CN107299093B - 一种木聚糖酶的生产方法 - Google Patents

一种木聚糖酶的生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107299093B
CN107299093B CN201610233030.6A CN201610233030A CN107299093B CN 107299093 B CN107299093 B CN 107299093B CN 201610233030 A CN201610233030 A CN 201610233030A CN 107299093 B CN107299093 B CN 107299093B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mass
culture medium
pichia pastoris
trichoderma reesei
dissolved oxygen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610233030.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107299093A (zh
Inventor
宋宵因
吴鹏
赵路
刘宝龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SUZHOU KUNLAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
SUZHOU KUNLAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SUZHOU KUNLAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical SUZHOU KUNLAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CN201610233030.6A priority Critical patent/CN107299093B/zh
Publication of CN107299093A publication Critical patent/CN107299093A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107299093B publication Critical patent/CN107299093B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：（1）一级种子培养；（2）二级种子培养；（3）接种到培养基，发酵，加入诱导物，得到发酵液；（4）将发酵液压滤，浓缩；（5）加入保护剂，灌装。此方法生产的木聚糖酶既含有高木聚糖酶活力，又含有纤维素酶、β‑葡聚糖酶等多种副酶活。

Description

一种木聚糖酶的生产方法
技术领域
本发明属于酶制剂生产领域，特别是涉及一种木聚糖酶的生产方法。
背景技术
木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称。木聚糖酶在造纸、食品、饲料、纺织、酿酒、医药、环境和能源等行业被广泛应用，前景十分看好。
工业用木聚糖酶主要由微生物发酵、提炼获得，常用的工业木聚糖酶发酵菌种有里氏木霉（Trichoderma reesei）和毕赤酵母（Pichia pastoris）。用里氏木霉发酵生产的木聚糖酶除了含木聚糖酶活力外，还有相当多的纤维素酶、β-葡聚糖酶等活力，适用于饲料、酿酒、环境和能源等各种破坏、降解天然木质纤维结构的领域；而用毕赤酵母生产的木聚糖酶其他副酶活少，木聚糖酶活力高，适用于食品、纺织、造纸等领域。
近年来，在酒精等发酵领域开发出越来越多能利用木糖作为碳源的菌种，使发酵原料的来源有了更大的拓展，进而带动了木聚糖酶的需求。在天然组织中，木聚糖和纤维素、葡聚糖、木质素等多聚糖组成了牢固的木质纤维结构，打破这个天然结构的束缚需要纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶等多种酶制剂协同作用，而产生木糖则需要更高活力的木聚糖酶。
发明内容
在基于此，有必要提供一种既含有高木聚糖酶活力，又含有纤维素酶、β-葡聚糖酶等多种副酶活的木聚糖酶生产方法。
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（1）将毕赤酵母菌种按照质量百分比6%～12%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～30℃培养8h～12h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比10%～15%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～32℃培养16h～20h，得到里氏木霉一级种子液；
（2）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比6%～12%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～30℃培养8h～12h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比10%～15%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～32℃培养16h～20h，得到里氏木霉二级种子液；
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比6%～12%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速100rpm～120rpm，28℃～32℃培养36h～42h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比10%～15%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速150rpm～170rpm培养16h～18h，按照质量百分比0.5%～5%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速220rpm～240rpm培养72h～78h后得到木聚糖酶发酵液，其中发酵培养基的成分为：120g/L～150g/L原糖蜜，70g/L～90g/L玉米DDGS，0.5g/L～1g/L磷酸二氢铵，0.5g/L～0.75g/L碳酸钙，0.4g/L～0.75g/L硫酸锰，0.05g/L～0.1g/L蛋白酶，0.5g/L～0.75g/L植酸酶；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩到所需要的酶活力；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.05%～0.5%的防腐剂和质量百分比15%～25%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶。
其中，步骤（1）和步骤（2）中，毕赤酵母的一级种子培养基和二级种子培养基成分为：15～25g/L葡萄糖,10～20g/L原糖蜜,10～15g/L酵母浸膏,10～15g/L蛋白胨，1～2g/L磷酸二氢铵。
其中，步骤(1)和步骤(2)中，里氏木霉的一级种子培养基和二级种子培养基成分为：15～25g/L葡萄糖，8～12g/L原糖蜜，15～25g/L酵母浸膏，0.5～1g/L硫酸铵，0.25～0.5g/L硫酸锰，0.25～0.5g/L硫酸锌。
其中，步骤（3）中所述蛋白酶可以是酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶其中一种或任意几种的组合物。
其中，步骤（3）中所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围6MeV～8MeV辐照8min～10min。
其中，步骤（5）中所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：35%～45%氯化钠、20%～35%山梨酸钾、15%～30%丙酸钠、10%～25%脱氢乙酸钠。
