CN107201321A - 一种阿维拉霉素高产菌株及其选育方法 - Google Patents
一种阿维拉霉素高产菌株及其选育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，采用ARTP及三次137Csy诱变使链霉菌发生突变，并采用2次原生质体融合进行基因重组。有益效果为：经过四轮诱变与两轮原生质体融合，得到融合高产菌株G2‑31，其阿维拉霉素效价达到2842.57 mg/L，是原始菌株11‑10的4倍，经连续传代试验，菌种状态稳定，表现出较高的工业应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物选育技术领域，具体是一种一种阿维拉霉素高产菌株及其选育方法。
背景技术
阿维拉霉素(Avilamycin)又名卑霉素，是由绿色产色链霉（Streptomycesviridoehrongenes）经过发酵产生的一种寡糖类抗生素，由美国礼来公司最先研制开发并命名为效美素(Maxus 100)由于其独特的结构所导致的高安全性，其易降解导致的在肠道基本无残留和对环境污染小以及毒性小、不存在交叉耐药性等特点，因此被广泛用于畜禽饲料中作为添加剂使用，而且无需停药期。目前阿维拉霉素在世界上主要的养殖业国家，比如欧盟、日本、巴西等被大量使用，而在2005年被我国农业部批准进口使用[进口兽药再注册目录，(2005)外兽药证字56号]。近年来，我国对阿维拉霉素的生产研究也在相应的增加，有关的报道也在逐年的增加。
国内外对绿色链霉菌及阿维拉霉素的研究基本上仍处于实验室研究阶段。研究内容包括菌种选育、培养基和培养工艺对细胞生长和阿维拉霉素生成的影响、链霉菌细胞内阿维拉霉素的提取与测定等。但至今仍存在一些关键问题有待解决，主要是阿维拉霉素合成的详细途径及调控因子不明确，无法确定阿维拉霉素生产运输机制等。总体归纳有三点：C1)对链霉菌产阿维拉霉素的基因调控及代谢网络了解不深；C2)主要采用传统育种方法，工作量大，机会性强；C3)筛选手段不精心设计、效率低、工作量大。因此探索新的途径和手段，获得高产阿维拉霉素链霉菌菌株就成为产业化发展的关键问题和核心技术。
现有技术如中国知网中论文：王庆龄. 阿维拉霉素高产菌株选育[D]. 浙江工商大学， 2015.公开了阿维拉霉素是一种正糖霉素族中的寡糖类抗生素，作为一种新型促进消化和代谢调节饲料药物添加剂，以其高安全性、低毒性以及低残留被欧盟等国家批准使用。本文通过诱变及基因组重排的方法并结合利福平抗性压力，选育了高产阿维拉霉素生产菌。通过rpoB序列分析，阐述了重组菌利福平遗传抗性及代谢特性。建立了发酵液中阿维拉霉素无盐相液相色谱测量法。该论文公布的高产阿维拉霉素生产菌产阿维拉霉素的产率还有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无化学污染、安全性高、成本低、突变率高的诱变方法，效率高且能提高正向突变率的筛选方法，选育出阿维拉霉素产率高的菌株。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，具体步骤：
1）ARTP及第一次137Csy诱变：将原始菌株11-10活化培养，制备单孢子悬液，ARTP及137Csy诱变，ARTP照射时间为170~210s，较高的致死率有利于淘汰亲本和筛选突变株，同时等离子诱变时间不能过长。琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到诱变高产菌株B-1、F-2和F-28，冻干管保存。等离子诱变使用的是一种等离子体源，其能够在大气压下产生一股温度在25-40℃之间、并具有高活性离子浓度的等离子体射流。等离子体中的活性粒子可改变微生物的细胞壁及膜的通透性，引起相应基因损伤，从而使微生物的基因簇及代谢发生显著变化，最终致使基因发生突变。ARTP具有成本低、无化学污染、高安全性以及高突变率的优点；
