CN1072264A

CN1072264A - 超高敏酶促化学发光液配方

Info

Publication number: CN1072264A
Application number: CN 91110621
Authority: CN
Inventors: 杨晓林; 王申五
Original assignee: PEOPLE S HOSPITAL BEIJING MEDI
Current assignee: PEOPLE S HOSPITAL BEIJING MEDI
Priority date: 1991-11-14
Filing date: 1991-11-14
Publication date: 1993-05-19
Anticipated expiration: 2006-11-14
Also published as: CN1031156C

Abstract

超高敏酶促化学发光液配方，是一种适合于在各类以过氧化物酶为标记物的酶标检测技术中应用的发光体系。

该发明由：发光剂，复合氧化剂，增强剂，缓冲液及一组复合助剂构成。具有发光灵敏度高，稳定性好，成本低的特点。可广泛用于生物学研究，临床检验，法医鉴定，农牧业及环境科学中对核酸及抗原抗体等生物大分子的检测。

Description

本发明是一种依赖过氧化物酶催化的化学发光液配方。适合于在各类以过氧化物酶为标记的酶标检测技术中应用。

核酸的体外重组技术及抗原抗体特异反应技术是现代生命科学的两个重要标志。其应用范围已扩展到基础研究，临床检验，法医鉴定，乃至农牧业，环境科学等诸多领域。而在这些应用中，首先要对核酸及抗原抗体进行检测。以往大多采用放射性同位素标记技术。这一技术虽然具有灵敏度高的特点，但同时存在诸多不足：如某些放射性同位素由于半衰期短，不利于储存和运输;更由于放射性物质对工作人员的健康及环境造成了一定危胁，因而需要特殊的防护和废物处理设备及严格的管理。因此，只限于在少数实验室中使用。大大限制了它的广泛应用。因此，人们一直在寻求一种非同位素的标记技术。其中应用最广，发展最快的是酶标技术。它具有简单，快速，方便，安全的特点。但目前采用的酶标显色技术其灵敏度较低，即使采用生物素-亲合素系统加以放大，也无法与同位素标记技术相比（E.L.Sheld et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83∶9085 1986）。

八十年代中后期，出现了一类新型的利用酶促化学发光反应的酶标检测技术。它不但具有快速，安全的特点;同时可以直接利用感光胶片自显影技术，无需检测仪器及电源，方便了基层野外工作以及检测结果的复制和永久保存;而且突出的优点是具有极高的灵敏度，可以完全达到同位素技术的水平。该项技术的关键所在是化学发光液的配方。目前主要有两大类发光液体系：

一类是依赖碱性磷酸酶催化的发光体系，它使用了国外最新专利物质AMPPD（I.Brostein & P.McGrath Nature 338（13）∶599 1989），用于检测乙型肝炎基因片段时，最低检测限可达4.39×10⁴考贝（I.Bronstein et al Analytical Biochemistry 180∶95 1989），说明已达到同位素标记技术的水平。但由于该体系中的关键物质AMPPD价格昂贵，每毫克数十美元，且国内尚无生产;而碱性磷酸酶的稳定性也较差。因此大规模推广尚存在困难。

另一体系是依赖过氧化物酶的发光体系。该体系以鲁米诺（Luminol）及其衍生物为发光剂;H₂O₂等构成氧化剂;另外，由6-羟基苯并噻唑及其衍生物（Kricka L.J.et al Eur Patent Pub 118454 1983）或含对位取代基的酚类（Carter T.J.N.et al Eur Patent Pub 87959 1982）作为发光增强剂;以及缓冲体系组成。它成本较低，鲁米诺每克仅几美元，且国内已能生产;同时由于通常使用的辣根过氧化物酶稳定性较好，因此具有较大的推广价值。但遗憾的是其灵敏度仍不够理想，即使采用昂贵的高感光度一次成像胶片（ASA 20，000）及生物素-亲合素系统加以放大，其最低检测限也仅能达到1pg的pBR322质粒DNA（J.A.Matthews et al Analytical Biochemistry 151∶205 1985），相当于5×10⁵基因考贝，无法与碱性磷酸酶发光体系及同位素标记技术相比。另外，该发光体系的发光液配制后经数月存放，其发光灵敏度会逐渐下降;同时本底发光（没有酶存在时的自行发光）逐渐上升。这些都对该技术的推广应用及商品化造成了障碍。

因此本发明的目的，就是试图通过改进依赖过氧化物酶的化学发光液的配方使其灵敏度进一步提高;同时消除随放置时间延长而出现的本底发光上升的现象。

经过长期，反复多次试验，我们发现：如果在现有发光液配方（J.A.Matthews et al Analytical Biochemistry 151∶205 1985）即：

1.25mM鲁米诺

2.7mM H₂O₂

0.136mM对-碘苯酚

100mM Tris-HCl缓冲液，pH8.6

的基础上，再加入一组复合助剂;其构成和在配方中的终浓度是：

乙醇 0.1%～5%

环己二胺四乙酸（CDTA） 1mM～10mM

NaCl 0.1M～0.5M

同时将其中的氧化剂由单纯的H₂O₂改为以H₂O₂及NaBO₃的等克分子比混合物作为复合氧化剂，终浓度为：3mM～6mM，则该体系的发光灵敏度大大提高;并消除了长期放置条件下本底发光上升的现象，产生了预料不到的技术效果，该配方称为“超高敏酶促化学发光液配方”。

附图（1）是改进前后的两种发光液配方在不同浓度的辣根过氧化物酶（HRP）作用下，以化学发光仪测得其光电流变化的曲线。图中以辣根过氧化物酶（HRP）的克分子浓度（×10^-12）为横坐标，以光电流对数值（logmV）为纵坐标。其中实线A代表超高敏酶促化学发光液配方，虚线B代表改进前的配方。可看出，超高敏酶促化学发光液配方的光电流强度在各个酶浓度下均高于改进前，最高可超出15倍以上。

附图（2）是改进前后的两种发光液配方经放置数月后再测定其不同酶浓度条件下光电流变化的曲线。从中发现，改进前的发光液B由于本底发光明显升高，实际上已无法使用;而超高敏酶促化学发光液配方A的本底发光依然极低，且保持了较高的灵敏度。

为进一步验证上述结果，我们使用普通X光胶片进行了改进前后两种配方的发光液对固相支持物上的辣根过氧化物酶自显影效果的比较实验，步骤如下：

1：硝酸纤维滤膜在0.15M NaCl;50mM Tris-HCl PH8.6的缓冲液中浸泡10分钟以上。

2：取出上述滤膜，用吸水纸吸干水分。将不同浓度的辣根过氧化物酶（以生理盐水配制）分别等体积点到滤膜上，待其自然晾干。

3：将滤膜置于透明塑料袋中，按每cm²滤膜0.125ml的比例加入发光液。赶走气泡，立即封口。

4：在暗室条件下将上述塑料袋置于X光胶片盒中，并覆盖一张未感光的X光胶片，压紧盒盖。

5：暴光30分钟左右，取出胶片显定影。

实验结果如下：

(×10^-18克分子) (mm) (mm)

2,500 5.0 12.0

750 3.5 11.0

250 3.0 6.0

75 2.0 4.0

25 0.0 3.0

7.5 0.0 2.0

2.5 0.0 0.0

改进配方前的发光液仅能检测出75×10^-18克分子的辣根过氧化物酶，而超高敏酶促化学发光液配方可检测出7.5×10^-18克分子的辣根过氧化物酶。因此该实验证明在X光胶片自显影中，超高敏酶促化学发光液配方的发光灵敏度比改进前提高了一个数量级即10倍。

而后我们进一步使用本室自行研制的辣根过氧化物酶标记物（HRP-PEI）以直接酶标-化学发光法进行斑点杂交实验，以检测SP64质粒DNA。步骤如下：

1：用加样器分别将不同浓度的SP64质粒DNA溶液点于尼龙膜上，用热风机小心吹干。

2：在一平皿内置一迭滤纸，加入0.4N NaOH使滤纸浸透。将上述尼龙膜含DNA面朝上贴到滤纸上，持续1～5分钟。

3：以5×SSC溶液洗尼龙膜2次，每次5分钟。

4：将尼龙膜置于塑料袋中，按每cm²膜0.25ml的比例加入杂交液，42℃预杂交2小时以上。

注：杂交液配方：

6M尿素

0.5MNaCl

0.1%SDS

5×Denhart

4mM EDTA

6%PEG6，000

5%封膜剂

100mg/l鲑鱼精子DNA

50mM Tris-HCl pH8.0缓冲液

5：按每ml杂交液20ng的比例取SP64质粒DNA，以5mM磷酸缓冲液（pH6.8）稀释为10mg/l;100℃煮沸5～10分钟，立即置0℃5分钟。

6：在上述SP64质粒DNA溶液中，每mgDNA加入50mg酶标物（HRP-PEI），另加相当于SP64质粒DNA溶液1/3体积的5%戊二醛;37℃10～30分钟。

7：将步骤6获得的液体加入步骤4中的塑料袋;赶走气泡，42℃杂交过夜。

8：取出尼龙膜置于洗液中，42℃洗二次，每次30分钟。

注：洗液配方：

6M尿素

0.4%SDS

0.5×SSC

9：以2×SSC溶液洗二次，每次5分钟。

10：用超高敏酶促化学发光液配方和X光胶片进行发光自显影。

实验结果如下：

SP64质粒DNA（pg）显影斑点直径（mm）

1，000 9.5

300 8.0

100 6.0

30 3.2

10 3.0

3 2.8

1 2.5

0.3 2.0

0.1 2.0

0.0 0.0

该实验检测出了0.1pg的SP64质粒DNA，相当于6×10⁴基因考贝，因此该实验结果证明：超高敏酶促化学发光液配方在检测核酸分子杂交时的灵敏度高于现有文献报道的水平（J.A.Matthews et al Analytical Biochemistry 151∶205 1985）;而与碱性磷酸酶发光体系的灵敏度接近（I.Bronstein et al Analytical Biochemistry 180∶95 1989）。

综合上述实验，可以认为：改进后的超高敏酶促化学发光液配方，其发光灵敏度比原有技术提高一个数量级，已接近碱性磷酸酶发光体系及同位素标记技术的水平;同时还消除了长期放置条件下本底发光升高的现象，提高了稳定性;结合该技术具有使用简单，安全的特点;因此将在生物学研究，临床检验，法医鉴定，农牧业及环境科学等诸多领域内对核酸及抗原抗体等生物大分子的检测方面产生广泛的应用效益。

下面实施例仅用于说明本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。

实施例一

-酶标-化学发光自显影法-斑点杂交实验。

实验步骤如下：

1：用点膜器将待测标本的核酸提取物（包括DNA，RNA）点于硝酸纤维膜上，80℃烤2小时。

2：硝酸纤维膜移入塑料袋，每cm²膜加入0.25ml杂交液;42℃2小时。

注：杂交液配方：

6M尿素

0.1%SDS

0.5M NaCl

5×Denhart

100mg/l鲑鱼精子DNA

50mM Tris-HCl缓冲液 pH8.0

3：每ml杂交液中加入10ng酶标探针，42℃杂交过夜。

4：取出硝酸纤维膜，42℃洗膜二次，每次20分钟。

注：洗膜液配方：

6M尿素

0.4%SDS

0.5×SSC

5：2×SSC溶液洗二次，每次5分钟。

6：化学发光自显影。

该方法可用于检测特定基因片段。适合于基因表达的研究;遗传性疾病及某些感染性疾病的诊断;尤其是某些严重遗传性疾病的产前诊断和那些难以找到血清抗原的严重传染性疾病如：爱滋病，丙型肝炎等的诊断。其灵敏度至少比常规显色反应高10倍，与同位素标记技术相当。

实施例二

-酶标-化学发光自显影法-索氏吸印（Southern-Blot）杂交实验

实验步骤如下：

1：将标本DNA以限制性内切酶（如TaqⅠ，BglⅡ）消化，行琼脂糖电泳。

2：经索氏吸印将电泳带吸附到硝酸纤维膜上。

3：80℃烤膜2小时。

4：将膜移入塑料袋，每cm²膜加入0.25ml杂交液，42°2小时。

注：杂交液配方：

6M尿素

0.1%SDS

0.5M NaCl

5×Denhart

100mg/1鲑鱼精子DNA

50mM Tris-HCl 缓冲液 pH8.0

5：每ml杂交液加入10ng酶标探针，42℃过夜。

6：取出硝酸纤维膜，42℃洗二次，每次20分钟。

注：洗膜液配方：

6M尿素

0.4%SDS

0.5×SSC

7：2×SSC溶液洗膜二次，每次5分钟。

8：化学发光自显影。

该方法用于检测基因片段长度多态性。适用于基因突变的研究;遗传性疾病家族的基因连锁分析;以及法医鉴定中的DNA指纹图技术（该技术可在亲子鉴定，及谋杀案，强奸案的侦破中发挥以往任何技术手段都无法起到的作用。是现代法医学的重要标志）。由于上述方法取代了放射性同位素，因此便于普及推广。

实施例三

-酶联免疫吸附（ELISA）-“一步法”-化学发光自显影实验

实验步骤如下：

1：取纯化抗体溶液（20mg/l）加入酶标板，每孔0.15ml，4℃过夜。

2：洗板3～4次。

注：洗液配方：

0.15M NaCl

0.5‰吐温-20

3：每孔加入0.1ml标本血清及0.05ml酶标抗体（1∶100稀释），43℃1小时。

4：洗板3～4次（洗液配方同步骤2）。

5：化学发光自显影。

该方法可检测血清中的某种特异抗原。适用于大多数感染性疾病的临床诊断。由于采用了化学发光自显影技术，使其灵敏度大大提高。实际测定乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的实验证实其灵敏度比目前临床所用方法至少高10倍。而且操作简单，快速;无需测定仪器及电源。

Claims

1、一种超高敏酶促化学发光液配方。由发光剂；氧化剂；增强剂；缓冲液及助剂组成。本发明的特征是：在现有技术基础上，它使用了复合氧化剂和复合助剂。

2、根据权利要求1，复合氧化剂由H₂O₂及NaBO₃的等克分子比混合物组成，配方中的终浓度是：3mM～6mM。

3、根据权利要求1，复合助剂的构成和配方中的终浓度是：

乙醇 0.1%～5%

环己二胺四乙酸（CDTA） 1mM～10mM

NaCl 0.1M～0.5M