CN107296061A - 一种防治番茄青枯病的微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防治番茄青枯病的微生物菌剂及其制备方法，该菌剂由枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌分别经活化、培养、发酵后得到的菌悬液，按体积比1.5‑3:1:1混合而制成。本发明由复合菌群构建，其防病效果达60％以上，且防治效果高于单施农药及单一功能菌，为番茄青枯病的生物防治提供了一种有效途径。

Description

一种防治番茄青枯病的微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物肥料领域，具体地说，涉及一种防治番茄青枯病的微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
番茄青枯病是由青枯病菌引起的一种土传性维管束病害，该病分布范围比较广泛，尤其是在热带及亚热带地区，常常能给这个地区造成极大的损失，严重影响了番茄的农业生产。番茄青枯病菌菌系较为复杂，寄主广泛，除对番茄造成危害外，像烟草、花生、香蕉等数百种作物也是青枯病的常见寄主作物。番茄青枯病菌传播介质广，途径多，易引起重复侵染，且存活时间长，最高可达3年。
目前，番茄青枯病的防治主要有化学药剂、撒施石灰、水早轮作、抗病育种、生物防治等方式。化学药剂虽见效快，但青枯菌易产生耐药性，且大量施用化学药剂对生态环境亦造成极大的污染。撒施石灰虽可减轻病害发生，但易造成土壤板结。水早轮作要求轮作年限较长，实施起来较困难。抗病育种需要较为理想的抗源材料，但目前抗源材料筛选进展缓慢。生物防治主要采用“以菌治菌”理念来有效控制青枯病害的发生，具有可利用资源丰富、成本低廉、能够避免环境二次污染等优点，是目前防治青枯病研究与应用的热点之一。
近几年来，虽然国内外学者及专家在番茄青枯菌生物防治方面取得不少研究成果，但生物防治方法目前大都仍处于试验阶段，进入实际生产的很少，且现处于试验阶段的菌种多为单一菌株，用于抗青枯病的复合菌群较少。另外，目前抗青枯病的功能菌种类较少，仍然需要进一步筛选并开发出品种多的抗青枯病功能菌株。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种防治番茄青枯病的微生物菌剂及其制备方法，该菌剂由复合菌群构建，其防病效果达60％以上，且防治效果显著优于单施农药及单一功能菌，为番茄青枯病的生物防治提供了一种有效途径。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种防治番茄青枯病的微生物菌剂，按照体积比由以下组分构成：枯草芽孢杆菌菌悬液1.5份-3份、侧孢芽孢杆菌菌悬液1份和多粘芽孢杆菌菌悬液1份。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液的浓度均大于1×108cfu/ml。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液通过以下方法制备得到：在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌分别接种至TSA培养基上，28-30℃下培养48h；之后分别挑取各菌单菌落接种至TSA液体培养基中，28-30℃，200-220r/min下振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液；镜检，确保各菌菌悬液浓度大于1×108cfu/ml。
进一步地，TSA培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH值7.3；灭菌条件为：压强0.1-0.15MPa，温度121℃，时间30min。
本发明还提供一种防治番茄青枯病的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液：在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌分别接种至TSA培养基上培养；之后分别挑取各菌单菌落接种至TSA液体培养基中振荡培养，即得枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液；
步骤2、称量：按照体积比称量以下组分：枯草芽孢杆菌菌悬液1.5份-3份、侧孢芽孢杆菌菌悬液1份和多粘芽孢杆菌菌悬液1份；
步骤3、混合：将称量好的枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液混合均匀，制备得到防治番茄青枯病的微生物菌剂。
进一步地，步骤1中的所述枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液的浓度均大于1×108cfu/ml。
进一步地，步骤1中的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌在TSA培养基上的培养条件是：温度28-30℃，时间48h。
进一步地，步骤1中的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌单菌落在TSA液体培养基上的培养条件是：温度28-30℃，转速200-220r/min，时间24h。
进一步地，步骤1中的TSA培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH值7.3。