2）第二次137Csy诱变：再次用137Csy进行诱变，再利用琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株G-11、H-7和I-17，冻干管保存；
3）第一轮原生质体融合：将高产菌株B-1、F-2、F-28 、G-11、H-7和I-17分别在种子活化培养基中进行培养，收集菌丝体，加入溶菌酶，得到的六种原生质体，将其作为亲本进行原生质体融合，在利福平浓度为280~320mg/L的抗性平板上进行初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到融合株G1-4、G1-6、G1-20和G1-31，再生培养，冻干管保存。再生平板使用前需在34~40℃的培养箱中预培养一天，或是在60~70℃的烘箱中烘25~35 min，以保证固体培养基表面的水分能够充分蒸发，从而减少由于再生培养基表面的冷凝水所引起的原生质体破裂。原生质体融合技术不仅能够打破有性杂交重组基因以创造新种的界限，更重要的是能够扩大遗传物质的重组范围，能够将多种正向突变融合，得到集多种正向突变于一体的融合菌株；
4）第三次137Csy诱变：对第一次融合的效价最高的菌种G1-6再次137Csy诱变，再利用琼脂块法初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株Y4、Y13和Y32，冻干管保存；
5）第二轮原生质体融合：将效价提高的诱变株Y4、Y13和Y32重复第三步，抗性平板上利福平含量为480~520mg/L，得到融合株G2-10和G2-31，测其效价，将融合株G2-31保藏，保藏号为CGMCC13119。随着原生质体的逐渐融合，筛选菌株的利福平抗性压力增大，在淘汰亲本的同时减轻了初筛的工作量；将融合株G2-31五次传代性能稳定，其正突变率成明显上升趋势；基因组重排技术是将分子进化的对象定向为整个基因组而非单个基因，从而可以更为广泛的对菌株的目的性状进行优化组合。此技术的最大优点就是不必了解菌株的遗传背景而只是从细胞水平上进行定向优化。使用基因组重排技术，能够快速实现链霉菌基因的突变和筛选，得到的融合株G2-31阿维拉霉素的产率高。
优选的，链霉菌活化培养基的成份及其重量份为：可溶性淀粉30~40份、MgSO4·6H2O0.7~1.2份、KNO31.3~1.8份、K2HPO40.5~0.9份、FeSO4·7H2O0.01~0.03份、NaCl0.4~0.9份、Agar30~40份，pH为7.2~7.4。上述活化培养基能使处于冻干状态的链霉菌迅速活化，恢复生长活力并且进行生长繁殖，菌数扩增，得到足够下一步操作的数量。
优选的，再生培养基的配置为：在四个锥形瓶中分别都装有蔗糖10~15份、葡萄糖1~2份、蛋白胨0.01~0.03份、酵母浸出粉0.5~0.8份、乌索酸0.00002~0.00004份、KH2PO40.025~0.05份、MgCl2·6H2O1~1.2份、微量元素溶液0.4~0.8份、TES3~5份、海藻酸钠0.0001~0.0003份和琼脂4~8份，再分别加入单独灭菌的K2H2PO40.002~0.004份、CaCl2·2H2O0.001~0.002份和NaOH0.0005~0.0009份。上述培养基不仅能稳定渗透压，保护原生质体不会因吸水过多涨破或因失水而失去活性，又能提供充足的营养物质，乌索酸和海藻酸钠促进细胞壁的合成，相比于现有技术，上述再生培养基能使细胞壁合成的速度加快，菌株活性强。
优选的，步骤3和5中活化培养基为上述活化培养基中加入1~3份甘氨酸。
优选的，微量元素溶液成份及其重量份为：ZnCl20.0003~0.0005份、FeCl3·6H2O0.001~0.003份、CaCl2·2H2O0.0001~0.0003份、MnCl2·4H2O0.0001~0.0003份、NBB4O7·10H2O0.0001~0.0003份、(NH4)6M7O24·4H2O0.0001~0.0003份和10份蒸馏水。
