CN107245498A

CN107245498A - 猪pCRTC3‑sgRNA表达载体的构建方法及用途

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Publication number: CN107245498A
Application number: CN201710518486.1A
Authority: CN
Inventors: 单体中; 刘嘉琪; 徐子叶; 汪以真
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2017-10-13
Anticipated expiration: 2037-06-30
Also published as: CN107245498B

Abstract

本发明公开了一种猪CRTC3的pCRTC3‑sgRNA表达载体的构建方法，包括以下步骤：1)、根据载体的内切酶位点信息和pCRTC3序列得到4个靶序列，根据所述靶序列设计并合成4对sgRNA引物；2)、pCRTC3‑sgRNA表达载体的构建：BbsI酶切的pX330‑Cas9载体与pCRTC3的sgRNA引物退火后产物连接转化，得到pCRTC3‑sgRNA表达载体的重组质粒。本发明还同时公开了上述pCRTC3‑sgRNA表达载体的用途：用于敲除猪细胞中pCRTC3基因的表达；用于研究pCRTC3基因对猪肠道上皮细胞IPEC‑J2细胞紧密连接蛋白和糖脂代谢关键基因表达产生的影响。

Description

猪pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法及用途

技术领域

本发明涉及一种猪CRTC3(pCRTC3)基因的pX330-Cas9-pCRTC3-sgRNA(pCRTC3-sgRNA)表达载体的构建方法及用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。

背景技术

糖脂代谢是最主要的生命活动之一，直接影响着动物的脂肪沉积。在畜牧生产中，糖脂代谢直接影响着畜产品的产量和品质；同时，糖脂代谢也与人类健康息息相关。因此，探讨动物糖脂代谢及其对脂肪沉积的影响及调控机制，对畜牧生产和人类健康都有非常重要的意义。研究证实，环磷酸腺苷(cAMP)信号通路直接调控能量平衡和养分分配。cAMP信号通路主要是通过cAMP应答元件结合蛋白(CREB)及其调节转录辅激活因子(CRTCs)发挥转录调节功能CRTC3是CRTCs家族的一员，在糖脂代谢过程中发挥着重要的功能。

CRTC3具有高度保守的N端CREB结合域，在细胞核上与CREB的bZIP结构域结合并提高CREB的活性。CRTC3的亚细胞定位主要受磷酸化调控，去磷酸化介导的CRTC3进核是上调CREB靶基因的一个关键步骤。研究发现，CRTC3去磷酸化促进肝细胞中糖原异生基因表达、增强葡萄糖生成。在肌肉中，CRTC3的去磷酸化使其快速转运进核，促进PGC1a基因表达，并影响肌肉内脂肪代谢和沉积。在脂肪组织中，SIK2直接磷酸化CRTC3，调控脂肪细胞中GLUT4表达和葡萄糖摄取；全身敲除CRTC3的小鼠能量消耗增加、抑制肥胖。而且，CRTC3可能与少年的肥胖相关。研究表明，STK11的底物如AMPK能磷酸化CRTC3，抑制CREB的靶基因表达。最近我们研究发现，STK11与CRTC3能直接互作，STK11缺失促进CRTC3进核并影响脂肪细胞分化。提示：CRTC3的亚细胞定位可能与脂肪细胞分化和脂质代谢密切相关(请见研究基础)。但目前关于CRTC3在脂质代谢方面的研究报道甚少，未见关于猪CRTC3的研究报道。因此，开展pCRTC3在动物肠道功能、脂肪代谢和肌肉发育中的功能研究具有重要的意义。

CRISPR/cas9基因编辑技术一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别与编辑，是一种较高效的基因定点修饰技术，具有速度快、效率高、简单经济等特点，在哺乳类细胞模型及动物模型构建的应用前景非常广阔。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法，以及该pCRTC3-sgRNA表达载体的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪CRTC3(pCRTC3)的pCRTC3-sgRNA(pX330-Cas9-pCRTC3-sgRNA)表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)、根据载体的内切酶位点信息和pCRTC3序列(pCRTC3全长基因序列)得到4个靶序列，根据所述靶序列设计并合成4对sgRNA引物；

2)、pCRTC3的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建：BbsI酶切的pX330-U6-Chimeric-BB-CBh-hSpCas9(缩写为pX330-Cas9)载体与pCRTC3的sgRNA引物退火后产物连接转化，得到pCRTC3-sgRNA表达载体的重组质粒。

作为本发明的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法的改进，步骤1)为：根据pCRTC3全长基因序列，筛选并设计4对sgRNA引物；该4对sgRNA引物分别为：

