CN107267445A - 一种提高哺乳动物体外受精‑胚胎移植着床成功率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高哺乳动物体外受精‑胚胎移植着床成功率的方法，(1)制备培养基和洗涤液；(2)获得培养到囊胚阶段的胚胎；(3)将步骤(2)中所得囊胚阶段的胚胎放置在CO2培养箱内的步骤(1)制备的培养基中孵育30分钟，CO2培养箱内的CO2气体浓度为5％，CO2培养箱内的温度37℃；(4)30分钟后取出囊胚，用所述洗涤液洗涤囊胚3次，15秒/次；(5)将洗涤后的囊胚放入移植液中，进行宫腔内移植。本发明用于动物实验可以提高IVF‑ET动物胚胎移植的植入率，为IVF‑ET的畜牧繁育及临床运用具有广泛运用价值。
Description
技术领域
本发明涉及体外受精-胚胎移植技术领域，具体是一种提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法。
背景技术
体外受精-胚胎移植技术(In vitro fertility and embryo transfer、IVF-ET)是将男性精子和女性卵子取出后，在体外促使精卵结合，使卵子受精，再将受精卵在体外培育成胚胎，最终将胚胎移移植进女性子宫，促使其植入女性子宫，达到使女性受孕的目的。尽管随着技术的不断进步，胚胎移植后的临床妊娠率有了较大的提升，但总体成功率仍然较低，约为54％。如何有效改善胚胎的着床，提高临床妊娠率是IVF-ET技术的研究热点。本发明基于动物实验结果提出：使用雌激素短时处理移植前胚胎，可以显著提高胚胎移植的植入成功率。
着床是胚胎与子宫内膜相互作用，逐渐植入子宫内膜的过程。虽然不同动物的着床过程存在差异，但都有赖于卵巢分泌的雌、孕激素的作用。成功着床必须具备两个要素，这就是在雌激素的作用下，子宫内膜具备对胚胎的接受性，以及与子宫内膜同步发育到囊胚期的胚胎的激活。
雌激素对靶细胞的作用除了传统的基因组效应外，近期，以膜受体介导的雌激素快速效应成为雌激素作用的研究热点，G蛋白偶联受体30(G protein coupled receptor30、GPR30)又称为G蛋白偶联雌激素受体(G protein coupled estrogen receptor 1、GPER1)是最近发现的一种膜结合的雌激素受体，可以介导雌激素对靶细胞的效应。我们的研究已证实GPR30在动物早期胚胎中有表达，并可以介导雌激素对动物胚胎的激活作用，同时小鼠胚胎移植前用雌激素处理后，可以提高小鼠胚胎的着床率。基于前述研究结果我们提出，在开展人类辅助生殖技术运用IVF-ET治疗不孕患者时，将移植前胚胎采用雌激素预处理，可以提高患者胚胎的植入率，提升患者接受人类辅助生殖技术的临床妊娠率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，包括以下步骤：
(1)制备培养基和洗涤液：
所述培养基的组成为：17β-estrodiol 0.5-1.5μmol/L、NaCl 4-7g/L、KCl 0.2-0.5g/L、CaCl2·2H2O 0.1-0.35g/L、KH2PO4 0.05-0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.2-0.3g/L、NaHCO30.2-0.45g/L、HEPES 3-7g/L、Sodium lactate 2-3g/L、Sodium pyruvate 0.02-0.06g/L、Glucose 0.5-1.5g/L、Bovine serum albumin(BSA)2-6g/L、Penicillin G(potassiumsalt)0.02-0.08g/L、Streptomycin sulfate 0.02-0.08g/L；上述浓度为溶解后终浓度，溶质用双蒸水溶解后，用0.1-0.3mol/L NaOH调节pH至7.2-7.4、渗透压285-287mosmole，采用微孔滤过器滤过后置于无菌容器，4℃保存，保质期2周；
所述洗涤液的组成为：NaCl 6-10g，KCl 0.1-0.3g，KH2PO4 0.1-0.35g和K2HPO4 1-3g，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，4℃保存；
(2)获得培养到囊胚阶段的胚胎：获取雌性卵细胞，在体外正常受精，选取发育速度正常的胚胎，用上述培养基在体外培养至囊胚阶段；
(3)将步骤(2)中所得囊胚阶段的胚胎放置在CO2培养箱内的步骤(1)制备的培养基中孵育30分钟，CO2培养箱内的CO2气体浓度为5％，CO2培养箱内的温度37℃；
(4)30分钟后取出囊胚，用所述洗涤液洗涤囊胚3次，15秒/次；
(5)将洗涤后的囊胚放入移植液中，进行宫腔内移植。
作为本发明进一步的方案：步骤(2)中所述胚胎为哺乳动物的胚胎。
作为本发明再进一步的方案：所述哺乳动物包括人。
作为本发明再进一步的方案：步骤(1)中所述的培养基的组成为：17β-estrodiol1μmol/L、NaCl 5.53g/L、KCl 0.36g/L、CaCl2·2H2O 0.25g/L、KH2PO4 0.16g/L、MgSO4·7H2O0.29g/L、NaHCO3 0.35g/L、HEPES 4.97g/L、Sodium lactate 2.6g/L、Sodium pyruvate0.04g/L、Glucose 1g/L、Bovine serum albumin(BSA)4g/L、Penicillin G(potassiumsalt)0.06g/L、Streptomycin sulfate 0.05g/L。
作为本发明再进一步的方案：步骤(1)中所述洗涤液的组成为：NaCl 7.9g、KCl0.2g、KH2PO4 0.24g和K2HPO4 1.8g。