其中，步骤（5）中所述保护剂由以下质量分数的各组分组成：40%～50%甘油、35%～45%山梨醇、10%～20%海藻糖。
在其中一个实施例中，步骤（1）和步骤（2）中，毕赤酵母的一级种子培养基和二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵。
在其中一个实施例中，步骤(1)和步骤(2)中，里氏木霉的一级种子培养基和二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
在其中一个实施例中，步骤（3）为，将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速115rpm，29℃培养40h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速160rpm培养18h，按照质量百分比2%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速230rpm培养72h后得到木聚糖酶发酵液。
在其中一个实施例中，步骤（3）中，发酵培养基的成分为：125g/L原糖蜜，75g/L玉米DDGS，0.75g/L磷酸二氢铵，0.6g/L碳酸钙，0.5g/L硫酸锰，0.075g/L蛋白酶，0.6g/L植酸酶。
本发明方法实现了毕赤酵母和里氏木霉共同发酵木聚糖酶，木聚糖酶发酵活力高，同时含有纤维素酶活力、β-葡聚糖酶活力、果胶酶活力等副酶活，更适用于酒精、能源、饲料等行业的应用，同时用处理后的甘蔗渣作为诱导剂，增强了对木聚糖酶诱导能力的同时，还能诱导里氏木霉产纤维素酶、β-葡聚糖酶，取代了目前广泛应用的甲醇，减少了对生产环境和操作人员的危害。
附图说明
图1为一实施方式的木聚糖酶的生产方法的附图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
步骤（1），将毕赤酵母菌种按照质量百分比6%～12%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～30℃培养8h～12h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比10%～15%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～32℃培养16h～20h，得到里氏木霉一级种子液；
其中毕赤酵母的一级种子培养基成分为：15～25g/L葡萄糖,10～20g/L原糖蜜,10～15g/L酵母浸膏,10～15g/L蛋白胨，1～2g/L磷酸二氢铵；里氏木霉的一级种子培养基成分为：15～25g/L葡萄糖，8～12g/L原糖蜜，15～25g/L酵母浸膏，0.5～1g/L硫酸铵，0.25～0.5g/L硫酸锰，0.25～0.5g/L硫酸锌。
优选的，毕赤酵母的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；里氏木霉的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
步骤（2），将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比6%～12%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～30℃培养8h～12h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比10%～15%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～32℃培养16h～20h，得到里氏木霉二级种子液。
其中毕赤酵母的二级种子培养基成分为：15～25g/L葡萄糖,10～20g/L原糖蜜,10～15g/L酵母浸膏,10～15g/L蛋白胨，1～2g/L磷酸二氢铵；里氏木霉的二级种子培养基成分为：15～25g/L葡萄糖，8～12g/L原糖蜜，15～25g/L酵母浸膏，0.5～1g/L硫酸铵，0.25～0.5g/L硫酸锰，0.25～0.5g/L硫酸锌。
优选的，毕赤酵母的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；里氏木霉的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
步骤（3），将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比6%～12%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速100rpm～120rpm，28℃～32℃培养36h～42h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比10%～15%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速150rpm～170rpm培养16h～18h，按照质量百分比0.5%～5%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速220rpm～240rpm培养72h～78h后得到木聚糖酶发酵液，其中发酵培养基的成分为：120g/L～150g/L原糖蜜，70g/L～90g/L玉米DDGS，0.5g/L～1g/L磷酸二氢铵，0.5g/L～0.75g/L碳酸钙，0.4g/L～0.75g/L硫酸锰，0.05g/L～0.1g/L蛋白酶，0.5g/L～0.75g/L植酸酶。
其中，所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围6MeV～8MeV辐照8min～10min。甘蔗渣中含有大量的纤维素、半纤维素、木质素等物质，但是纤维素、半纤维素及木质素三者的紧密包裹结构使其难于被充分利用，大大缩小了其利用范围。在研制过程中，发明人发现，甘蔗渣具有比常用的玉米芯粉、纤维质粉更优异的木聚糖酶诱导能力，用高能电子辐照加速器辐照后，使得纤维素、半纤维素、木质素分离开，切断它们之间的连接，降低它们的聚合度，破坏纤维素晶体结构，使木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶的作用位点充分暴露出来，提高诱导能力，处理后的甘蔗渣诱导发酵木聚糖酶的能力和现在常用的诱导剂甲醇比肩。甘蔗渣不会对毕赤酵母、里氏木霉和操作工人产生任何危害，并且可以作为发酵菌种的碳源而被利用，操作性比甲醇更有优势。优选的，所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围8MeV辐照9min。
多菌种液体共同发酵在大生产上一直难以实现，不同种类的微生物所需要的培养基成分不同，所需营养物质不同，菌种对液体培养基渗透压的耐受性不同，菌种生长所需pH，菌种生产生长周期不同等是造成不同菌种难以在液体培养基上共同发酵的主要原因。发明人在研究过程中发现，产木聚糖酶毕赤酵母和里氏木霉相比，对糖蜜的渗透压有更强的适应力，生长发酵周期更长，生长所需pH相近，根据糖蜜浓度调节毕赤酵母和里氏木霉二级种子培养液的添加时间，可以使二者得到各自适应的渗透压环境。糖蜜中除了含有大量的糖外，还有丰富的钾、镁、氯、纳等矿物质，使用糖蜜作为主碳源，可以节省大量无机盐，降低培养基成本。此外，糖蜜中含部分可溶性纤维素、半纤维素、果胶等物质，既可以作为生产纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶的诱导物，又是发酵菌种的可利用碳源。发明人发现，毕赤酵母在糖蜜浓度不超过140g/L的醪液中正常生长，而里氏木霉适合在糖蜜浓度不超过95g/L的醪液中生长，而毕赤酵母的发酵周期较里氏木霉要长，因此，在接入毕赤酵母二级种子液36h～42h再接入里氏木霉二级种子液，可以解决两个菌种对培养基不同渗透压的需求。玉米DDGS中含有大量的菌体蛋白、纤维素、半纤维素和生物素类物质，可为木聚糖酶菌种提供优质氮源、部分碳源和其他营养物质。在木聚糖酶生产过程加入蛋白酶，可以有效地把那些可溶的和不可溶的蛋白质和肽水解成毕赤酵母和里氏木霉可以吸收的游离氨基酸，有利于产酶菌的生长和代谢，使产酶菌始终处于强壮期，而且添加蛋白酶可以提高玉米DDGS中蛋白质的释放，比添加尿素和无机氮源效果更好。发明人惊奇的发现，以玉米DDGS作为氮源使用蛋白酶后，毕赤酵母和里氏木霉的生长速度都明显加快，菌株更加健壮，可以在较短时间内达到发酵所需的菌体数量和质量，解决了毕赤酵母先成为优势菌后，里氏木霉生长缓慢的问题，这也是成功实现双菌株共同发酵生产木聚糖酶的关键之一。在天然发酵原料中，60%以上磷元素是以植酸磷形式存在，植酸中的磷不能被产酶菌所利用，植酸有比较强的络合能力，它的存在使培养基中很多金属离子和蛋白质不能被产酶菌吸收利用，发明人发现，在木聚糖酶生产过程中加入植酸酶，可以有效提高培养基的利用率，减少培养基中无机盐的使用，降低生产成本。
