CN107207412B - 用于由通过厌氧发酵可发酵生物质获得的前体制备氨基酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于由挥发性脂肪酸(VFA)分子制备氨基酸的方法，所述挥发性脂肪酸分子称为前体，通过厌氧发酵可发酵生物质制备，所述方法包括至少以下步骤：‑a)在不停止所述发酵的情况下通过提取手段提取所述挥发性脂肪酸(VFA)分子，所述提取手段选自至少不溶于发酵培养基的手段，‑b)一旦提取了所述挥发性脂肪酸(VFA)分子，就在发酵反应器外部收集所述分子，‑c)通过卤化一类挥发性脂肪酸(VFA)来合成给定的α‑卤代酸，所述挥发性脂肪酸选自步骤b)收集的所述挥发性脂肪酸并且根据所需类型的氨基酸定义，‑d)从所述α‑卤代酸合成定义的氨基酸。

Description

用于由通过厌氧发酵可发酵生物质获得的前体制备氨基酸的 方法

本发明涉及用于由通过厌氧发酵可发酵生物质获得的前体制备氨基酸的方法。

氨基酸是肽的组成化合物且因此是蛋白质的组成化合物。它们用作特别是动物饲料的添加剂(例如赖氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸)，用作人类食品的增味剂(诸如谷氨酸、丝氨酸或天冬氨酸)，在医疗领域或者在化妆品领域用作特殊营养品。还可涉及用于药典、化妆品和工业化学领域的氨基酸的甘氨酸、丙氨酸、正缬氨酸和正亮氨酸。

通过化学合成或通过使用酶转化来制备氨基酸是已知的。虽然此类方法易于适应并且允许制备参数的最佳控制，但其实施是复杂和昂贵的。

为了使制备成本最小化，存在例如经由微生物路线获取氨基酸的方法。氨基酸是在发酵方法期间由微生物产生的主要代谢物。虽然此类方法使产生大量可直接被身体同化的氨基酸成为可能，但是该类型的方法仍然只专注于一种类型的氨基酸。

本发明更具体地讲涉及通过提出用于制备氨基酸的方法，使其能够制备各种类型的氨基酸，特别是非蛋白质生成的氨基酸，轻松地克服了这些缺点，并且摆脱了现有技术的已知制备方法相关的限制。

为此，本发明的一个主题是用于由通过厌氧发酵可发酵生物质制备的挥发性脂肪酸(VFA)分子(称为前体)制备氨基酸的方法，其特征在于包括至少以下步骤：

-a)在不停止发酵的情况下通过提取手段提取挥发性脂肪酸(VFA)分子，该提取手段选自至少不溶于发酵培养基的手段，

-b)一旦提取了挥发性脂肪酸(VFA)分子，就在发酵反应器外部收集该分子，

-c)通过卤化一类挥发性脂肪酸(VFA)来合成给定的α-卤代酸，该挥发性脂肪酸选自步骤b)收集的挥发性脂肪酸并且根据所需类型的氨基酸定义，

-d)从该α-卤代酸合成定义的氨基酸。

因此，这样的方法使通过微生物连续制备前体的相与在发酵外部进行的合成相组合成为可能，其允许轻松控制各种参数，同时允许所制备的氨基酸类型发生较大变化。

这样的方法继续使提供前体，即挥发性脂肪酸成为可能，同时保存了生物反应器中存在的微生物的制备能力。

特别地，提取步骤a)和收集步骤b)不仅使提取和连续收集发酵反应器中生成的挥发性脂肪酸分子成为可能，而且使保存负责所述制备的微生物成为可能。特别地，提取以及实际上收集在至少对所有微生物非致死的条件下，即在生物相容性提取和收集条件下进行，因为提取保存了微生物的活性，并且收集在发酵反应器外部进行。

这样，代谢物累积在发酵反应器中相关的问题得到了解决，例如通过所制备的挥发性脂肪酸的累积酸化发酵培养基，这对微生物是有害的。在整个发酵循环中，微生物的量和活性维持在高水平，接近初始水平。

通过提供VFA的连续和正常制备，提供了各种前体的简易和快速可用来源。在作为本发明主题的方法中，该用途经由步骤c)通过化学合成，因此在易于控制和修改的条件下进行，这也为所合成的分子类型提供了较大变化。特别地，在步骤c)期间，根据选择进行卤化的VFA，获得给定类型的α-卤代酸，从而然后获得给定类型的氨基酸。

