫描速度为0.10 V/s；采样间隔为0.001 V；静置时间为2 s。（2）ITO电极方面，首先ITO电极用超纯水进行超声洗涤处理，随后将其置于含50 µM的10-甲基-2-氨基-吖啶酮的pH 5.0的醋酸钠缓冲溶液中，在通氮气2 min后，用循环伏安法对该体系进行研究和测定；所述循环伏安法测定条件如下：扫描电压范围为 -0.4 V ~ + 0.4 V；扫描速度为0.10 V/s；采样间隔为0.001 V；静置时间为2 s。

本发明的有益效果在于：

（1）合成一种新型的双光子荧光探针吖啶酮类衍生物-“10-甲基-2-氨基-吖啶酮”（MAA），它具有良好的水溶性和双光子活性，可更广泛的应用于生物传感领域；

（2）以MAA为双光子荧光探针，可构建一个光学生物传感平台，并成功用于细胞和斑马鱼的成像；

（3）该MAA在金电极及ITO电极上均具有良好的电化学活性，可构建一个电化学传感平台，用于生物医学领域。

附图说明

图1是双光子荧光探针10-甲基-2-氨基吖啶酮的质谱图；

图2为本发明在Hela细胞和斑马鱼的成像图；图中A为为Hela细胞在双光子荧光显微镜，以 810 nm激光激发下的双光子荧光成像图；B为比较斑马鱼的单光子荧光成像（B1）和双光子荧光成像（B2）图；

图3为本发明的电化学信号检测图；A为在金电极上吖啶酮（a）与MAA（b）的电化学信号比较；B为在ITO电极上MAA的电化学信号。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。

实施例

双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮的制备方法，具体如下：

称取1.6277 g氢氧化钾，加入13 mL的无水乙醇，加热使氢氧化钾溶解形成乙醇钾混合液。趁热加入0.4811 g吖啶酮，温度升至125℃蒸去乙醇。随后加入20 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF），温度至165℃使DMF沸腾。这时慢慢加入10 mL的碘甲烷，加热40 min，趁热倒入50mL冰水中，冷却后有黄绿色固体析出。抽滤，用10 mL冰水洗涤，70℃烘干，并用无水乙醇进一步重结晶纯化。得黄绿色针状固体，即10-甲基-吖啶酮。精密称取0.2105 g 10-甲基-吖啶酮于三颈烧瓶中，加入6 mL 99 wt% 冰醋酸，并升温至40℃使固体溶解，再依次滴加2 mL浓硝酸和2 mL 99 wt% 冰醋酸，搅拌加热至60℃，反应2 h。趁热倾入冰水，冷却后有金黄色固体析出，抽滤，用10 mL冰水洗涤，将固体置于烘箱中，70℃烘干，得金黄色固体，即10-甲基-2-硝基-吖啶酮。精密称取100 mg10-甲基-2-硝基-吖啶酮于圆底烧瓶中，加入5 mL乙醇和2.5 mL Na₂S溶液 (30 wt%)，随后加水至50 mL，在通入N₂条件下，加热至130℃，反应4 h。趁热倾入冰水，冷却后有土黄色固体析出。抽滤，冰水洗涤，将固体置于真空干燥箱中，室温烘干，得土黄色固体，进一步用高效液相法（HPLC）分离提纯，得到土黄色针状固体10-甲基-2-氨基-吖啶酮(MAA)。

MAA表征数据如下：

MAA的碳谱分析：¹³C-NMR (400 MHz, CDCl₃)：δ =177.65(-C=O)，142.21(-C-N-)，140.89(-C-)，136.37(-C-)，133.40(-C-)，127.86(-C-)，123.59(-C-)，123.43(-C-)，121.73(-C-)，120.54(-C-)，116.05(-C-)，114.46(-C-)，110.67(-C-)，33.55(-N-C-)。