优选的，将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速115rpm，29℃培养40h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速160rpm培养18h，按照质量百分比2%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速230rpm培养72h后得到木聚糖酶发酵液。
优选的，发酵培养基的成分为：125g/L原糖蜜，75g/L玉米DDGS，0.75g/L磷酸二氢铵，0.6g/L碳酸钙，0.5g/L硫酸锰，0.075g/L蛋白酶，0.6g/L植酸酶。
步骤（4），将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩到所需要的酶活力；
发酵醪压滤、澄清后得到发酵液，此时的酶活力即为发酵活力，如果需要更高活力的酶活力，可通过超滤浓缩来实现。
步骤（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.05%～0.5%的防腐剂和质量百分比15%～25%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶。
其中，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：35%～45%氯化钠、20%～35%山梨酸钾、15%～30%丙酸钠、10%～25%脱氢乙酸钠。所述保护剂由以下质量分数的各组分组成：40%～50%甘油、35%～45%山梨醇、10%～20%海藻糖。
酶制剂是生物活性物质，自然存放时不断会有酶活损失，为了减少储存时的酶活损失，液体酶制剂中需要加入一定量的保护剂，以延长酶制剂的有效期。本发明用到的甘油、山梨醇、海藻糖能为液体木聚糖酶提供优良的保护作用，优选的，保护剂由以下质量分数的各组分组成：45%甘油，35%山梨醇，20%海藻糖。
液体酶在温度适合时容易滋生杂菌，造成酶制剂产品迅速失效，因此需要采取抑菌防腐措施，本发明选取高效安全的食品添加剂山梨酸钾、丙酸钠、脱氢乙酸钠和氯化钠联合使用，抑菌效果明显。优选的，防腐剂由以下质量分数的各组分组成：40%氯化钠、30%山梨酸钾、20%丙酸钠、10%脱氢乙酸钠。
用本发明的方法生产木聚糖酶，原料利用率高，单位生产成本低，工业化程度高，实现了毕赤酵母和里氏木霉双菌种共同发酵，生产出的木聚糖酶活力高，还有纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶等副酶活，更加适用于生物质能源、酒精、饲料和其他纤维质原料处理领域。
下面结合具体实施例，对本发明做进一步的阐述。
实施例1
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（1）将毕赤酵母菌种按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉一级种子液；
其中，所述毕赤酵母的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（2）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉二级种子液；
其中，所述毕赤酵母的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速115rpm，29℃培养40h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速160rpm培养18h，按照质量百分比2%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速230rpm培养72h后得到木聚糖酶发酵液，其中所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围8MeV辐照9min，发酵培养基的成分为：125g/L原糖蜜，75g/L玉米DDGS，0.75g/L磷酸二氢铵，0.6g/L碳酸钙，0.5g/L硫酸锰，0.075g/L蛋白酶，0.6g/L植酸酶；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.1%的防腐剂和质量百分比18%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶，其中，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：40%氯化钠、30%山梨酸钾、20%丙酸钠、10%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：45%甘油，35%山梨醇，20%海藻糖。
实施例2
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（1）将毕赤酵母菌种按照质量百分比6%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养12h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比10%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，31℃培养20h，得到里氏木霉一级种子液；
其中，所述毕赤酵母的一级种子培养基成分为：15g/L葡萄糖,20g/L原糖蜜,12g/L酵母浸膏,13g/L蛋白胨，1g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的一级种子培养基成分为：24g/L葡萄糖，10g/L原糖蜜，23g/L酵母浸膏，0.7g/L硫酸铵，0.25g/L硫酸锰，0.3g/L硫酸锌。
（2）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比6%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养12h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，31℃培养20h，得到里氏木霉二级种子液；
其中，所述毕赤酵母的二级种子培养基成分为：15g/L葡萄糖,20g/L原糖蜜,12g/L酵母浸膏,13g/L蛋白胨，1g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的二级种子培养基成分为：24g/L葡萄糖，10g/L原糖蜜，23g/L酵母浸膏，0.7g/L硫酸铵，0.25g/L硫酸锰，0.3g/L硫酸锌。
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比6%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速100rpm，32℃培养42h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速150rpm培养18h，按照质量百分比5%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速220rpm培养78h后得到木聚糖酶发酵液，其中所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围6MeV辐照10min，发酵培养基的成分为：145g/L原糖蜜，85g/L玉米DDGS，0.5g/L磷酸二氢铵，0.75g/L碳酸钙，0.45g/L硫酸锰，0.1g/L蛋白酶，0.75g/L植酸酶；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.5%的防腐剂和质量百分比25%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶，其中，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：45%氯化钠、25%山梨酸钾、15%丙酸钠、15%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：50%甘油，40%山梨醇，10%海藻糖。