这样的方法使在厌氧发酵期间使用可发酵生物质成为可能。术语“可发酵生物质”在本文中代表有机底物，它是有利地由废弃物获得的非食品级副产物，以及由有机物质即由生物质形成、来源于人类活动，无论是驯养业、工业、农业、林业、水产业、农工业，还是来源于畜牧业等等的副产品。可涉及的有机底物的非限制性例子包括肥料、驯养垃圾的可发酵部分、屠宰场副产品、来源于农工业的纤维素或木质纤维素类残留物，诸如来源于甘蔗(渣)、向日葵或大豆的转化的那些纤维素或木质纤维素类残留物。

术语“厌氧发酵”意指在厌氧条件下通过真核或原核微生物诸如细菌、真菌、藻类或酵母进行的发酵。

根据本发明的有利但非必要方面，这样的方法可包括一个或多个以下特征：

-在步骤c)期间，所用的卤代化合物是二溴，

-在步骤c)期间，所用的卤代化合物不是二溴，

-在步骤c)期间，乙酸酐相对于挥发性脂肪酸以大约12％的摩尔百分比使用，

-在步骤c)期间，使用待卤化的挥发性脂肪酸(VFA)对应的酸酐，

-在步骤c)期间，溴化反应进行的温度为低于挥发性脂肪酸的沸点20℃至40℃，

-在步骤d)期间，合成通过与相对于反应化学计量过量的氨的反应进行，

-在步骤d)期间，合成通过与胺的反应进行，

-在步骤d)期间，温度在20℃和50℃之间，

-在步骤d)期间，合成至少一种定义为亚氨基二酸和/或次氮基三酸的副产物。

存在工业、化妆品、医药、食品或其他用途关注的许多类型的氨基酸。可涉及的例子包括不形成蛋白质的氨基酸，诸如高丙氨酸、正缬氨酸和正亮氨酸，它们是药典平台分子的合成所需的。

在本文中，术语“氨基酸”表示包含伯胺、仲胺或叔胺官能团中的至少一种的酸。

此外，通过本发明的方法，可以合成许多类型的氨基酸，诸如但非排他性地，上文描述的、以正常和控制方式、由生物来源底物、通过生物制备与化学制备的组合来合成的那些氨基酸。

在阅读本发明的多个实施方案的描述时，将更清晰地理解本发明，更清晰地呈现本发明的其他优点，该实施方案以非限制性例子的方式给出。

现在结合多个实施方案描述方法的各种步骤，应当理解本身已知的步骤未详细描述。

第一，所用的底物有利地是未处理的，即未经历任何物理化学或酶学预处理。该底物主要由可发酵生物质构成。作为另外的非限制性例子，可涉及农业或植物类废弃物(稻草、蔗渣、玉米蒸馏残留物、草、木材、牧草)、纸类废弃物(纸板、纸材)、农业食品废弃物、屠宰场废弃物、驯养垃圾的可发酵部分、畜牧业流出物(肥料、浆液、粪便)、藻类、水产养殖废弃物、林业活动废弃物或来自化妆品行业的可发酵副产品。某些底物包含有机分子，诸如有机酸，其对发酵方法的影响很小或无影响。在另一个方面，这些分子可见于发酵培养基，并且可参与例如定义的最终有机分子的制备。

作为提示和以已知方式，将底物引入发酵反应器，这本身是已知的并且设计成所需的制备的大小，无论是该制备以实验室规模进行测试，还是就制备而言以工业规模进行。换句话讲，发酵反应器或生物反应器根据需要具有几升至几百立方米范围内的体积。

微生物有利地最初以足以开始发酵的量引入发酵反应器。微生物有利地以菌群接种。术语“菌群”代表真核和原核微生物的混合物或掺和物，无论它们是细菌、酵母、真菌还是藻类。这些各种微生物基本上来源于自然生态系统，有利地但不排他性地来源于厌氧生态系统，诸如作为非限制性例子，水性介质的厌氧区，诸如某些湖、土壤、沼泽、纯化淤渣、反刍动物的瘤胃或白蚁的肠的缺氧区。应当记住，菌群中各种微生物类型和物种的定性和定量分布未准确知晓，特别是可在广泛的比例内变化。结果是，该定性和定量差异出乎意料地提供了微生物的稳健性和适应性，这使确保底物的最佳使用成为可能，与这些底物的组成和在不同的发酵条件下无关。