引物Ⅰ：

pCRTC3-sg1S:5′-CACCGGAGAATGATGTCCACGGGGA-3′

pCRTC3-sg1AS:5′-AAACTCCCCGTGGACATCATTCTCC-3′，

引物Ⅱ：

pCRTC3-sg2S:5′-CACCGGGCCAGGAGAAAGTGTGAGG-3′

pCRTC3-sg2AS:5′-AAACCCTCACACTTTCTCCTGGCCC-3′，

引物Ⅲ：

pCRTC3-sg3S:5′-CACCGGCTGAGGTCTTTGAACAGGC-3′

pCRTC3-sg3AS:5′-AAACGCCTGTTCAAAGACCTCAGCC-3′。

引物Ⅳ：

pCRTC3-sg4S:5′-CACCGGTCCTTCCCCAGCCCGTTGA-3′

pCRTC3-sg4AS:5′-AAACTCAACGGGCTGGGGAAGGACC-3′。

作为本发明的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法的进一步改进，步骤2)为：将pX330-Cas9质粒进行BbsI酶切后，与pCRTC3的sgRNA引物退火后得到的pCRTC3的DNA片段连接，连接产物采用热激转化大肠杆菌；得到pCRTC3的pCRTC3-sgRNA表达载体的重组质粒。

作为本发明的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法的进一步改进，将步骤2)所得的pCRTC3-sgRNA表达载体进行鉴定：

通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为特异性上游引物和表达载体的本身引物：5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3′；测序引物为：5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′。

本发明还同时提供了按照上述方法所得的pCRTC3-sgRNA表达载体的用途：用于研究pCRTC3基因对猪肠道上皮细胞IPEC-J2细胞紧密连接蛋白和糖脂代谢关键基因表达等产生的影响。

作为本发明的pCRTC3-sgRNA表达载体的用途的改进，包括以下步骤：

(1)、将pCRTC3-sgRNA表达载体的重组质粒(即，含pCRTC3-sgRNA表达载体的大肠杆菌DH5α)扩培后，提取高纯转染级质粒；

(2)、将含pCRTC3-sgRNA表达载体的高纯转染级质粒转染猪肠道上皮细胞等细胞，37℃，5％的CO₂中保温4～6h后更换不含抗生素的培养基；

(3)、转染48小时后，分析pCRTC3-sgRNA质粒对pCRTC3及紧密连接蛋白和糖脂代谢关键功能基因ZO-1、ATGL等表达的影响，研究pCRTC3的功能。

本发明的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法及其用途，具有以下有益效果：

本发明根据pX330-Cas9质粒信息和靶序列设计并合成了pCRTC3的4对sgRNA引物，sgRNA引物经退火后与BbsI酶切的pX330-Cas9载体连接得到pCRTC3-sgRNA表达重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒并转染猪IPEC-J2细胞，用于研究pCRTC3对糖脂代谢及关键基因表达的影响。本发明是利用CRISPR/Cas9技术，构建了pCRTC3的pCRTC3-sgRNA表达载体，开拓了目前研究猪糖脂代谢调控和基因功能研究的新思路。此法所构建的pCRTC3-sgRNA质粒，能够特异、高效地敲除pCRTC3基因的表达，是研究pCRTC3功能的一种强有力的研究技术，为开展pCRTC3在猪肠道上皮细胞及糖脂代谢和组织发育中的功能研究具有重要的意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是BbsI酶切的pX330-Cas9载体后的电泳检测图；