实施例3
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（1）将毕赤酵母菌种按照质量百分比12%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养8h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比15%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养16h，得到里氏木霉一级种子液；
其中，所述毕赤酵母的一级种子培养基成分为：15g/L葡萄糖,20g/L原糖蜜,15g/L酵母浸膏,15g/L蛋白胨，2g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的一级种子培养基成分为：15g/L葡萄糖，12g/L原糖蜜，25g/L酵母浸膏，0.5g/L硫酸铵，0.5g/L硫酸锰，0.5g/L硫酸锌。
（2）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养8h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比15%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养16h，得到里氏木霉二级种子液；
其中，所述毕赤酵母的一级种子培养基成分为：15g/L葡萄糖,20g/L原糖蜜,15g/L酵母浸膏,15g/L蛋白胨，2g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的一级种子培养基成分为：15g/L葡萄糖，12g/L原糖蜜，25g/L酵母浸膏，0.5g/L硫酸铵，0.5g/L硫酸锰，0.5g/L硫酸锌。
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速120rpm，28℃培养36h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比15%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速170rpm培养16h，按照质量百分比3.5%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速240rpm培养78h后得到木聚糖酶发酵液，所述发酵培养基的成分为：150g/L原糖蜜，90g/L玉米DDGS，1g/L磷酸二氢铵，0.75g/L碳酸钙，0.75g/L硫酸锰，0.1g/L蛋白酶，0.75g/L植酸酶；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.05%的防腐剂和质量百分比15%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶。所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：35%氯化钠、20%山梨酸钾、25%丙酸钠、20%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：40%甘油，40%山梨醇，20%海藻糖。
实施例4
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（1）将毕赤酵母菌种按照质量百分比9%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，29℃培养11h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比14%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，31℃培养19h，得到里氏木霉一级种子液；
其中，毕赤酵母的一级种子培养基成分为：18g/L葡萄糖,18g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,13g/L蛋白胨，1.2g/L磷酸二氢铵；里氏木霉的一级种子培养基成分为：22g/L葡萄糖，11g/L原糖蜜，21g/L酵母浸膏，0.8g/L硫酸铵，0.35g/L硫酸锰，0.45g/L硫酸锌。
（2）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比9%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，29℃培养11h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比14%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，31℃培养19h，得到里氏木霉二级种子液，所述毕赤酵母的二级种子培养基成分为：18g/L葡萄糖,18g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,13g/L蛋白胨，1.2g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的二级种子培养基成分为：22g/L葡萄糖，11g/L原糖蜜，21g/L酵母浸膏，0.8g/L硫酸铵，0.35g/L硫酸锰，0.45g/L硫酸锌。
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比8%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速105rpm，31℃培养39h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比13%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速155rpm培养17h，按照质量百分比0.5%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速225rpm培养76h后得到木聚糖酶发酵液，其中所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围7MeV辐照9min，发酵培养基的成分为：135g/L原糖蜜，85g/L玉米DDGS，0.55g/L磷酸二氢铵，0.7g/L碳酸钙，0.45g/L硫酸锰，0.08g/L蛋白酶，0.65g/L植酸酶；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.45%的防腐剂和质量百分比20%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：36%氯化钠、24%山梨酸钾、23%丙酸钠、17%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：43%甘油，43%山梨醇，14%海藻糖。
对照组1
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（1）将毕赤酵母菌种按照质量百分比9%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，29℃培养11h，得到毕赤酵母一级种子液，所述毕赤酵母的一级种子培养基成分为：18g/L葡萄糖,18g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,13g/L蛋白胨，1.2g/L磷酸二氢铵。
（2）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比9%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，29℃培养11h，得到毕赤酵母二级种子液，所述毕赤酵母的二级种子培养基成分为：18g/L葡萄糖,18g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,13g/L蛋白胨，1.2g/L磷酸二氢铵。