此外，由于底物以未修改的形式使用，即在引入生物反应器之前未消毒，或更一般地讲未释放其包含的微生物的事实，结果是底物特有的微生物实际上掺入到菌群或至少在生物反应器中与其组合。

此外，发酵在厌氧条件下，更准确地当氧化还原电势小于-300mV，有利地在-550mV和-400mV之间时，并且pH小于8，优选地在4和7之间时进行。发酵有利地限制到“前体”发酵代谢物，即包含两个至八个碳，优先地两个至六个碳的挥发性脂肪酸或VFA的制备。因此，诱导了类似于反刍动物中遇到的酸中毒现象的反应，同时具有接近零的甲烷产生率。甲烷通常是在厌氧发酵期间通过来源于自然生态系统微生物获得的最终发酵代谢物中的一种。

发酵在第一阶段导致形成挥发性脂肪酸，该挥发性脂肪酸主要包含两个至四个碳，例如乙酸、丙酸和丁酸。还获得少量长链挥发性脂肪酸，从而大于四个碳的挥发性脂肪酸，诸如戊酸、己酸、庚酸或辛酸。通过连续发酵和/或通过增加生物反应器中微生物的量，如有需要通过选择的微生物，可能促进长碳链VFA，从而大于四个碳的VFA的制备。

换句话讲，在发酵期间以一定量制备的挥发性脂肪酸基本上为两个至六个碳的挥发性脂肪酸。

在所有情况下，进行发酵以确保在液相中制备VFA。通常，发酵时间在1和7天之间，优先地在2和4天之间。在该阶段结束时发酵培养基中获得的代谢物的浓度是可变的，但对于挥发性脂肪酸，通常为约10至20g/L，具体取决于挥发性脂肪酸，应当理解在某些条件下，可大于35g/L，例如大约50g/L。在发酵步骤结束时，由于发酵培养基中存在挥发性脂肪酸，发酵培养基处于酸性pH，通常在4和6之间。

当VFA的产生达到定义量时，通常在发酵的永久状态期，促发分子提取步骤a)。优选地，但非必需地，该定义量的VFA对应于微生物生长的减缓，从而处于微生物的抑制阈值区域。

提取手段选自液体或固体提取手段，其至少不溶于发酵培养基。当提取手段为液体时，因此当它是溶剂时，优先地溶剂的密度小于发酵培养基的密度。

更准确地，提取通过固体或液体提取手段进行，其操作条件使得保持微生物的活性和/或使微生物在生物反应器中占优势的发酵条件下生长成为可能，并且该操作条件被定义为进行发酵。VFA分子优先地通过分子家族提取，然后有利地通过本身已知的技术单独分离。

当从发酵培养基提取分子诸如挥发性脂肪酸，实际上这些酸对发酵培养基的酸化程度减少。因此，发酵从而产生代谢物，在类似于初始条件的条件下继续进行，发酵培养基保持略酸性。

提取有利地连续或至少按顺序进行，例如提取每12小时进行一次。换句话讲，可能在提取所制备的代谢物的同时继续进行发酵，在制备时逐渐进行或有规律进行。

使用通过有机溶剂的液-液提取作为提取手段是优先地、但非排他性采取的提取方法。

在一个实施方案中，提取不在与发酵反应器分隔的构件中进行，而是直接在所述反应器中进行。溶剂例如通过位于反应器底部的起泡器型的装置引入。作为变化，提取构件与反应器耦接，与发酵培养基的连通布置。

在提取结束时，进行收集步骤b)。在该步骤期间，通过本身已知的技术，诸如蒸馏或蒸发从有机相收集VFA。

收集作为VFA的混合物或根据VFA的类型进行。很明显，VFA的选择或VFA的混合物通过所需的最终分子类型确定。为此，修改了收集条件，通常为蒸发或蒸馏参数。

一旦进行该收集步骤，即可进行以下步骤c)。在收集步骤之后，该步骤有利地但非排他性地进行。作为变化，在另一个时间和/或另一个地点进行，根据本身已知的技术运输和/或存储所产生的VFA。