图1中：1---BbsI酶切后质粒，0---没酶切的质粒对照，M---DNA marker；

图2是菌液PCR产物检电泳捡测图；

图2中：M---DNA marker；11～42---pCRTC3-sgRNA1～4阳性克隆PCR产物电泳结果；

图3是pCRTC3-sgRNA1测序及BLAST结果；

图4是pCRTC3-sgRNA 2测序及BLAST结果；

图5是pCRTC3-sgRNA3测序及BLAST结果；

图6是pCRTC3-sgRNA4测序及BLAST结果；

图7是pCRTC3-sg1-4对猪IPEC-J2细胞中pCRTC3蛋白表达的影响图；

Lipo---脂质体组，Cas---脂质体+空质粒组，sg1-4---脂质体+pCRTC3-sg1-4；

图8是pCRTC3-sg1、pCRTC3-sg4对猪IPEC-J2细胞中pCRTC3mRNA表达的影响图(*P<0.05,**P<0.01)；

图9是pCRTC3-sg1、pCRTC3-sg4对猪IPEC-J2细胞中ZO-1mRNA表达的影响图(*P<0.05,**P<0.01)；

图10是pCRTC3-sg1、pCRTC3-sg4对猪IPEC-J2细胞中ZO-2mRNA表达的影响图(*P<0.05,**P<0.01)；

图11是pCRTC3-sg1、pCRTC3-sg4对猪IPEC-J2细胞中Occludin-1mRNA表达的影响图(**P<0.01)；

图12是pCRTC3-sg1、pCRTC3-sg4对猪IPEC-J2细胞中Claudin-1mRNA表达的影响图(*P<0.05)；

图13是pCRTC3-sg1、pCRTC3-sg4对猪IPEC-J2细胞中Glut2mRNA表达的影响图；

图14是pCRTC3-sg1、pCRTC3-sg4对猪IPEC-J2细胞中ATGL mRNA表达的影响图(*P<0.05)；

图15是pCRTC3-sg1、pCRTC3-sg4对猪IPEC-J2细胞中HSL mRNA表达的影响图(*P<0.05)；

图16是pCRTC3-sg1、pCRTC3-sg4对猪IPEC-J2细胞中TNFαmRNA表达的影响图(**P<0.01)；

上述图8～图16中的Cas-Vector代表空质粒对照组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

(一)、pCRTC3的Cas9-sgRNA表达载体的构建与鉴定

1、靶序列选择：根据pCRTC3全长基因序列，筛选设计pCRTC3的sgRNA靶序列：

sgRNA1：5'-GAGAATGATGTCCACGGGGA-3'(SEQ ID NO：1)

sgRNA2：5'-GGCCAGGAGAAAGTGTGAGG-3'(SEQ ID NO：2)

sgRNA3：5'-GCTGAGGTCTTTGAACAGGC-3'(SEQ ID NO：3)

sgRNA4：5'-GTCCTTCCCCAGCCCGTTGA-3'(SEQ ID NO：4)。

根据pX330-Cas9载体的信息和靶序列设计并合成sgRNA引物，4对shRNA引物分别为：

引物Ⅰ：

pCRTC3-sg1S:5′-CACCGGAGAATGATGTCCACGGGGA-3′

pCRTC3-sg1AS:5′-AAACTCCCCGTGGACATCATTCTCC-3′，

引物Ⅱ：

pCRTC3-sg2S:5′-CACCGGGCCAGGAGAAAGTGTGAGG-3′

pCRTC3-sg2AS:5′-AAACCCTCACACTTTCTCCTGGCCC-3′，

引物Ⅲ：

pCRTC3-sg3S:5′-CACCGGCTGAGGTCTTTGAACAGGC-3′

pCRTC3-sg3AS:5′-AAACGCCTGTTCAAAGACCTCAGCC-3′。

引物Ⅳ：

pCRTC3-sg4S:5′-CACCGGTCCTTCCCCAGCCCGTTGA-3′

pCRTC3-sg4AS:5′-AAACTCAACGGGCTGGGGAAGGACC-3′。

2、引物退火：将合成好的引物稀释后，按下列反应体系分别进行退火：

退火条件为：95℃5min后，0.1℃/S冷却至室温，然后1:100稀释退火产物。

3、将含有pX330-Cas9质粒的大肠杆菌接种到LB培养基中，培养过夜，然后利用小批量质粒提取试剂盒提取质粒，测质粒浓度后将质粒进行BbsI酶切，酶切的反应体系为：

反应条件为：37℃水浴2h，然后琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，并割胶回收线性化的载体。质粒提取及酶切结果如图1所示，表明酶切成功。

将步骤2所得的每一种退火产物分别进行以下步骤4和步骤5：

4、插入片段(步骤2所得的退火产物)和载体片段(步骤3酶切后的载体)用T₄DNA连接酶连接16℃连接1h，连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃培养过夜。从而得到相应的4种sgRNA表达载体的重组质粒。连接的反应体系为：

5、经氨苄青霉素(Ampicillin)抗性初步筛选后，挑取白色单菌落接种于3ml液体LB培养基中(含Amp 100ng/ml)，37℃振荡培养12h，得菌液；以载体引物5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3′和相对应的特异性上游引物(上述步骤1所述)进行PCR鉴定。PCR反应体系如下表1所示：

表1、PCR反应体系

10×PCR扩增缓冲液	2.5μl
		dNTP(10mM)	1.0μl
特异性引物(10μM)	0.5μl
		载体引物(10μM)	0.5μl
菌液	2.0μl
		Taq酶(2U/μl)	0.5μl
ddH₂O	18μl
		Total	25μl