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比8%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速105rpm，31℃培养56h，按照质量百分比5%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速225rpm培养76h后得到木聚糖酶发酵液，其中所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围7MeV辐照9min，发酵培养基的成分为：135g/L原糖蜜，85g/L玉米DDGS，0.55g/L磷酸二氢铵，0.7g/L碳酸钙，0.45g/L硫酸锰，0.08g/L蛋白酶，0.65g/L植酸酶；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.45%的防腐剂和质量百分比20%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶。所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：36%氯化钠、24%山梨酸钾、23%丙酸钠、17%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：43%甘油，43%山梨醇，14%海藻糖。
对照组2
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（1）将里氏木霉的菌种按照质量百分比14%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，31℃培养19h，得到里氏木霉一级种子液，所述里氏木霉的一级种子培养基成分为：22g/L葡萄糖，11g/L原糖蜜，21g/L酵母浸膏，0.8g/L硫酸铵，0.35g/L硫酸锰，0.45g/L硫酸锌。
（2）将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比14%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，31℃培养19h，得到里氏木霉二级种子液，所述里氏木霉的二级种子培养基成分为：22g/L葡萄糖，11g/L原糖蜜，21g/L酵母浸膏，0.8g/L硫酸铵，0.35g/L硫酸锰，0.45g/L硫酸锌。
（3）将步骤（2）中得到的里氏木霉二级种子液按照质量百分比13%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速120rpm，31℃培养49h，按照质量百分比0.5%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速225rpm培养76h后得到木聚糖酶发酵液，4所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围7MeV辐照9min，发酵培养基的成分为：75g/L原糖蜜，65g/L玉米DDGS，0.55g/L磷酸二氢铵，0.7g/L碳酸钙，0.45g/L硫酸锰，0.08g/L蛋白酶，0.65g/L植酸酶；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.45%的防腐剂和质量百分比20%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：36%氯化钠、24%山梨酸钾、23%丙酸钠、17%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：43%甘油，43%山梨醇，14%海藻糖。
对比例1
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（1）将毕赤酵母菌种按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉一级种子液；
其中，所述毕赤酵母的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（2）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉二级种子液；
其中，所述毕赤酵母的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到发酵培养基中，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速115rpm，29℃培养60h，按照质量百分比2%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速230rpm培养72h后得到木聚糖酶发酵液，其中所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围8MeV辐照9min，发酵培养基的成分为：125g/L原糖蜜，75g/L玉米DDGS，0.75g/L磷酸二氢铵，0.6g/L碳酸钙，0.5g/L硫酸锰，0.075g/L蛋白酶，0.6g/L植酸酶；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.1%的防腐剂和质量百分比18%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶，其中，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：40%氯化钠、30%山梨酸钾、20%丙酸钠、10%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：45%甘油，35%山梨醇，20%海藻糖。
对比例2
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（1）将毕赤酵母菌种按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉一级种子液；
其中，所述毕赤酵母的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（2）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉二级种子液；
其中，所述毕赤酵母的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速115rpm，29℃培养40h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速160rpm培养18h，按照质量百分比1%的加量流加甲醇，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速230rpm培养72h后得到木聚糖酶发酵液，其中所述发酵培养基的成分为：125g/L原糖蜜，75g/L玉米DDGS，0.75g/L磷酸二氢铵，0.6g/L碳酸钙，0.5g/L硫酸锰，0.075g/L蛋白酶，0.6g/L植酸酶；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.1%的防腐剂和质量百分比18%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶，其中，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：40%氯化钠、30%山梨酸钾、20%丙酸钠、10%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：45%甘油，35%山梨醇，20%海藻糖。
对比例3
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（1）将毕赤酵母菌种按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉一级种子液；
其中，所述毕赤酵母的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（2）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉二级种子液；