优选的，链霉菌发酵培养基成份及其重量份为：可溶性淀粉30~40份、豆粕粉30~40份、D-木糖7.5~8.2份、L-缬氨酸2.4~2.5份、大豆蛋白胨5.6~6.3份、MgSO40.52~0.61份、MnCl20.52~0.61份、CaCO30.52~0.61份，pH为7.2~7.4。上述培养基能提供链霉菌发酵所需的各种营养物质，使其分泌产生阿维拉霉素，通过测定每株菌株产生阿维拉霉素的量来对菌株进行筛选。
与现有技术相比，本发明的优点在于：等离子诱变使用的是一种等离子体源，其能够在大气压下产生一股温度在25-40℃之间、并具有高活性离子浓度的等离子体射流。等离子体中的活性粒子可改变微生物的细胞壁及膜的通透性，引起相应基因损伤，从而使微生物的基因簇及代谢发生显著变化，最终致使基因发生突变。ARTP具有成本低、无化学污染、高安全性以及高突变率的优点；原生质体融合技术不仅能够打破有性杂交重组基因以创造新种的界限，更重要的是能够扩大遗传物质的重组范围，能够将多种正向突变融合，得到集多种正向突变于一体的融合菌株；随着原生质体的逐渐融合，筛选菌株的利福平抗性压力增大，在淘汰亲本的同时减轻了初筛的工作量；将融合株G2-31五次传代性能稳定，其正突变率成明显上升趋势；基因组重排技术是将分子进化的对象定向为整个基因组而非单个基因，从而可以更为广泛的对菌株的目的性状进行优化组合。此技术的最大优点就是不必了解菌株的遗传背景而只是从细胞水平上进行定向优化。使用基因组重排技术，能够快速实现链霉菌基因的突变和筛选，得到的融合株G2-31阿维拉霉素的产率高；再生培养基不仅能稳定渗透压，保护原生质体不会因吸水过多涨破或因失水而失去活性，又能提供充足的营养物质，加快细胞壁的合成，相比于现有技术，上述再生培养基能使细胞壁合成的速度加快，菌株活性强；本发明选育方法简单高效，相对于传统选育方法工作量大大减少，最后得到的菌株阿维拉霉素的产率高。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，具体步骤：
1）ARTP及第一次137Csy诱变：将原始菌株11-10活化培养，制备单孢子悬液，ARTP及137Csy诱变，ARTP照射时间为170~210s，较高的致死率有利于淘汰亲本和筛选突变株，同时等离子诱变时间不能过长。琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到诱变高产菌株B-1、F-2和F-28，冻干管保存。等离子诱变使用的是一种等离子体源，其能够在大气压下产生一股温度在25-40℃之间、并具有高活性离子浓度的等离子体射流。等离子体中的活性粒子可改变微生物的细胞壁及膜的通透性，引起相应基因损伤，从而使微生物的基因簇及代谢发生显著变化，最终致使基因发生突变。ARTP具有成本低、无化学污染、高安全性以及高突变率的优点；
2）第二次137Csy诱变：再次用137Csy进行诱变，再利用琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株G-11、H-7和I-17，冻干管保存；
3）第一轮原生质体融合：将高产菌株B-1、F-2、F-28 、G-11、H-7和I-17分别在种子活化培养基中进行培养，收集菌丝体，加入溶菌酶，得到的六种原生质体，将其作为亲本进行原生质体融合，在利福平浓度为280~320mg/L的抗性平板上进行初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到融合株G1-4、G1-6、G1-20和G1-31，再生培养，冻干管保存。再生平板使用前需在34~40℃的培养箱中预培养一天，或是在60~70℃的烘箱中烘25~35 min，以保证固体培养基表面的水分能够充分蒸发，从而减少由于再生培养基表面的冷凝水所引起的原生质体破裂。原生质体融合技术不仅能够打破有性杂交重组基因以创造新种的界限，更重要的是能够扩大遗传物质的重组范围，能够将多种正向突变融合，得到集多种正向突变于一体的融合菌株；
4）第三次137Csy诱变：对第一次融合的效价最高的菌种G1-6再次137Csy诱变，再利用琼脂块法初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株Y4、Y13和Y32，冻干管保存；