进一步地，步骤1中的TSA培养基灭菌条件为：压强0.1-0.15MPa，温度121℃，时间30min。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明采用枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌为菌种，经活化、培养、发酵制备成菌悬液后应用于番茄上，为番茄青枯病的生物防治提供了一种有效途径。
2)本菌剂经盆栽试验验证，其番茄青枯病防治效果达60％以上，且防治效果高于单施农药及单一功能菌。
3)使用本发明菌剂后，可间接减少农药使用量，进而减少农药大量施用对环境造成的污染。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明提供一种防治番茄青枯病的微生物菌剂，按照体积比由以下组分构成：枯草芽孢杆菌菌悬液1.5份-3份、侧孢芽孢杆菌菌悬液1份和多粘芽孢杆菌菌悬液1份。
本发明提供一种防治番茄青枯病的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备各菌菌悬液
在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌分别接种至TSA培养基上，28-30℃下培养48h。之后分别挑取各菌单菌落接种至TSA液体培养基中，28-30℃，200-220r/min下振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液。镜检，确保各菌菌悬液浓度大于1×108cfu/ml。
其中TSA培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH值7.3。在0.1-0.15MPa，121℃条件下灭菌30min，备用。
2)配制
将1)中制备得到的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液，按体积比1.5-3:1:1混合均匀，制备得到防治番茄青枯病的微生物菌剂。
实施例1
一种防治番茄青枯病的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备各菌菌悬液
在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌分别接种至TSA培养基上，29℃下培养48h。之后分别挑取各菌单菌落接种至TSA液体培养基中，29℃，210r/min下振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液。镜检，确保各菌菌悬液浓度大于1×108cfu/ml。
其中TSA培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH值7.3。在0.12MPa，121℃条件下灭菌30min，备用。
2)配制
将1)中制备得到的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液，按体积比2:1:1混合均匀，制备得到防治番茄青枯病的微生物菌剂。
实施例2
一种防治番茄青枯病的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备各菌菌悬液
在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌分别接种至TSA培养基上，28℃下培养48h。之后分别挑取各菌单菌落接种至TSA液体培养基中，28℃，220r/min下振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液。镜检，确保各菌菌悬液浓度大于1×108cfu/ml。
其中TSA培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH值7.3。在0.1MPa，121℃条件下灭菌30min，备用。
2)配制
将1)中制备得到的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液，按体积比1.5:1:1混合均匀，制备得到防治番茄青枯病的微生物菌剂。
实施例3
一种防治番茄青枯病的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备各菌菌悬液
在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌分别接种至TSA培养基上，30℃下培养48h。之后分别挑取各菌单菌落接种至TSA液体培养基中，30℃，200r/min下振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液。镜检，确保各菌菌悬液浓度大于1×108cfu/ml。
其中TSA培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH值7.3。在0.15MPa，121℃条件下灭菌30min，备用。
2)配制
将1)中制备得到的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液，按体积比3:1:1混合均匀，制备得到防治番茄青枯病的微生物菌剂。
下面结合具体的实验数据来说明微生物菌剂对番茄青枯病防治效果：
(1)青枯病菌接菌方法
首先将供试土壤曝晒2天，消毒后装盆，每盆钵装土6kg，后接青枯病菌菌液(菌悬液浓度大于1×108cfu/ml)200mL/盆，搅拌均匀，保湿培养5天，备用。
(2)功能菌接菌方法
选取长势一致的4-6叶番茄幼苗移栽到预处理过青枯菌的盆钵中，移栽时分别用处理3、4、5、6的功能菌液蘸根10min，移栽7天后进行功能菌液灌根处理，各功能菌(菌悬液浓度大于1×108cfu/ml)接种量60mL/每盆。
(3)农药处理方法