PCR反应条件为：

(1)94℃预变性4min；(2)94℃变性30sec，55℃30sec，72℃30sec，共35个循环；(3)72℃10min，4℃保存。

阳性克隆菌液PCR鉴定结果表明，用鉴定载体引物(序列同上)和特异性pCRTC3引物(上述步骤1所述)PCR扩增的片段大小为100bp左右，与本实验预期结果相符，确定为阳性克隆(图2)。

并将PCR鉴定为阳性克隆菌进一步进行测序鉴定插入片段的正确性，测序引物为5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′。阳性克隆测序及序列比对鉴定结果表明，与插入的序列完全一致(图3-图6)，证明pCRTC3-sgRNA表达质粒构建成功。这为进一步研究pCRTC3基因的功能及调控糖脂代谢的作用途径打下基础，也为通过CRISPR/Cas9技术研究猪肠道功能及肌肉发育和脂肪沉积奠定基础。

(二)、有效pCRTC3-sgRNA筛选

1、利用Lipofectamine^TM 2000介导将第(一)步构建筛选得到的pCRTC3-sgRNA1-4的重组质粒和空载体对照分别转染猪IPEC-J2细胞。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为70％～90％，培养基中含10％胎牛血清，不含抗生素；对于每孔细胞，使用50μl无血清DMEM培养基稀释3μg DNA；对于每孔细胞，使用50μl DMEM培养基稀释10μl Lipofectamine^TM 2000试剂。Lipofectamine^TM 2000稀释后，在5min内同稀释的DNA混合(保温时间过长会降低活性)；混合稀释的DNA和稀释的Lipofectamine^TM 2000，在室温保温20-30min(复合物可以在室温保持6h稳定)；直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混。如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板，在加入复合物前移去生长培养基，替换无血清培养基；在37℃，5％的CO2中保温4～6h后更换不含抗生素的完全培养基；

2、在细胞中加入质粒DNA和Lipofectamine^TM 2000复合物48h后，收集细胞，用于分析检测各表达载体效果。

3、敲除效果检测：处理48小时后，用RIPA buffer提取细胞中总蛋白，采用Westernblot方法检测pCRTC3蛋白表达水平，见图7。结果表明，与脂质体组(Lipo)和空质粒对照组(Cas-vector组，Lipo+Cas-vector)相比，pCRTC3-sgRNA1(sg1)和pCRTC3-sgRNA4(sg4)效果较好，显著降低pCRTC3蛋白表达。

(三)、pCRTC3-sgRNA对IPEC-J2细胞中紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2等表达的影响

选取第(二)步筛选得到效果最好的pCRTC3-sgRNA1(sg1)和pCRTC3-sgRNA4(sg4)，检测pCRTC3对紧密连接相关基因ZO-1、ZO-2、Occludin-1、Claudin-1等mRNA表达的影响。将猪IPEC-J2细胞传代培养24h后，使其在转染日密度达70-95％进行处理。转染条件按3ug质粒/10ul脂质体的比例的进行转染，实验分成三个组：Cas-Vector对照组，转染空载体，sg1组，转染有效重组质粒pCRTC3-sgRNA1；sg4组，转染重组质粒pCRTC3-sgRNA4，每个处理4个重复。转染48h后收集IPEC-J2细胞，Real-time定量PCR检测紧密连接相关基因ZO-1等mRNA表达水平。

结果如图8所示：转染sg1和sg4 48h后，猪IPEC-J2细胞中CRTC3基因表达显著低于Cas-Vector对照组。与Cas-Vector对照组相比，sg1组CRTC3基因的mRNA水平显著降低了52.01％(P<0.01)，sg4组降低了47.89％(P<0.05)(图8)。同时，研究结果还表明，转染sg1和sg4 48h后，显著降低了猪紧密连接相关蛋白ZO-1等基因表达。与Cas-Vector对照组相比，sg1组ZO-1、ZO-2、Occludin-1、Claudin-1基因的mRNA水平分别降低了57.88％(P<0.01，图9)、40.19％(P<0.01，图10)、51.59％(P<0.01，图11)、35.70％(P<0.05，图12)；sg4组ZO-1、ZO-2、Occludin-1、Claudin-1基因的mRNA水平分别降低了53.38％(P<0.05，图9)、50.52％(P<0.05，图10)、39.97％(P＝0.09，图11)、44.06％(P<0.05，图12)。