该卤化步骤在于卤素与VFA反应，以产生α-卤代酸，该α-卤代酸是高反应性类型的分子，因此对于产生其他分子是特别有利的。此类本身已知的反应通过添加溴来进行，这是优选的，应当理解，可使用其他卤素，即氯、氟或碘或卤化分子诸如三卤化磷、卤代酸或酰基卤。

选择二溴，因为溴化α-卤代酸的反应性比对应的氯化α-卤代酸更强，碳-溴键比碳-氯键更易于断裂。此外，二溴由于其液体形式更易于处理。

为进行α-溴代酸合成，采取使用酸酐(在这种情况下乙酸酐)和吡啶的路线。很明显，例如使用多磷酸或三卤化磷的其他合成路线是本身已知的。使用多磷酸进行测试，但结果是非决定性的，特别是由于该化合物的高粘度，这使其难以处理。

氯化测试也由α-氯代酸合成(例如使用三氯异氰脲酸合成)的申请人进行。所获得的结果，就收率和易于实施而言，比使用二溴获得的那些结果差。

使用所期望的挥发性脂肪酸对应的酸酐进行卤化的合成路线是有利的，并且使获得α-卤代酸(在该情况下为给定类型的α-溴代酸)成为可能。使用乙酸酐与其他VFA和/或与两个至六个碳的VFA的混合物使获得两个至六个碳的α-卤代酸的混合物成为可能。

使用乙酸(包含两个碳的VFA)、丙酸(包含三个碳的VFA)、丁酸(包含四个碳的VFA)、己酸(包含六个碳的VFA)以及两个至六个碳的VFA的混合物的测试通过不同量的乙酸酐以及其他参数诸如温度进行。

在各种测试期间，遵循方案进行。其涉及，在初步阶段，加热回流VFA、乙酸酐和吡啶初始混合物。然后，在实际溴化期间，在几小时内、在低于混合物的沸点的温度下缓缓加入二溴，并且一旦加入二溴，即将混合物再次带入回流，然后冷却。有利地，在反应末期，加水破坏存在的酸酐。然后通过各种方法(取决于酸)提取α-溴代酸。这些方法是例如蒸馏或分离提取。

将混合物带入回流的初始温度在120℃(对于包含两个碳的VFA)和200℃(对于包含六个碳的VFA)之间。溴化温度在80℃至180℃的范围内，取决于VFA是否包含两个至六个碳。溴化反应时间，从而实际上二溴加入时间从约一小时(对于包含六个碳的VFA)至约四小时(对于包含两个碳的VFA)变化。

进行包含两个、三个、四个或六个碳的挥发性脂肪酸的溴化测试，以及挥发性脂肪酸的混合物的测试：

乙酸(C2)：0.53mol

丙酸(C3)：0.53mol

丁酸(C4)：0.53mol

己酸(C6)：0.24mol

C2至C6的VFA的混合物：0.54mol。

所加入的二溴的量为0.21mol或0.11mol，使挥发性脂肪酸过量。有利地，发明人发现有利于VFA的摩尔比2:1是最佳的。

对于每种酸，所加入的酸酐的量为0.06mol(一个测试)和0.03mol(另一个测试)。

VFA混合物包含乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)、戊酸(C5)和己酸(C6)。

在初步阶段，回流温度根据VFA而变化：120℃(对于乙酸)；120℃和140℃(对于使用丙酸的测试)；150℃和160℃(对于丁酸)；200℃(对于己酸)和180℃(对于混合物)。

使用每种酸的各种测试的溴化温度为10℃至50℃，有利地低于回流温度从而挥发性脂肪酸的沸点20℃至40℃。

在各种测试结束时获得的α-溴代酸的收率和纯度整理于下表1中，其中为简洁起见，VFA以碳水数目表示。

表1

分析和收率计算通过本身已知的分析技术，即通过NMR(核磁共振)和通过HPLC(高效液相色谱)进行。收率相对于所消耗的VFA的量定义。

申请人发现，反应速率如加入二溴之后反应混合物的脱色所示，当酸酐的量较大时，反应速率较快，而对纯度的影响很少。然而，优化两个步骤(初步步骤和溴化步骤)的温度是合适的。

为此，申请人注意到溴化温度低于挥发性脂肪酸的沸点是必须的，不应距离该温度太远。

各种测试使确定溴化温度低于挥发性脂肪酸的沸点约10℃至50℃，有利地低20℃成为可能，使在所有其他条件相同时，通过1小时至4小时的反应时间获得最佳收率，通常在60％和100％之间成为可能。