其中，所述毕赤酵母的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（3）将步骤（2）中得到的里氏木霉二级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速115rpm，29℃培养40h，将步骤（2）中得到毕赤酵母二级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速160rpm培养18h，按照质量百分比2%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速230rpm培养72h后得到木聚糖酶发酵液，其中所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围8MeV辐照9min，发酵培养基的成分为：125g/L原糖蜜，75g/L玉米DDGS，0.75g/L磷酸二氢铵，0.6g/L碳酸钙，0.5g/L硫酸锰，0.075g/L蛋白酶，0.6g/L植酸酶；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.1%的防腐剂和质量百分比18%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶，其中，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：40%氯化钠、30%山梨酸钾、20%丙酸钠、10%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：45%甘油，35%山梨醇，20%海藻糖。
对比例4
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（1）将毕赤酵母菌种按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉一级种子液；
其中，所述毕赤酵母的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（2）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉二级种子液；
其中，所述毕赤酵母的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速115rpm，29℃培养40h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速160rpm培养18h，按照质量百分比2%的加量加入粉碎至长度0.5mm～1.5mm的甘蔗渣，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速230rpm培养72h后得到木聚糖酶发酵液，其中所述发酵培养基的成分为：125g/L原糖蜜，75g/L玉米DDGS，0.75g/L磷酸二氢铵，0.6g/L碳酸钙，0.5g/L硫酸锰，0.075g/L蛋白酶，0.6g/L植酸酶；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.1%的防腐剂和质量百分比18%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶，其中，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：40%氯化钠、30%山梨酸钾、20%丙酸钠、10%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：45%甘油，35%山梨醇，20%海藻糖。
对比例5
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（2）将毕赤酵母菌种按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉一级种子液；
其中，所述毕赤酵母的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（3）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉二级种子液；
其中，所述毕赤酵母的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速115rpm，29℃培养40h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速160rpm培养18h，按照质量百分比2%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速230rpm培养72h后得到木聚糖酶发酵液，其中所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围8MeV辐照9min，发酵培养基的成分为：125g/L原糖蜜，75g/L尿素，1g/L磷酸二氢铵，0.6g/L碳酸钙，0.5g/L硫酸锰；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.1%的防腐剂和质量百分比18%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶，其中，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：40%氯化钠、30%山梨酸钾、20%丙酸钠、10%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：45%甘油，35%山梨醇，20%海藻糖。
对比例6
一种木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤：
（3）将毕赤酵母菌种按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉一级种子液；
其中，所述毕赤酵母的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的一级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（4）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃培养10h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，30℃培养18h，得到里氏木霉二级种子液；
其中，所述毕赤酵母的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖,15g/L原糖蜜,13g/L酵母浸膏,12g/L蛋白胨，1.5g/L磷酸二氢铵；所述里氏木霉的二级种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，9g/L原糖蜜，16g/L酵母浸膏，0.75g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸锰，0.4g/L硫酸锌。
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速115rpm，29℃培养40h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速160rpm培养18h，按照质量百分比2%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速230rpm培养72h后得到木聚糖酶发酵液，其中所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围8MeV辐照9min，发酵培养基的成分为：45g/L葡萄糖，30g/L纤维质粉，20g/L酵母浸膏，10g/L蛋白胨，75g/L尿素，1g/L磷酸二氢铵，0.6g/L碳酸钙，0.5g/L硫酸锰；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩3倍；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.1%的防腐剂和质量百分比18%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶，其中，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：40%氯化钠、30%山梨酸钾、20%丙酸钠、10%脱氢乙酸钠，保护剂由以下质量分数的各组分组成：45%甘油，35%山梨醇，20%海藻糖。