作为本发明再进一步的方案：步骤(1)中所述洗涤液的组成为：NaCl 6-10g，KCl0.1-0.3g，Na2HPO4 1-3g和K2HPO4 1-3g。
作为本发明再进一步的方案：步骤(1)中所述洗涤液的组成为：NaCl 7.9g、KCl0.2g、Na2HPO4 1.44g和K2HPO4 1.8g。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明用于动物实验可以提高IVF-ET动物胚胎移植的植入率，为IVF-ET的畜牧繁育及临床运用具有广泛运用价值。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，包括以下步骤：
(1)制备培养基和洗涤液：
所述培养基的组成为：17β-estrodiol 0.5μmol/L、NaCl 4g/L、KCl 0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.1g/L、KH2PO4 0.05g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、NaHCO3 0.2g/L、HEPES 3g/L、Sodium lactate 2g/L、Sodium pyruvate 0.02g/L、Glucose 0.5g/L、Bovine serumalbumin(BSA)2g/L、Penicillin G(potassium salt)0.02g/L、Streptomycin sulfate0.02g/L；上述浓度为溶解后终浓度，溶质用双蒸水溶解后，用0.1mol/L NaOH调节pH至7.2、渗透压285mosmole，采用微孔滤过器滤过后置于无菌容器，4℃保存，保质期2周；
所述洗涤液的组成为：NaCl 6g，KCl 0.1g，KH2PO4 0.1g(或Na2HPO4 1g)和K2HPO41g，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，4℃保存；
(2)获得培养到囊胚阶段的胚胎：获取雌性卵细胞，在体外正常受精，选取发育速度正常的胚胎，用上述培养基在体外培养至囊胚阶段：所述胚胎为哺乳动物的胚胎，包括人；
(3)将步骤(2)中所得囊胚阶段的胚胎放置在CO2培养箱内的步骤(1)制备的培养
基中孵育30分钟，CO2培养箱内的CO2气体浓度为5％，CO2培养箱内的温度37℃；
(4)30分钟后取出囊胚，用所述洗涤液洗涤囊胚3次，15秒/次；
(5)将洗涤后的囊胚放入移植液中，进行宫腔内移植。
实施例2
本发明实施例中，一种提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，包括以下步骤：
(1)制备培养基和洗涤液：
所述的培养基的组成为：17β-estrodiol 1μmol/L、NaCl 5.53g/L、KCl 0.36g/L、CaCl2·2H2O 0.25g/L、KH2PO4 0.16g/L、MgSO4·7H2O 0.29g/L、NaHCO3 0.35g/L、HEPES4.97g/L、Sodium lactate 2.6g/L、Sodium pyruvate 0.04g/L、Glucose 1g/L、Bovineserum albumin(BSA)4g/L、Penicillin G(potassium salt)0.06g/L、Streptomycinsulfate 0.05g/L；上述浓度为溶解后终浓度，溶质用双蒸水溶解后，用0.2mol/L NaOH调节pH至7.3、渗透压286mosmole，采用微孔滤过器滤过后置于无菌容器，4℃保存，保质期2周；
所述洗涤液的组成为：NaCl 7.9g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.24g(或Na2HPO4 1.44g)和K2HPO4 1.8g，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，4℃保存；
(2)获得培养到囊胚阶段的胚胎：获取雌性卵细胞，在体外正常受精，选取发育速度正常的胚胎，用上述培养基在体外培养至囊胚阶段：所述胚胎为哺乳动物的胚胎，包括人；
(3)将步骤(2)中所得囊胚阶段的胚胎放置在CO2培养箱内的步骤(1)制备的培养基中孵育30分钟，CO2培养箱内的CO2气体浓度为5％，CO2培养箱内的温度37℃；
(4)30分钟后取出囊胚，用所述洗涤液洗涤囊胚3次，15秒/次；
(5)将洗涤后的囊胚放入移植液中，进行宫腔内移植。
实施例3
本发明实施例中，一种提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，包括以下步骤：
(1)制备培养基和洗涤液：
所述培养基的组成为：17β-estrodiol 1.5μmol/L、NaCl 7g/L、KCl 0.5g/L、CaCl2·2H2O 0.35g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、NaHCO3 0.45g/L、HEPES 7g/L、Sodium lactate 3g/L、Sodium pyruvate 0.06g/L、Glucose 1.5g/L、Bovine serumalbumin(BSA)6g/L、Penicillin G(potassium salt)0.08g/L、Streptomycin sulfate0.08g/L；上述浓度为溶解后终浓度，溶质用双蒸水溶解后，用0.3mol/L NaOH调节pH至7.4、渗透压287mosmole，采用微孔滤过器滤过后置于无菌容器，4℃保存，保质期2周；