关于乙酸酐的作用，根据表中的结果，似乎对于最佳的溴化反应，酸酐相对于VFA的摩尔百分比必须为大约12％，应当理解，在5％和20％之间的百分比是可接受的。

然后，在步骤d)，使用获得的α-溴代酸，或更准确地使用给定的α-溴代酸进行给定的α-氨基酸的合成。为此，加入气体形式或溶于溶液的氨。作为变化，使用伯胺或仲胺代替氨。

测试由申请人通过使氨与包含两个至六个碳的α-溴代酸反应，即与溴乙酸、α-溴丙酸、α-溴丁酸、α-溴戊酸和α-溴己酸反应来进行。此类反应使获得具有分别两个、三个、四个、五个或六个碳的碳链的α-氨基酸，即甘氨酸、丙氨酸、高丙氨酸、正缬氨酸和正亮氨酸成为可能。

这些α-氨基酸是最广泛用作化妆品或食品产品的组成(无论在人类食品中还是动物饲料中)，或在化学和药典中用作反应中间体的那些α-氨基酸。易于理解，作为本发明主题的方法允许产生其他类型的氨基酸。

对于各种测试，方案为在室温即约20℃和50℃之间的温度下，使氨与α-溴代酸反应。反应进行不同的时间，在30分钟至72小时的范围内，取决于α-溴代酸的类型并且取决于温度。长链α-溴代酸，即包含至少四个碳的α-溴代酸，需要较长的反应时间，通常在室温下大于24小时，但在50℃下小于12小时。

申请人意外地发现，大约50℃的高反应温度使减少反应时间成为可能。

申请人发现，当过量使用氨时，即以大约1:10的摩尔比使用，氨基酸的转化是最优化的。

下表2汇总了所获得的结果。

分析和收率计算以及转化率通过NMR(核磁共振)和HPLC(高效液相色谱)分析技术进行。转化率从反应介质中产生的氨基酸的量相对于α-溴代酸的初始量计算。收率相对于从甲醇提取和重结晶之后回收的产物的质量和定性分析定义。

表2

利用易于实施和控制的制备条件，从而获得了生物来源产生的氨基酸。

此外，由于氨基酸的转化率低于α-溴代酸的消耗率，出现了至少一种定义为亚氨基二酸和/或次氮基三酸的副产物的合成。作为非详尽例子，对于甘氨酸的合成，副产物为特别是亚氨基二乙酸和次氮基三乙酸，对于丙氨酸的合成，副产物为特别是α,α’-亚氨基二丙酸和α,α’,α”-次氮基三丙酸。

Claims (9)

1.一种用于由挥发性脂肪酸(VFA)分子制备氨基酸的方法，所述挥发性脂肪酸分子称为前体，通过厌氧发酵可发酵生物质制备，其特征在于包括至少以下步骤：

-a)在不停止所述发酵的情况下通过提取手段提取所述挥发性脂肪酸(VFA)分子，所述提取手段选自至少不溶于发酵培养基的手段，

-b)一旦提取了所述挥发性脂肪酸(VFA)分子，就在发酵反应器外部收集所述分子，

-c)通过卤化一类挥发性脂肪酸(VFA)来合成给定的α-卤代酸，所述挥发性脂肪酸选自步骤b)收集的所述挥发性脂肪酸并且根据所需类型的氨基酸定义，使用待卤化的所述挥发性脂肪酸(VFA)对应的酸酐，

-d)从所述α-卤代酸合成定义的氨基酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤c)期间，所用的卤代化合物是二溴。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤c)期间，所用的卤代化合物不是二溴。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤c)期间，其中所述酸酐是乙酸酐，并且所述乙酸酐相对于所述挥发性脂肪酸以12％的摩尔百分比使用。

5.根据前述权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤c)期间，所述卤化反应进行的温度为低于所述挥发性脂肪酸的沸点20℃至40℃。

6.根据前述权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤d)期间，所述合成通过与相对于反应化学计量过量的氨的反应进行。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤d)期间，所述合成通过与胺的反应进行。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤d)期间，所述温度在20℃和50℃之间。

9.根据前述权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤d)期间，合成至少一种定义为亚氨基二酸和/或次氮基三酸的副产物。