实验结果
将实施例1～4，对比例1～5，和对照组1～2进行比较，检测成品后得到以下数据。
表1 木聚糖酶活力检测数据
Figure 481880DEST_PATH_IMAGE002
备注：木聚糖酶活力检测方法采用GB/T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法。
纤维素酶活力检测方法采用GB/T 23881-2009 饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法。
β-葡聚糖酶活力检测方法采用NY/T 911-2004 饲料添加剂 β-葡聚糖酶活力的测定 分光光度法。
果胶酶活力检测方法采用QB 1502-1992 食品添加剂 果胶酶制剂。
由表1可知，将实施例1～4，对比例1～5，跟对照组1～2对比，实施例各组的木聚糖酶活力都有显著的提高，纤维素酶活力、β-葡聚糖酶活力也都有一定程度的提升，说明成功的双菌种生产木聚糖酶工艺不仅能得到更高的木聚糖酶活力，还能提升产品中纤维素酶、β-葡聚糖酶和果胶酶的活力。对比例1、3跟对照组1相比，活力反而有所降低，说明适当的生产工艺是实现毕赤酵母和里氏木霉双菌种共同生产木聚糖酶的关键因素之一。对比例5和实施例1～4和对照组1相比，木聚糖酶活力显著降低，说明以葡萄糖、纤维质粉为代表的传统碳源，以酵母浸膏、蛋白胨、尿素为代表的传统碳源难以成功进行双菌种联合发酵，培养基的组成是实现毕赤酵母、里氏木霉双菌种联合生产木聚糖酶的关键因素之一。对比例2、对比例4与对照组1～2和实施例1～4相比，活力比对照组1～2高，比实施例1～4低，说明用高能电子辐照加速器处理过的甘蔗渣拥有比甲醇和未处理甘蔗渣更加优异的诱导能力，未处理的甘蔗渣诱导能力和甲醇相仿。正是从培养基、生产工艺、诱导物的选择等多方面的优化组合，才成功实现了利用毕赤酵母、里氏木霉双菌种联合生产高活力、多副酶活力的木聚糖酶生产方法。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种木聚糖酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将毕赤酵母菌种按照质量百分比6%～12%的接种量接种到毕赤酵母一级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～30℃培养8h～12h，得到毕赤酵母一级种子液，将里氏木霉的菌种按照质量百分比10%～15%的接种量接种到里氏木霉一级培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～32℃培养16h～20h，得到里氏木霉一级种子液；
（2）将步骤（1）中得到的毕赤酵母一级种子液按照质量百分比6%～12%的接种量接种到毕赤酵母二级种子培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～30℃培养8h～12h，得到毕赤酵母二级种子液，将步骤（1）中得到的里氏木霉一级种子液按照质量百分比10%～15%的接种量接种到里氏木霉二级培养基中，保持溶氧25%～55%，28℃～32℃培养16h～20h，得到里氏木霉二级种子液；
（3）将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比6%～12%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速100rpm～120rpm，28℃～32℃培养36h～42h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比10%～15%的接种量接种到上述经毕赤酵母发酵过的发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速150rpm～170rpm培养16h～18h，按照质量百分比0.5%～5%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速220rpm～240rpm培养72h～78h后得到木聚糖酶发酵液，其中发酵培养基的成分为：120g/L～150g/L原糖蜜，70g/L～90g/L玉米DDGS，0.5g/L～1g/L磷酸二氢铵，0.5g/L～0.75g/L碳酸钙，0.4g/L～0.75g/L硫酸锰，0.05g/L～0.1g/L蛋白酶，0.5g/L～0.75g/L植酸酶，所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围6MeV～8MeV辐照8min～10min；
（4）将步骤（3）得到的发酵醪液进行板框压滤，澄清后超滤浓缩到所需要的酶活力；
（5）向步骤（4）得到的滤液中加入质量百分比0.05%～0.5%的防腐剂和质量百分比15%～25%的保护剂，灌装成为成品木聚糖酶；
其中，步骤（1）和步骤（2）中，毕赤酵母的一级种子培养基和二级种子培养基成分为：15～25g/L葡萄糖,10～20g/L原糖蜜,10～15g/L酵母浸膏,10～15g/L蛋白胨，1～2g/L磷酸二氢铵；步骤(1)和步骤(2)中，里氏木霉的一级种子培养基和二级种子培养基成分为：15～25g/L葡萄糖，8～12g/L原糖蜜，15～25g/L酵母浸膏，0.5～1g/L硫酸铵，0.25～0.5g/L硫酸锰，0.25～0.5g/L硫酸锌。
2.根据权利要求1所述的木聚糖酶的生产方法，其特征在于，步骤（5）中所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：35%～45%氯化钠、20%～35%山梨酸钾、15%～30%丙酸钠、10%～25%脱氢乙酸钠。
3.根据权利要求1所述的木聚糖酶的生产方法，其特征在于，步骤（5）中所述保护剂由以下质量分数的各组分组成：40%～50%甘油、35%～45%山梨醇、10%～20%海藻糖。
4.根据权利要求1所述的木聚糖酶的生产方法，其特征在于，步骤（3）为，将步骤（2）中得到的毕赤酵母二级种子液按照质量百分比10%的接种量接种到发酵培养基中，保持溶氧25%～55%，pH4.2以上，转速115rpm，29℃培养40h，将步骤（2）中得到里氏木霉二级种子液按照质量百分比12%的接种量接种到发酵培养基中，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速160rpm培养18h，按照质量百分比2%的加量加入诱导物，保持温度、溶氧、pH条件不变，转速230rpm培养72h后得到木聚糖酶发酵液。
5.根据权利要求1所述的木聚糖酶的生产方法，其特征在于，步骤（3）中，所述发酵培养基的成分为：125g/L原糖蜜，75g/L玉米DDGS，0.75g/L磷酸二氢铵，0.6g/L碳酸钙，0.5g/L硫酸锰，0.075g/L蛋白酶，0.6g/L植酸酶。
6.根据权利要求1所述的木聚糖酶的生产方法，其特征在于，步骤（3）中，所述诱导物由以下方法制得：将甘蔗渣粉碎至长度0.5mm～1.5mm，用高能电子辐照加速器能量范围8MeV辐照9min。
7.根据权利要求1所述的木聚糖酶的生产方法，其特征在于，步骤（5）中，所述保护剂由以下质量分数的各组分组成：45%甘油，35%山梨醇，20%海藻糖。
8.根据权利要求1所述的木聚糖酶的生产方法，其特征在于，步骤（5）中，所述防腐剂由以下质量分数的各组分组成：40%氯化钠、30%山梨酸钾、20%丙酸钠、10%脱氢乙酸钠。
CN201610233030.6A 2016-04-15 2016-04-15 一种木聚糖酶的生产方法 Active CN107299093B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610233030.6A CN107299093B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 一种木聚糖酶的生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610233030.6A CN107299093B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 一种木聚糖酶的生产方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107299093A CN107299093A (zh) 2017-10-27