在预处理过青枯菌的盆钵中加入47％加瑞农可湿性粉剂1000倍液100ml，拌匀，放置3天，使农药与青枯菌充分作用后，移栽番茄苗。移栽7天后进行灌根处理，每盆加入47％加瑞农可湿性粉剂1000倍液50ml。
(4)试验设计
处理1：对照(CK)，只接青枯病菌；
处理2：农药+青枯病菌；
处理3：实施例1制备的微生物菌剂+青枯病菌；
处理4：接枯草芽孢杆菌+青枯病菌；
处理5：接侧孢芽孢杆菌+青枯病菌；
处理6：接多粘芽孢杆菌+青枯病菌。
试验共设6个处理，每处理3个重复，每个重复10盆。试验期间正常水分管理。另外，为满足番茄生长需求，在装土时每盆追施尿素2.06g，过磷酸钙0.94g，硫酸钾2.72g。移栽14天后，记录番茄发病情况，计算其病情指数及青枯病抑制率，统计结果见表1、2。
番茄青枯病病情调查分级标准采用5级标准法，即0级：无病；1级：植株有1-2片叶凋萎；2级：植株有3-5片叶凋萎；3级：植株大部分叶片凋萎；4级：植株凋萎枯死或即将枯死。
病情指数＝[Σ(病级株数×病害级数)/(该处理盆栽苗总和×发病最重级的代表数值)]×100。
抑制率(％)＝(对照发病指数-处理病情指数)×100/对照发病指数。
表1番茄青枯病发病情况统计
表2盆栽14d对青枯病菌的抑制效果
以上结果表明，在同时接种番茄青枯病菌的基础上，本发明微生物菌剂处理番茄后，青枯病病情指数较低，抑制率达61.57％，可见其防治效果高于农药处理和单一菌处理，说明在一定程度上本发明的微生物菌剂对番茄青枯病有一定的防治效果。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种防治番茄青枯病的微生物菌剂，其特征在于，按照体积比由以下组分构成：枯草芽孢杆菌菌悬液1.5份-3份、侧孢芽孢杆菌菌悬液1份和多粘芽孢杆菌菌悬液1份。
2.根据权利要求1所述的防治番茄青枯病的微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液的浓度均大于1×108cfu/ml。
3.根据权利要求1所述的防治番茄青枯病的微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液通过以下方法制备得到：在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌分别接种至TSA培养基上，28-30℃下培养48h；之后分别挑取各菌单菌落接种至TSA液体培养基中，28-30℃，200-220r/min下振荡培养24h，即得枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌菌悬液；镜检，确保各菌菌悬液浓度大于1×108cfu/ml。
4.根据权利要求3所述的防治番茄青枯病的微生物菌剂，其特征在于，TSA培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH值7.3；灭菌条件为：压强0.1-0.15MPa，温度121℃，时间30min。
5.一种防治番茄青枯病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、制备枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液：在无菌条件下，将保存在-4℃环境下的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌分别接种至TSA培养基上培养；之后分别挑取各菌单菌落接种至TSA液体培养基中振荡培养，即得枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液；
步骤2、称量：按照体积比称量以下组分：枯草芽孢杆菌菌悬液1.5份-3份、侧孢芽孢杆菌菌悬液1份和多粘芽孢杆菌菌悬液1份；
步骤3、混合：将称量好的枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液混合均匀，制备得到防治番茄青枯病的微生物菌剂。
6.根据权利要求5所述的防治番茄青枯病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤1中的所述枯草芽孢杆菌菌悬液、侧孢芽孢杆菌菌悬液和多粘芽孢杆菌菌悬液的浓度均大于1×108cfu/ml。
7.根据权利要求5所述的防治番茄青枯病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤1中的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌在TSA培养基上的培养条件是：温度28-30℃，时间48h。
8.根据权利要求5所述的防治番茄青枯病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤1中的枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌单菌落在TSA液体培养基上的培养条件是：温度28-30℃，转速200-220r/min，时间24h。
9.根据权利要求5所述的防治番茄青枯病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤1中的TSA培养基为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH值7.3。
10.根据权利要求9所述的防治番茄青枯病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤1中的TSA培养基灭菌条件为：压强0.1-0.15MPa，温度121℃，时间30min。
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