MAA的氢谱分析：¹H- NMR(400 MHz, CDCl₃): δ=8.572 (d, 1H, Ar-H), 7.841(d,1H, Ar-H), 7.718(t, 1H, Ar-H), 7.514(d, 1H, Ar-H), 7.443(d, 1H, Ar-H), 7.286(CDCl₃)，7.261(s, 1H, Ar-H),7.234(t, 1H, Ar-H), 3.887(s, 2H, -NH₂), 1.595(s,3H, -CH₃)。

MAA的质谱分析LC-MS：m/z 225（[M +H]⁺）。

应用例1

双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮在体内外活体成像中应用，具体如下：

1）细胞双光子荧光成像：将复苏的HeLa细胞置于细胞培养瓶中，加入约10 mL RPMI-1640培养夜（含10%的胎牛血清和1%的青霉素-链霉素溶液），置于37 ℃、5 % CO₂的培养箱中培养。培养至细胞状态良好且细胞长满瓶底约70%-80% 时，加1 mL胰酶消化，取少量细胞计数，然后接种于细胞爬片（20 mm）上，每个细胞爬片约种板7-8万个细胞。过夜培养，待细胞贴壁后，弃去上清，PBS洗涤2-3次，加入1 mL含200 µM 10-甲基-2-氨基-吖啶酮的RPMI-1640原培养液，放置于培养箱中孵育2 h。弃去上清，PBS洗涤2-3次，用镊子取出细胞爬片固定于载玻片上，然后置于双光子荧光显微镜，在810 nm激光激发下，进行细胞成像。

2）斑马鱼单双光子荧光成像：取数条用含2%黑色素抑制剂的培养液培养2天后的斑马鱼，放入含10 µM 10-甲基-2-氨基-吖啶酮的培养液中，置于28℃恒温箱中孵育12 h。弃去培养液，用斑马鱼培养液洗涤多次后，各取一条斑马鱼固定于载玻片上，分别用荧光成像系统显微镜和双光子荧光显微镜进行活体成像。

本发明基于MAA双光子荧光探针，用于细胞和斑马鱼的成像。实验结果见附图2，由图2可知，A为Hela细胞在双光子荧光显微镜，用810 nm激光激发下，得到清晰、明亮且呈绿色的双光子荧光细胞成像图。说明MAA荧光材料具有很好的细胞通透性和良好的双光子活性。B为比较斑马鱼在荧光成像系统显微镜（B1）和双光子荧光显微镜的成像(B2)。B1中几乎整条鱼都有绿色荧光，而B2只有局部区域有绿色荧光。这说明了MAA双光子荧光材料可以减少生物自体荧光和自吸收，同时也进一步证明了MAA具有双光子荧光活性。

应用例2

双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮在电化学传感器上的应用，具体如下：

探究MAA的在金电极和ITO电极上的电化学性质，具体的实施方法：（1）金电极方面：将金电极（GE）用0.3 µm的Al₂O₃粉抛光，打磨后，先后用无水乙醇、超纯水各超声5 min，以除去附在电极表面上的杂质，分别用0.5 M KOH和0.5 M H₂SO₄表征电极表面，超纯水洗净擦干后取出，氮气吹干。然后分别置于含100 µM的吖啶酮和10-甲基-2-氨基-吖啶酮的 pH 5.0的醋酸钠缓冲溶液中，在通氮气2 min后，用循环伏安法对该体系进行研究和测定。

（2）ITO电极方面：将ITO电极用超纯水超声5 min,以除去附在电极表面上的杂质，氮气吹干。然后置于含MAA(50 µM)的pH 5.0的醋酸钠缓冲溶液中，在通氮气2 min后，用循环伏安法对该体系进行研究和测定。

本发明运用现有技术的循环伏安法电化学检测技术观察MAA与吖啶酮的氧化还原信号变化。实验结果见附图3，由A可知，金电极电位在–0.4 ~ +0.4V的范围下，吖啶酮无明显的氧化还原峰（a），而MAA却出现一对可逆的氧化还原峰（b），说明吖啶酮在此条件下没有电化学活性，而MAA表现出良好的电化学活性。由B可知，ITO电极电位在–0.4 ~ +0.4V范围下，MAA出现一对可逆的氧化还原峰，说明MAA在ITO电极上具有良好的电化学活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮，其特征在于：所述10-甲基-2-氨基-吖啶酮的结构式为。