5）第二轮原生质体融合：将效价提高的诱变株Y4、Y13和Y32重复第三步，抗性平板上利福平含量为480~520mg/L，得到融合株G2-10和G2-31，测其效价，将融合株G2-31保藏，保藏号为CGMCC13119。随着原生质体的逐渐融合，筛选菌株的利福平抗性压力增大，在淘汰亲本的同时减轻了初筛的工作量；将融合株G2-31五次传代性能稳定，其正突变率成明显上升趋势；基因组重排技术是将分子进化的对象定向为整个基因组而非单个基因，从而可以更为广泛的对菌株的目的性状进行优化组合。此技术的最大优点就是不必了解菌株的遗传背景而只是从细胞水平上进行定向优化。使用基因组重排技术，能够快速实现链霉菌基因的突变和筛选，得到的融合株G2-31阿维拉霉素的产率高。
链霉菌活化培养基的成份及其重量份为：可溶性淀粉30~40份、MgSO4·6H2O0.7~1.2份、KNO31.3~1.8份、K2HPO40.5~0.9份、FeSO4·7H2O0.01~0.03份、NaCl0.4~0.9份、Agar30~40份，pH为7.2~7.4。上述活化培养基能使处于冻干状态的链霉菌迅速活化，恢复生长活力并且进行生长繁殖，菌数扩增，得到足够下一步操作的数量。
再生培养基的配置为：在四个锥形瓶中分别都装有蔗糖10~15份、葡萄糖1~2份、蛋白胨0.01~0.03份、酵母浸出粉0.5~0.8份、乌索酸0.00002~0.00004份、KH2PO40.025~0.05份、MgCl2·6H2O1~1.2份、微量元素溶液0.4~0.8份、TES3~5份、海藻酸钠0.0001~0.0003份和琼脂4~8份，再分别加入单独灭菌的K2H2PO40.002~0.004份、CaCl2·2H2O0.001~0.002份和NaOH0.0005~0.0009份。上述培养基不仅能稳定渗透压，保护原生质体不会因吸水过多涨破或因失水而失去活性，又能提供充足的营养物质，加快细胞壁的合成，相比于现有技术，上述再生培养基能使细胞壁合成的速度加快，菌株活性强。
步骤3和5中活化培养基为上述活化培养基中加入1~3份甘氨酸。
微量元素溶液成份及其重量份为：ZnCl20.0003~0.0005份、FeCl3·6H2O0.001~0.003份、CaCl2·2H2O0.0001~0.0003份、MnCl2·4H2O0.0001~0.0003份、NBB4O7·10H2O0.0001~0.0003份、(NH4)6M7O24·4H2O0.0001~0.0003份和10份蒸馏水。
链霉菌发酵培养基成份及其重量份为：可溶性淀粉30~40份、豆粕粉30~40份、D-木糖7.5~8.2份、L-缬氨酸2.4~2.5份、大豆蛋白胨5.6~6.3份、MgSO40.52~0.61份、MnCl20.52~0.61份、CaCO30.52~0.61份，pH为7.2~7.4。上述培养基能提供链霉菌发酵所需的各种营养物质，使其分泌产生阿维拉霉素，通过测定每株菌株产生阿维拉霉素的量来对菌株进行筛选。
实施例2：
绿色产色链霉菌Streptomyces viridochromogenes 11一10，效价为710mg/L，浙江工商大学实验室提供。
检定菌:藤黄微球菌(Microccus luteus ) 10209，来自于中国工业微生物菌种保藏中心。
一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，具体步骤：
1）ARTP及第一次137Csy诱变：将原始菌株11-10活化培养，制备单孢子悬液，ARTP及137Csy诱变，ARTP照射时间为200s，较高的致死率有利于淘汰亲本和筛选突变株，同时等离子诱变时间不能过长。琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到诱变高产菌株B-1、F-2和F-28，冻干管保存。等离子诱变使用的是一种等离子体源，其能够在大气压下产生一股温度在25-40℃之间、并具有高活性离子浓度的等离子体射流。等离子体中的活性粒子可改变微生物的细胞壁及膜的通透性，引起相应基因损伤，从而使微生物的基因簇及代谢发生显著变化，最终致使基因发生突变。ARTP具有成本低、无化学污染、高安全性以及高突变率的优点；