(四)、pCRTC3-sgRNA对猪IPEC-J2细胞中糖脂代谢相关基因表达的影响

将猪IPEC-J2细胞传代培养24h后，使其在转染日密度达70-95％进行处理。转染条件按3ug质粒/10ul脂质体的比例的进行转染，实验分成三个组：Cas-Vector对照组，转染空载体，sg1组，转染有效重组质粒pCRTC3-sgRNA1；sg4组，转染重组质粒pCRTC3-sgRNA4r，每个处理4个重复。转染48h后收集IPEC-J2细胞，Real-time定量PCR检测脂质代谢相关基因Glut2、ATGL、HSL等mRNA表达水平。

结果表明，sg1组和sg4组Glut2基因表达与Cas-Vector对照组相比差异不显著(图13)。与Cas-Vector对照组相比，sg1组ATGL和HSL基因mRNA水平分别降低了38.31％(P<0.05，图14)和41.39％(P<0.05，图15)；sg4组ATGL和HSL基因mRNA水平与Cas-Vector对照组相比差异不显著(图14，图15)。同时研究发现，sg1组TNFαmRNA水平显著低于对照组(P<0.01，图16)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江大学

<120> 猪pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法及用途

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列sgRNA1

<400> 1

gagaatgatg tccacgggga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列sgRNA2

<400> 2

ggccaggaga aagtgtgagg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列sgRNA3

<400> 3

gctgaggtct ttgaacaggc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列sgRNA4

<400> 4

gtccttcccc agcccgttga 20

Claims

1.猪CRTC3的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤：

1)、根据载体的内切酶位点信息和pCRTC3序列得到4个靶序列，根据所述靶序列设计并合成4对sgRNA引物；

2)、pCRTC3-sgRNA表达载体的构建：BbsI酶切的pX330-Cas9载体与pCRTC3的sgRNA引物退火后产物连接转化，得到pCRTC3-sgRNA表达载体的重组质粒。

2.根据权利要求1所述的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法，其特征是：所述步骤1)中的4对sgRNA引物为：

引物Ⅰ：

pCRTC3-sg1S:5′-CACCGGAGAATGATGTCCACGGGGA-3′

pCRTC3-sg1AS:5′-AAACTCCCCGTGGACATCATTCTCC-3′，

引物Ⅱ：

pCRTC3-sg2S:5′-CACCGGGCCAGGAGAAAGTGTGAGG-3′

pCRTC3-sg2AS:5′-AAACCCTCACACTTTCTCCTGGCCC-3′，

引物Ⅲ：

pCRTC3-sg3S:5′-CACCGGCTGAGGTCTTTGAACAGGC-3′

pCRTC3-sg3AS:5′-AAACGCCTGTTCAAAGACCTCAGCC-3′，

引物Ⅳ：

pCRTC3-sg4S:5′-CACCGGTCCTTCCCCAGCCCGTTGA-3′

pCRTC3-sg4AS:5′-AAACTCAACGGGCTGGGGAAGGACC-3′。

3.根据权利要求2所述的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法，其特征是：所述步骤2)为：将pX330-Cas9质粒进行BbsI酶切后，与sgRNA引物退火后得到的pCRTC3的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌；得到pCRTC3的pCRTC3-sgRNA表达载体的重组质粒。

4.根据权利要求1～3任一所述的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法，其特征是：将步骤2)所得的pCRTC3的pCRTC3-sgRNA表达载体进行鉴定：

通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为特异性上游引物和Cas9载体的本身引物：5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3′；测序引物为：5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′。

5.如权利要求1～4任一方法构建所得的pCRTC3-sgRNA表达载体的用途，其特征是：用于敲除猪细胞中pCRTC3基因的表达。

6.根据权利要求5所述的pCRTC3-sgRNA表达载体的用途，其特征是：

用于研究pCRTC3基因对猪肠道上皮细胞IPEC-J2细胞紧密连接蛋白和糖脂代谢关键基因表达产生的影响。

7.根据权利要求6所述的pCRTC3-sgRNA表达载体的用途，其特征是包括以下步骤：

(1)、将pCRTC3-sgRNA表达载体的重组质粒扩培后，提取高纯转染级质粒；

(2)、将含pCRTC3-sgRNA表达载体的高纯转染级质粒转染猪IPEC-J2细胞，37℃，5％的CO₂中保温4～6h后更换不含抗生素的培养基；

(3)、转染后48小时候分析pCRTC3-sgRNA表达质粒对pCRTC3表达及紧密连接蛋白和糖脂代谢密切相关基因表达的影响，研究pCRTC3的功能。