所述洗涤液的组成为：NaCl 10g，KCl 0.3g，KH2PO4 0.35g(或Na2HPO4 3g)和K2HPO43g，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，4℃保存；
(2)获得培养到囊胚阶段的胚胎：获取雌性卵细胞，在体外正常受精，选取发育速度正常的胚胎，用上述培养基在体外培养至囊胚阶段：所述胚胎为哺乳动物的胚胎，包括人；
(3)将步骤(2)中所得囊胚阶段的胚胎放置在CO2培养箱内的步骤(1)制备的培养基中孵育30分钟，CO2培养箱内的CO2气体浓度为5％，CO2培养箱内的温度37℃；
(4)30分钟后取出囊胚，用所述洗涤液洗涤囊胚3次，15秒/次；
(5)将洗涤后的囊胚放入移植液中，进行宫腔内移植。
体外受精-胚胎移植技术(In vitro fertility and embryo transfer、IVF-ET)的妊娠率仍较低，本发明用于动物实验可以提高IVF-ET动物胚胎移植的植入率，为IVF-ET的畜牧繁育及临床运用具有广泛运用价值。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备培养基和洗涤液：
所述培养基的组成为：17β-estrodiol 0.5-1.5μmol/L、NaCl 4-7g/L、KCl 0.2-0.5g/L、CaCl2·2H2O 0.1-0.35g/L、KH2PO4 0.05-0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.2-0.3g/L、NaHCO3 0.2-0.45g/L、HEPES 3-7g/L、Sodium lactate 2-3g/L、Sodium pyruvate 0.02-0.06g/L、Glucose 0.5-1.5g/L、Bovine serum albumin(BSA)2-6g/L、Penicillin G(potassiumsalt)0.02-0.08g/L、Streptomycin sulfate 0.02-0.08g/L；上述浓度为溶解后终浓度，溶质用双蒸水溶解后，用0.1-0.3mol/L NaOH调节pH至7.2-7.4、渗透压285-287mosmole，采用微孔滤过器滤过后置于无菌容器，4℃保存，保质期2周；
所述洗涤液的组成为：NaCl 6-10g，KCl 0.1-0.3g，KH2PO4 0.1-0.35g和K2HPO4 1-3g，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，4℃保存；
(2)获得培养到囊胚阶段的胚胎：获取雌性卵细胞，在体外正常受精，选取发育速度正常的胚胎，用上述培养基在体外培养至囊胚阶段；
(3)将步骤(2)中所得囊胚阶段的胚胎放置在CO2培养箱内的步骤(1)制备的培养基中孵育30分钟，CO2培养箱内的CO2气体浓度为5％，CO2培养箱内的温度37℃；
(4)30分钟后取出囊胚，用所述洗涤液洗涤囊胚3次，15秒/次；
(5)将洗涤后的囊胚放入移植液中，进行宫腔内移植。
2.根据权利要求1所述的提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，其特征在于，步骤(2)中所述胚胎为哺乳动物的胚胎。
3.根据权利要求2所述的提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，其特征在于，所述哺乳动物包括人。
4.根据权利要求1所述的提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的培养基的组成为：17β-estrodiol 1μmol/L、NaCl 5.53g/L、KCl0.36g/L、CaCl2·2H2O 0.25g/L、KH2PO4 0.16g/L、MgSO4·7H2O 0.29g/L、NaHCO3 0.35g/L、HEPES 4.97g/L、Sodium lactate 2.6g/L、Sodium pyruvate 0.04g/L、Glucose 1g/L、Bovine serum albumin(BSA)4g/L、Penicillin G(potassium salt)0.06g/L、Streptomycin sulfate 0.05g/L。
5.根据权利要求1所述的提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，其特征在于，步骤(1)中所述洗涤液的组成为：NaCl 7.9g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.24g和K2HPO41.8g。
6.根据权利要求1所述的提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，其特征在于，步骤(1)中所述洗涤液的组成为：NaCl 6-10g，KCl 0.1-0.3g，Na2HPO41-3g和K2HPO41-3g。
7.根据权利要求6所述的提高哺乳动物体外受精-胚胎移植着床成功率的方法，其特征在于，步骤(1)中所述洗涤液的组成为：NaCl 7.9g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g和K2HPO41.8g。
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|---|---|---|---|---|
| CN101779989A (zh) * | 2010-01-19 | 2010-07-21 | 广东温氏食品集团有限公司 | 猪体外受精和胚胎移植方法 |
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