2）第二次137Csy诱变：再次用137Csy进行诱变，再利用琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株G-11、H-7和I-17，冻干管保存；
3）第一轮原生质体融合：将高产菌株B-1、F-2、F-28 、G-11、H-7和I-17分别在种子活化培养基中进行培养，收集菌丝体，加入溶菌酶，得到的六种原生质体，将其作为亲本进行原生质体融合，在利福平浓度为310mg/L的抗性平板上进行初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到融合株G1-4、G1-6、G1-20和G1-31，再生培养，冻干管保存。再生平板使用前需在37℃的培养箱中预培养一天，或是在65℃的烘箱中烘30 min，以保证固体培养基表面的水分能够充分蒸发，从而减少由于再生培养基表面的冷凝水所引起的原生质体破裂。原生质体融合技术不仅能够打破有性杂交重组基因以创造新种的界限，更重要的是能够扩大遗传物质的重组范围，能够将多种正向突变融合，得到集多种正向突变于一体的融合菌株；
4）第三次137Csy诱变：对第一次融合的效价最高的菌种G1-6再次137Csy诱变，再利用琼脂块法初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株Y4、Y13和Y32，冻干管保存；
5）第二轮原生质体融合：将效价提高的诱变株Y4、Y13和Y32重复第三步，抗性平板上利福平含量为520mg/L，得到融合株G2-10和G2-31，测其效价，将融合株G2-31保藏，保藏号为CGMCC13119。随着原生质体的逐渐融合，筛选菌株的利福平抗性压力增大，在淘汰亲本的同时减轻了初筛的工作量；将融合株G2-31五次传代性能稳定，其正突变率成明显上升趋势；基因组重排技术是将分子进化的对象定向为整个基因组而非单个基因，从而可以更为广泛的对菌株的目的性状进行优化组合。此技术的最大优点就是不必了解菌株的遗传背景而只是从细胞水平上进行定向优化。使用基因组重排技术，能够快速实现链霉菌基因的突变和筛选，得到的融合株G2-31阿维拉霉素的产率高。
链霉菌活化培养基的成份及其含量为：可溶性淀粉20g/L、MgSO4·6H2O0.5 g/L、KNO31.0 g/L、K2HPO40.5 g/L、FeSO4·7H2O0.01 g/L、NaCl0.5 g/L、Agar20 g/L，pH为7.2~7.4。上述活化培养基能使处于冻干状态的链霉菌迅速活化，恢复生长活力并且进行生长繁殖，菌数扩增，得到足够下一步操作的数量。
再生培养基的配置为：在四个锥形瓶中分别都装有蔗糖10.3%、葡萄糖1.0%、蛋白胨0.01%、酵母浸出粉0.5%、乌索酸0.00002%、KH2PO40.025%、MgCl2·6H2O1.12%、微量元素溶液0.2mL/100 mL、TES1.0 mL/100 mL、海藻酸钠0.0001%和琼脂2.0%，再分别加入单独灭菌的K2H2PO4（0.5%）、CaCl2·2H2O（2.5N）和NaOH（1.0N）3 mL，2.4 mL和2.1 mL。上述培养基不仅能稳定渗透压，保护原生质体不会因吸水过多涨破或因失水而失去活性，又能提供充足的营养物质，加快细胞壁的合成，相比于现有技术，上述再生培养基能使细胞壁合成的速度加快，菌株活性强。
步骤3和5中活化培养基为上述活化培养基中加入0.5%甘氨酸。
链霉菌发酵培养基成份及其含量为：可溶性淀粉20.0 g/L、豆粕粉20.0 g/L、D-木糖7.812 g/L、L-缬氨酸2.34 g/L、大豆蛋白胨5.0 g/L、MgSO40.5 g/L、MnCl20.5 g/L、CaCO30.5 g/L，pH为7.2~7.4。上述培养基能提供链霉菌发酵所需的各种营养物质，使其分泌产生阿维拉霉素，通过测定每株菌株产生阿维拉霉素的量来对菌株进行筛选。