2.一种如权利要求1所述的双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

（1）10-甲基-2-硝基-吖啶酮的制备；

（2）称取步骤（1）得到的10-甲基-2-硝基-吖啶酮固体100 mg于圆底烧瓶中，加入5 mL乙醇和2.5 mL的Na₂S溶液，随后加水至50 mL，在通入N₂条件下，加热至130℃，反应4 h；趁热倾入冰水，冷却后有土黄色固体析出，再经抽滤、洗涤、烘干和高效液相法分离提纯，得到土黄色针状固体，即10-甲基-2-氨基-吖啶酮。

3.根据权利要求2所述的双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的10-甲基-2-硝基-吖啶酮的制备方法，步骤如下：

（A）取1.6277 g氢氧化钾加入无水乙醇中，加热使氢氧化钾溶解，形成乙醇钾混合液，趁热加入0.4811 g吖啶酮，升温至110~140℃蒸去乙醇；

（B）随后加入20 mL N, N-二甲基甲酰胺，升温至165℃使N, N-二甲基甲酰胺沸腾，此时缓慢加入10 mL碘甲烷，加热40 min，趁热倒入冰水中，冷却后有黄绿色固体析出，再经抽滤、洗涤和烘干，并用无水乙醇进一步重结晶纯化，得黄绿色针状固体，即10-甲基-吖啶酮；

（C）称取步骤（B）得到的10-甲基-吖啶酮固体0.2105 g于三颈烧瓶中，加入6 mL 99wt%的冰醋酸，并升温至40℃使固体溶解，再依次滴加2 mL浓硝酸和2 mL冰醋酸，搅拌加热至58~60℃，反应2 h；趁热倾入冰水中，冷却后有金黄色固体析出，再经抽滤、洗涤和烘干，得金黄色固体，即10-甲基-2-硝基-吖啶酮。

4.根据权利要求2所述的双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的Na₂S溶液的浓度为30 wt%。

5.根据权利要求2所述的双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的高效液相法分离提纯的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-双蒸水溶液为流动相；检测波长为254 nm；采用二元高压梯度洗脱模式；柱温为40℃；流速为2.000 mL/min；进样体积为200 µL，10-甲基-2-氨基-吖啶酮的出峰时间为9.0min，纯度为80-90 %。

6.一种如权利要求1所述的双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮的应用，其特征在于：所述双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮用于体内外活体成像；成像条件为：以810nm激光激发，功率为40 mW，进行成像。

7.根据权利要求6所述的的应用，其特征在于：所述双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮用于细胞和斑马鱼的成像。

8.一种如权利要求1所述的双光子荧光探针10-甲基-2-氨基-吖啶酮在电化学传感器上的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：首先将金电极进行预处理，随后将其分别置于100 µM的吖啶酮和10-甲基-2-氨基-吖啶酮的 pH 5.0的醋酸钠缓冲溶液中，在通氮气2 min后，用循环伏安法对该体系进行研究和测定；所述循环伏安法测定条件如下：扫描电压范围为 -0.4 V ~ + 0.4 V；扫描速度为0.10 V/s；采样间隔为0.001 V；静置时间为2 s。

10.根据根据权利要求8所述的应用，其特征在于：首先ITO电极用超纯水进行超声洗涤处理，随后将其置于含50 µM的10-甲基-2-氨基-吖啶酮的 pH 5.0的醋酸钠缓冲溶液中，在通氮气2 min后，用循环伏安法对该体系进行研究和测定；所述循环伏安法测定条件如下：扫描电压范围为 -0.4 V ~ + 0.4 V；扫描速度为0.10 V/s；采样间隔为0.001 V；静置时间为2 s。