CN107299093B true CN107299093B (zh) 2020-06-05

Family

ID=60137226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610233030.6A Active CN107299093B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 一种木聚糖酶的生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107299093B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112442495B (zh) * 2018-08-06 2022-11-29 江阴唯农生物科技有限公司 一种混合发酵产酶工艺

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102010857A (zh) * 2010-11-09 2011-04-13 湖南鸿鹰祥生物工程股份有限公司 利用乳清粉生产酸性木聚糖酶的方法
CN102392004A (zh) * 2011-10-27 2012-03-28 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶复合酶及其制备方法
CN103602645A (zh) * 2013-11-12 2014-02-26 济南天天香有限公司 木聚糖酶的制备方法
CN104357428A (zh) * 2014-11-13 2015-02-18 河南天冠纤维乙醇有限公司 一种木聚糖酶的液态深层发酵方法
CN104651383A (zh) * 2015-02-11 2015-05-27 安徽科技学院 一种重组毕赤酵母工程菌及其生产方法
CN105039271A (zh) * 2015-06-25 2015-11-11 山东祥维斯生物科技有限公司 一种提高多种酶制剂产量的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102010857A (zh) * 2010-11-09 2011-04-13 湖南鸿鹰祥生物工程股份有限公司 利用乳清粉生产酸性木聚糖酶的方法
CN102392004A (zh) * 2011-10-27 2012-03-28 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶复合酶及其制备方法
CN103602645A (zh) * 2013-11-12 2014-02-26 济南天天香有限公司 木聚糖酶的制备方法
CN104357428A (zh) * 2014-11-13 2015-02-18 河南天冠纤维乙醇有限公司 一种木聚糖酶的液态深层发酵方法
CN104651383A (zh) * 2015-02-11 2015-05-27 安徽科技学院 一种重组毕赤酵母工程菌及其生产方法
CN105039271A (zh) * 2015-06-25 2015-11-11 山东祥维斯生物科技有限公司 一种提高多种酶制剂产量的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Differential expression of the Trichoderma reesei beta-xylanase II (xyn2) gene in the xylose-fermenting yeast Pichia stipitis.;Den Haan R 等;《Appl Microbiol Biotechnol.》;20011130;第57卷(第4期);521-527 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107299093A (zh) 2017-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
An et al. Sequential solid-state and submerged cultivation of the white rot fungus Pleurotus ostreatus on biomass and the activity of lignocellulolytic enzymes
CA2697090A1 (en) Method for cellulase production
BRPI0612207A2 (pt) método para a produção de etanol
KR101918732B1 (ko) 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법
CN101979627A (zh) 利用谷氨酸发酵废菌体制备谷氨酸发酵有机氮添加物的方法
Li et al. Expression of a recombinant Lentinula edodes cellobiohydrolase by Pichia pastoris and its effects on in vitro ruminal fermentation of agricultural straws
Kumar et al. Production of L-lactic acid from starch and food waste by amylolytic Rhizopus oryzae MTCC 8784
Mishra et al. Lignocellulolytic enzyme production from submerged fermentation of paddy straw
US20150361407A1 (en) Enzyme production compositions and methods
CN107299093B (zh) 一种木聚糖酶的生产方法
US20150152400A1 (en) Use of co2 to deactivate a cellulolytic microorganism used in the biochemical conversion of lignocellulosic materials
CN108949725B (zh) 复合酶制剂的生产和纯化工艺
Afifi Effective technological pectinase and cellulase by Saccharomyces cervisiae utilizing food wastes for citric acid production
CN103255118B (zh) 一种β-甘露聚糖酶、编码基因及其生产菌和应用
Fadel et al. Clean production of xylanase from white corn flour by Aspergillus fumigates F-993 under solid state fermentation
Sajith et al. Production and partial purification of cellulase from a new isolate, Penicillium verruculosum BS3
JP2011182675A (ja) セルラーゼ組成物及びその利用
Premkumar et al. Cellulase and xylanase production by Pleurotus sp. on mixed substrate system
CN105331641A (zh) 一种使用水葫芦作为发酵原料制备丁二酸的方法
US20210355511A1 (en) Process for simultaneous production of citric acid and cellulolytic enzymes
CN104664053A (zh) 一种利用剑麻废水发酵豆粕的方法
KR101816859B1 (ko) 감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스 제조 방법
CN115786125B (zh) 一种高耐受氨、酚类的小球藻及用途和制备方法
CN108841811B (zh) 一种混合发酵产酶工艺
CN103045569B (zh) 添加高聚木糖提高纤维素酶生产效率的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant