CN107213457B - 一种短直链淀粉-胰岛素或短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的制备方法 - Google Patents

一种短直链淀粉-胰岛素或短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种短直链淀粉‑胰岛素或短直链淀粉‑胰岛素‑原花青素纳米复合物的制备方法，所述方法将短直链淀粉、胰岛素两者或短直链淀粉、胰岛素、原花青素三者混合后回生制得短直链淀粉‑胰岛素或短直链淀粉‑胰岛素‑原花青素纳米复合物。本发明短直链淀粉‑胰岛素或短直链淀粉‑胰岛素‑原花青素纳米复合物粒径较小，可以紧密的粘附在小肠的膜粘附层，延长在胃肠带停留时间，同时可以克服消化道系统中存在的粘液层屏障、酶屏障及上皮屏障，提高口服胰岛素的生物利用率。

Description

一种短直链淀粉-胰岛素或短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳 米复合物的制备方法
技术领域
本发明涉及纳米复合材料技术领域，尤其是涉及一种通过将短链淀粉与胰岛素或者短链淀粉与胰岛素、原花青素混合制备纳米复合物的方法。
背景技术
胰岛素制剂皮下注射是目前用于糖尿病治疗的主要手段，具有更快的降血糖效果和更高的药物利用度，但由于药物释放较快，需要频繁注射给药，增加了病人的身体和心理负担。注射给药这种方式与正常生理状态下体内的胰岛素的分泌也存在着较大的差异；胰岛素经注射给药后直接进入人体循环；在正常生理条件下，胰岛分泌的胰岛素先进入肝门静脉系统，大部分为肝脏摄取，胰岛素以口服途径给药最接近正常生理状态下的分泌模式，因此，无论从服用的方便程度上，还是从代谢的模式上看，口服都是胰岛素最为理想的给药方式。纳米技术的快速发展为胰岛素口服给药开辟了新的途径。以纳米颗粒作为药物载体，可有效地保护胰岛素免受胃酸及胃肠道酶的降解，增加其黏膜吸收；还可以有效地穿过小肠Peyer's结，经淋巴循环进入血液循环，同时还具有控制释放和体内靶向分布等特点。在众多用于制备纳米粒的天然大分子中，淀粉是一类重要的具有生物可降解性、可再生、良好生物相容性的天然多糖类高分子材料，来源丰富，价格低廉，广泛地应用于各种药物的纳米粒制剂中，是一种理想的载体材料。
天然产物多酚因具有良好的生物兼容性和诸多生理学功能，如抗氧化、抗粉样纤维、抗癌和抑菌等活性，一直是生命领域研究的重要对象之一。原花青素在抗氧化、清除体内自由基、免疫调节、治疗炎症以及预防心脑血管、癌症和神经退行性等重大疾病方面均发挥了重要作用，因此被广泛应用于食品工业、生物医药、卫生保健、日用化工等领域。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种短直链淀粉-胰岛素或短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的制备方法。本发明短直链淀粉-胰岛素或短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物粒径较小，可以紧密的粘附在小肠的膜粘附层，延长在胃肠带停留时间，同时可以克服消化道系统中存在的粘液层屏障、酶屏障及上皮屏障，提高口服胰岛素的生物利用率。
本发明的技术方案如下：
一种短直链淀粉-胰岛素纳米复合物，所述纳米复合物通过如下步骤制得：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为10-25％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100-500U/mL的普鲁兰酶，酶解6-12h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取短直链淀粉加入到去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温待用，制得质量浓度为1-10％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取胰岛素粉末用pH＝2的盐酸溶液溶解，配制成质量浓度为1‰-1％的胰岛素溶液；
(4)制备短直链淀粉-胰岛素纳米复合物：将步骤(3)制得的胰岛素溶液逐滴加入到步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理12～48h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素纳米复合物。
步骤(4)中所述胰岛素溶液与短直链淀粉溶液的体积比为1:8。
步骤(4)中所述冻干的条件为真空度为1Pa，冷阱温度为-82℃，干燥至样品最终含水量为5-7％。
一种短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的制备方法，所述方法将短链淀粉、胰岛素与原花青素复合，具体制备过程为：将质量浓度为1‰-1％的胰岛素溶液和质量浓度为1‰-1％的原花青素溶液同时分别逐滴加入到质量浓度为1％-10％的胰岛素溶液中搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理12～48h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物。
所述原花青素溶液的制备过程为：将原花青素加入到去离子水中，制得质量浓度为1‰-1％的原花青素溶液。
本发明有益的技术效果在于：
本发明采用生物酶法制备短直链淀粉，短直链淀粉含有大量的-OH，胰岛素含有NH2，原花青素可以作为交联剂跟稳定剂，抑制胰岛素本身的聚集，利用短直链自组装并结合二者之间或者三者之间的相互作用，制得所述纳米复合物。制备得到的纳米复合物粒径较小，可以紧密的粘附在小肠的膜粘附层，延长在胃肠带停留时间，同时可以克服消化道系统中存在的粘液层屏障、酶屏障及上皮屏障，提高口服胰岛素的生物利用率。制备得到的纳米复合物，具有包埋率高，成本低，降血糖作用明显等特性，有效提高了口服胰岛素的生物利用度，而且口服纳米复合物在胃肠道环境中具有明显的缓释功效。
附图说明
图1为实施例1、2所得纳米复合物的透射电镜和粒径图；
图2本发明实施例所用短直链淀粉与胰岛素两者或短直链淀粉、原花青素和胰岛素三者相互作用的荧光图谱；
图3本发明实施例所用短直链淀粉与胰岛素两者或短直链淀粉、原花青素和胰岛素三者相互作用的同步荧光图谱；
图4短直链淀粉与胰岛素两者或短直链淀粉、原花青素和胰岛素三者相互作用的共振光散射图谱；
图5为实施例1、3、5、7所得短直链淀粉-胰岛素纳米复合物的X衍射图和实施例2、4、6、8所得短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的X衍射图；
图6为实施例1、3、5、7所得纳米复合物中短直链淀粉对胰岛素的包埋率；和实施例2、4、6、8所得纳米复合物中短直链淀粉和原花青素对胰岛素的包埋率；
图7为实施例1、2所得纳米复合物体内降血糖效果曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
一种短直链淀粉-胰岛素纳米复合物，所述纳米复合物通过如下步骤制得：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取0.1g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为1％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.01g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成1‰的胰岛素溶液；
(4)制备短直链淀粉-胰岛素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理48h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素纳米复合物。本发明实施例所得纳米复合物的透射电镜图和粒径图分别如图1A、C所示；所得纳米复合物体内降血糖效果曲线如图7所示；所得纳米复合物动物体内生物利用率如表1所示。
实施例2
一种短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取0.1g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为1％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.01g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成1‰的胰岛素溶液；
(4)制备原花青素溶液：称取0.01g的原花青素粉末用10mL的去离子水溶解，配制成1‰的原花青素溶液；
(5)制备短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液、5mL步骤(4)制得的原花青素溶液同时逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理48h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物。本发明实施例所得纳米复合物的透射电镜图和粒径图分别如图1B、D所示；所得纳米复合物体内降血糖效果曲线如图7所示；所得纳米复合物动物体内生物利用率如表1所示。
实施例3
一种短直链淀粉-胰岛素纳米复合物，所述纳米复合物通过如下步骤制得：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取0.1g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为1％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.01g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成1‰的胰岛素溶液；
(4)制备短直链淀粉-胰岛素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理36h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素纳米复合物。本发明实施例所得纳米复合物的X衍射图如图5A所示。
实施例4
一种短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取0.1g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为1％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.01g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成1‰的胰岛素溶液；
(4)制备原花青素溶液：称取0.01g的原花青素粉末用10mL的去离子水溶解，配制成1‰的原花青素溶液；
(5)制备短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液、5mL步骤(4)制得的原花青素溶液同时逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理36h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物。本发明实施例所得纳米复合物的X衍射图如图5B所示。
实施例5
一种短直链淀粉-胰岛素纳米复合物，所述纳米复合物通过如下步骤制得：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取0.1g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为1％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.01g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成1‰的胰岛素溶液；
(4)制备短直链淀粉-胰岛素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理24h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素纳米复合物。本发明实施例所得纳米复合物的X-衍射图如图5A所示。
实施例6
一种短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取0.1g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为1％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.01g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成1‰的胰岛素溶液；
(4)制备原花青素溶液：称取0.01g的原花青素粉末用10mL的去离子水溶解，配制成1‰的原花青素溶液；
(5)制备短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液、5mL步骤(4)制得的原花青素溶液同时逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理24h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物。本发明实施例所得纳米复合物的X衍射图如图5B所示。
实施例7
一种短直链淀粉-胰岛素纳米复合物，所述纳米复合物通过如下步骤制得：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取0.1g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为1％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.01g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成1‰的胰岛素溶液；
(4)制备短直链淀粉-胰岛素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理12h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素纳米复合物。本发明实施例所得纳米复合物的X衍射图如图5A所示。
实施例8
一种短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取0.1g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为1％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.01g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成1‰的胰岛素溶液；
(4)制备原花青素溶液：称取0.01g的原花青素粉末用10mL的去离子水溶解，配制成1‰的原花青素溶液；
(5)制备短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液、5mL步骤(4)制得的原花青素溶液同时逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理12h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物。发明实施例所得纳米复合物的X衍射图如图5B所示。
实施例9
一种短直链淀粉-胰岛素纳米复合物，所述纳米复合物通过如下步骤制得：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取0.5g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为5％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.1g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成1％的胰岛素溶液；
(4)制备短直链淀粉-胰岛素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理12h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素纳米复合物。
实施例10
一种短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取0.5g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为5％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.1g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成1％的胰岛素溶液；
(4)制备原花青素溶液：称取0.1g的原花青素粉末用10mL的去离子水溶解，配制成1％的原花青素溶液；
(5)制备短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液、5mL步骤(4)制得的原花青素溶液同时逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理12h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物。
实施例11
一种短直链淀粉-胰岛素纳米复合物，所述纳米复合物通过如下步骤制得：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取1g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为10％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.05g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成0.5％的胰岛素溶液；
(4)制备短直链淀粉-胰岛素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理48h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素纳米复合物。
实施例12
一种短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取1g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为10％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.05g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成0.5％的胰岛素溶液；
(4)制备原花青素溶液：称取0.05g的原花青素粉末用10mL的去离子水溶解，配制成0.5％的原花青素溶液；