牛肉膏蛋白胨固体培养基成份及其含量为：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl5.0 g/L、琼脂20.0 g/L，pH为7.0~7.2。
牛肉膏蛋白胨半固体培养基成份及其含量为：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl5.0 g/L、琼脂10.0 g/L，pH为7.0~7.2。
牛肉膏蛋白胨液体培养基成份及其含量为：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl5.0 g/L，pH为7.0~7.2。
微量元素溶液成份及其重量份为：ZnCl20.0003~0.0005份、FeCl3·6H2O0.001~0.003份、CaCl2·2H2O0.0001~0.0003份、MnCl2·4H2O0.0001~0.0003份、NBB4O7·10H2O0.0001~0.0003份、(NH4)6M7O24·4H2O0.0001~0.0003份和10份蒸馏水。
高渗溶液（PB液）的配置：蔗糖10.3g、K2SO40.025g、MgCl2·6H2O0.202g、微量元素0.2mL，用去离子水定容到88mL，灭菌；再加入单独灭菌的KH2PO4（0.5%）、CaCl2·2H2O（2.5N）、TES各10.0 mL、1.0 mL和10.0 mL。
TES缓冲液：Tris-HCl（pH8.0）10mmol/L、EDTA1 mmol/L和SDS0.1 mmol/L。
酶溶液：0.2g溶菌酶溶解在100 mLPB液中，配成浓度为0.2%的酶溶液。
单孢子悬液的制备：新鲜的孢子斜面中加入5mL的无菌生理盐水，用接种棒将孢子刮下，装入无菌离心管中，再用5mL无菌生理盐水斜面一次，并转入无菌离心管，用无菌脱脂棉过滤，得单孢子悬液，并计数为107。
菌种培养：
A1.用无菌生理盐水从新鲜的斜面上将孢子洗下，接种于装有100 mL种子培养基的500mL三角瓶中(含有0.5 g甘氨酸)，28℃，220 rpm下震荡培养48~54h；
B1.用显微镜观察是否染菌；
C1.移取5 mL上述种子液到10 mL的无菌离心管中，6000 rpm， 10 min。离心弃去上清液，收集菌丝体。加入5 mL无菌水，振荡均匀后倒入到装有一定量玻璃碎片和10 mL蒸馏水的100 mL灭菌三角瓶中，在220 rpm，震荡30 min，使成团的菌丝体打碎分散开。
D1.震荡结束后，吸取5 mL的菌液到10 mL无菌离心管中，6000 rpm离心10 min，弃去上清液；
E1.在上述10 mL离心管中加入5 mL PB液，用移液枪吹吸均匀，洗涤菌丝体，离心弃上清，重复一次，然后将菌丝体悬浮于5 mL PB液中，按下述步骤进行原生质体的制备。
原生质体制备：
A2.将上述制备得到的菌丝体在6000 rpm离心10 min，弃去上清液；
B2.在上述离心管中加入5 mL 0.2% ( g/mL)的溶菌酶，用移液枪吹均匀，于35℃的水浴中酶解2h，每隔10 min轻轻震荡一次，使菌体充分悬浮在酶液中。原生质体的形成情况可用显微镜跟踪观察。酶解结束后，再用移液枪吹吸几次，以使形成的原生质体从菌丝体中释放出来；
C1.用带有脱脂棉的一次性针筒过滤酶解液，收集滤液。在2000 rpm转速下离心15min，温和的沉淀原生质体，去除酶液；
D2.用5 mL PB液洗涤原生质体一次，以洗净酶液；
E2.离心弃去上清液，然后用5 mL PB液重新悬浮原生质体，用移液枪吹吸均匀;再用PB液稀释一定浓度，在血球计数板上计数原生质体；
F2.用PB液配制成约107个/mL的原生质体溶液。
原生质体融合：
A3.将不同菌株的原生质体悬液各取1 mL于5 mL的无菌离心管中，1500rpm ，1 5 min，离心弃去上清液；
B3.加入40%的聚乙二醇(PEG6000 )，用移液枪吹吸均匀，悬浮原生质体，尽可能让助融剂PEG把原生质体包裹起来，25℃放置20 min ；
C3.2500 rpm ，10 min，离心使原生质体沉淀，弃去上清液。再用PB液洗涤一次，1500rpm离心15 min，弃去上清液；
D3.加入5 mL PB液悬浮原生质体，适当稀释后吸取0.1 mL悬液涂布于再生平板上；在28℃恒温培养箱中培养6~7 d 。
原生质体再生：
A4.取经过适当稀释后的原生质体悬液0.1 mL于加有利福平的再生平板上(再生平板使用前需在37℃的培养箱中预培养一天，或是在65℃的烘箱中烘30 min，以保证固体培养基表面的水分能够充分蒸发，从而减少由于再生培养基表面的冷凝水所引起的原生质体破裂)；
B4.将涂布好的培养皿倒置于28℃的培养箱中培养6~7 d，观察再生结果。待再生双层平板上长出菌落，再经过初筛、复筛测定其阿维拉霉素发酵效价，筛选出的高产菌株作为下一轮融合的出发菌株。
琼脂块初筛：稀释涂布后的平板28℃培养3d后，用灭过菌的孔径为8mm的打孔器将单个菌落打下，打下之后再置于无菌的恒湿的小室中培养4d，然后将其放置于含有2%的指示菌的琼脂平板上，37℃培养18~24h后测定抑菌圈大小，以出发菌株为对照，挑出抑菌圈比较大的菌株扩培并摇瓶复筛。
生测法检测阿维拉霉素产量：
将灭菌后的牛肉膏蛋白陈固体培养基倒入己灭菌的平皿中(每个平皿15mL左右)，室温下自然凝固，作为平板的下层；
指示菌Microccus luteus在液体培养基中摇瓶培养至OD 0.3(紫外检测波长600nm)左右备用，将灭菌后的牛肉膏蛋白胨半固体培养基冷却到45℃左右，按2%的体积比向培养基中加入Microccus luteus的培养液，混匀，然后吸取5 mL加到已凝固的下层培养基上，自然凝固，作为平板的上层；
用无菌镊子夹取内径6.0 mm，外径为8.0 mm，高为10.0 mm的牛津杯放在上层培养基表面。加入150μL样品，常温下静置2h，使样品扩散(由于阿维拉霉素分子量较大，其在培养基中的扩散速度比较慢，如果加样后立即放置于培养箱中培养，容易引起测定的结果偏低，因此根据经验，点样后必须先进行扩散)，37℃培养20h，测量抑菌圈直径的大小；
此曲线公式为LgY= 0.003 x2一0.2347其中R2 = 0.9995
Y:效价( mg/L)
X:直径(mm)
配制一定浓度梯度的阿维拉霉素标准品溶液。每个平板上放6个牛津杯，间隔加入150μL500 mg/L的标准液。所有平板上由500 mg/L标准液所得抑菌圈直径的平均值与每个梯度中500 mg/L的标准液所得抑菌圈直径的平均值的差为各梯度的校正值。以标准液浓度的对数(mg/L)为纵坐标，各梯度抑菌圈直径校正值的平方(mm2)为横坐标制作标准曲线。标准液有5个梯度，每个梯度3个平行；
将发酵液与甲醇等体积混匀，37℃放置2 h，4000 rpm离心15 min后，取上清液做效价测定；
每个平板上都取一个牛津杯加入同一浓度的标准液，之后求出其抑菌圈直径的平均值。将每个平板上标准液的抑菌圈直径与平均值相比，会得到一个校正数。将各个平板的校正数与发酵液的抑菌圈直径进行比较校正，所得的校正值经过在标准曲线上查得相对应标准品浓度即可作为所测定发酵液的效价。
最后得到的G2-31的抑菌圈直径达到28.79mm（对应效价为2842.57 mg/L），比原始菌株（效价为710mg/L）提高了300%。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种阿维拉霉素高产菌株，其特征在于：其保藏号为：CGMCC13119。
2.一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于以下步骤：
1） ARTP及第一次137Csy诱变：将原始菌株11-10活化培养，制备单孢子悬液，ARTP及137Csy诱变，琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到诱变高产菌株B-1、F-2和F-28，冻干管保存；
2） 第二次137Csy诱变：再次用137Csy进行诱变，再利用琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株G-11、H-7和I-17，冻干管保存；
3） 第一轮原生质体融合：将高产菌株B-1、F-2、F-28 、G-11、H-7和I-17分别在种子活化培养基中进行培养，收集菌丝体，加入溶菌酶，得到的六种原生质体，将其作为亲本进行原生质体融合，在含利福平的抗性平板上进行初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到融合株G1-4、G1-6、G1-20和G1-31，再生培养，冻干管保存；
4） 第三次137Csy诱变：对第一次融合的效价最高的菌种G1-6再次137Csy诱变，再利用琼脂块法初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株Y4、Y13和Y32，冻干管保存；
5） 第二轮原生质体融合：将效价提高的诱变株Y4、Y13和Y32重复第三步得到融合株G2-10和G2-31，测其效价，将融合株G2-31保藏。
3.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的步骤1中ARTP照射时间为170~210s。
4.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的步骤3中抗性平板上利福平含量为280~320mg/L。
5.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的步骤1、2、4链霉菌活化培养基的成份及其重量份为：可溶性淀粉30~40份、MgSO4·6H2O0.7~1.2份、KNO31.3~1.8份、K2HPO40.5~0.9份、FeSO4·7H2O0.01~0.03份、NaCl0.4~0.9份、Agar30~40份，pH为7.2~7.4。
6.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的再生培养基的配置为：在四个锥形瓶中分别都装有蔗糖10~15份、葡萄糖1~2份、蛋白胨0.01~0.03份、酵母浸出粉0.5~0.8份、乌索酸0.00002~0.00004份、KH2PO40.025~0.05份、MgCl2·6H2O1~1.2份、微量元素溶液0.4~0.8份、TES3~5份、海藻酸钠0.0001~0.0003份和琼脂4~8份，再分别加入单独灭菌的K2H2PO40.002~0.004份、CaCl2·2H2O0.001~0.002份和NaOH0.0005~0.0009份。
7.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的步骤5中抗性平板上利福平含量为480~520mg/L。
8.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的步骤3和5中活化培养基为在步骤1、2、4中活化培养基中加入1~3份甘氨酸。
9.根据权利要求5所述的再生培养基，其特征在于：所述的微量元素溶液成份及其重量份为：ZnCl20.0003~0.0005份、FeCl3·6H2O0.001~0.003份、CaCl2·2H2O0.0001~0.0003份、MnCl2·4H2O0.0001~0.0003份、NBB4O7·10H2O0.0001~0.0003份、(NH4)6M7O24·4H2O0.0001~0.0003份和10份蒸馏水。
10.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的链霉菌发酵培养基成份及其重量份为：可溶性淀粉30~40份、豆粕粉30~40份、D-木糖7.5~8.2份、L-缬氨酸2.4~2.5份、大豆蛋白胨5.6~6.3份、MgSO40.52~0.61份、MnCl20.52~0.61份、CaCO30.52~0.61份，pH为7.2~7.4。
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