(5)制备短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液、5mL步骤(4)制得的原花青素溶液同时逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理48h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物。
测试例：
1、TEM
将本发明实施例1、2制得的纳米复合物分散在水中，用碳膜蘸一滴纳米复合物的悬浮液，真空冷冻干燥，然后用于透射电镜观察，透射电镜图分别如图1A、图1B所示；粒径图如图1C、图1D所示。
从图1A、C可以看出，用短直链淀粉包埋胰岛素形成的短直链-胰岛素复合物的粒径基本分布在60-200nm之间，纳米复合物呈球形且分布比较均匀，不聚集；由图1B、D可以看出短直链淀粉-胰岛素-原花青素形成的纳米颗粒是球形的，且有聚集的情况，这主要是由于原花青素起到了交联剂的作用。
2、荧光图谱
使用光程路径1cm，体积3.0mL石英池，胰岛素浓度固定在1mg/mL，向其中滴加浓度为0，2，4，6，8，10的短直链淀粉，等体积混合5分钟后在25℃条件下测量胰岛素荧光光谱；固定胰岛素浓度1mg/mL，短直链淀粉浓度10mg/mL，向其中滴加浓度为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1mg/mL的原花青素，激发波长为278nm，扫描范围是300-450nm，激发和发射带宽均为5.0nm，并记录扫描数据。所得荧光图谱如图2所示。
由图2可以看出，随着体系中短直链淀粉浓度逐渐增加，短直链-胰岛素复合物峰强逐渐降低；当在短直链-胰岛素复合物中添加原花青素时，复合物峰强逐渐降低，并出现蓝移现象，表明胰岛素不仅能与短直链发生相互作用形成复合物，而且能与原花青素和短直链淀粉形成二元复合物。
3、同步荧光图谱
同步荧光光谱是分别固定激发和发射波长间距为Δλ＝30同步扫描激发和发射光谱所得。
由图3可以看出，随着体系中短直链淀粉浓度逐渐增加，峰强度逐渐降低，且峰的位置发生红移，表面酪氨酸所处的微环境发生改变，说明短直链淀粉、原花青素、胰岛素能在混合的过程中发生相互作用形成纳米复合物。
4、共振光散射图谱
共振光散射光谱是在220～800nm范围内以λex＝λem(即Δλ＝0)方式进行同步扫描所得。
由图4可以看出，随着体系中短直链淀粉浓度增加，体系共振光强度逐渐增加，说明短直链淀粉、胰岛素能在混合的过程中形成复合物，并且随着短直链淀粉浓度的增大，胰岛素与短直链之间的结合越来越多。随着体系中原花青素浓度增加，体系共振光强度峰逐渐增加，说明短直链淀粉、原花青素、胰岛素能在混合的过程中形成二元复合物。
5、X衍射光谱
将本发明实施例1-8制得的纳米复合物用X射线衍射仪检测，测试条件为：特征射线Cu-Kα，石墨单色器，管压为40.0kV，电流100mA，扫描速率为1°/min，测量角度2θ＝4–40°，步宽为0.02°，发射狭峰为1°，防发射狭峰为1°，接收狭峰为0.3mm。测试结果如图5所示。
由图5可以看出，胰岛素在2θ<20°的范围内呈现出许多结晶峰，表明胰岛素为有晶体和无定形的混合物，在复合物的衍射图谱中，胰岛素的晶体衍射峰几乎完全消失，这表明在形成复合物过程中，可能处于一种高度分散的无定形状态，胰岛素自身的晶体特征被抑制，证明了短直链淀粉-胰岛素/短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的形成。随着回生时间的增加，纳米复合物的X-衍射峰逐渐增加，说明纳米复合物的结晶度增加，这可能是由于延长了回生时间，淀粉链在回生过程中重组更加完善。
6、包埋率
将本发明实施例1-8所得的纳米复合物于12000rpm/min离心30min，收集上清液，利用考马斯亮蓝法在595nm测定溶液吸光值A595，根据标曲测得上清中胰岛素含量，测试结果如图6所示。
由图6可以看出，随着短直链的回生，短直链淀粉-胰岛素的最大包埋率是50.9％，短直链淀粉-胰岛素-原花青素的最大包埋率是70.2％。
7、体内降血糖效果
取禁食24h的雄性健康大鼠数十只，按40mg/kg剂量尾静脉注射3％(w/v)四氧嘧啶溶液，正常饲养72h后禁食，尾静脉取血0.2mL，血液凝固后，12,000rpm离心4min。取血清20μL，葡萄糖氧化酶法测定血糖值，血糖值高于16.67mmol/L的为高血糖模型大鼠。
糖尿病大鼠12只，分为三组，每组4只，实验前禁食12h，可自由饮水，称重，灌胃给药。第一组注射5IU/kg的胰岛素，第二组和第三组分别给予实施例1短直链-胰岛素复合物(100IU/kg)和实施例2短直链-胰岛素-原花青素(100IU/kg)的混悬液，于0h，0.5h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h尾静脉取血0.2mL，血液凝固后，12000rpm离心4min，精密量取血清20μL，葡萄糖氧化酶法测定血糖值。测试结果分别如图7、表1所示。
由图7和表1可看出，相对于注射胰岛素溶液，短直链淀粉-胰岛素纳米复合物的生物利用率能够达到4.59％，短直链-胰岛素-原花青素纳米复合物的生物利用率能够达到6.98％。
表1
Figure BDA0001304607430000131
注：AAC0→8h表示0至8h时间内经计算得到血糖曲线上面积。

Claims (1)

1.一种短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备短直链淀粉：配制质量百分比为15％的蜡质玉米淀粉乳，100℃水浴30min使之完全糊化，随后降温至58℃，向其中加入100U/mL的普鲁兰酶，酶解6h，离心，灭酶，冻干得短直链淀粉；
(2)制备短直链淀粉溶液：称取0.1g步骤(1)制得的短直链淀粉加入到10mL去离子水中，超声5min，然后100℃水浴30min使之完全糊化，降至室温，制得质量浓度为1％的短直链淀粉溶液；
(3)制备胰岛素溶液：称取0.01g胰岛素粉末用10mL pH＝2的盐酸溶解，配制成1‰的胰岛素溶液；
(4)制备原花青素溶液：称取0.01g的原花青素粉末用10mL的去离子水溶解，配制成1‰的原花青素溶液；
(5)制备短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物：将5mL步骤(3)制得的胰岛素溶液、5mL步骤(4)制得的原花青素溶液同时逐滴加入到40mL步骤(2)制得的短直链淀粉溶液中，搅拌1h，在室温下使其充分反应，然后将其放置4℃冰箱下回生处理48h，离心得到沉淀，将沉淀冻干即得短直链淀粉-胰岛素-原花青素纳米复合物。
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