CN107190020A - 传染性法氏囊病病毒重组泛素化dna疫苗及其制备方法 - Google Patents

传染性法氏囊病病毒重组泛素化dna疫苗及其制备方法 Download PDF

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焦鹏涛
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韦天超
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Abstract

本发明公开了一种表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒，主要由传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因、鸡的Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。据此，发明人设计并建立了相应的传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗及其制备方法。与现有技术相比，本发明制作简单、成本低廉、安全性高、免疫效果良好。试验表明，该疫苗可有效避免和降低传染法氏囊病导致的法氏囊等免疫器官的损伤以及鸡的死亡数量。

Description

传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于DNA疫苗技术领域，尤其涉及一种传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗及其制备方法。
背景技术
传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是一种由传染性法氏囊病病毒引起的危害青年鸡的严重且高度接触性的免疫抑制性疾病。自1979年在中国首次发现传染性法氏囊病以来已经近40年。尽管大量使用传统弱毒活疫苗和灭活疫苗对传染性法氏囊病进行防治，但该病依旧在全国范围内流行。传染性法氏囊病的流行给全国养禽业的健康稳定发展带来了严重影响，给养禽业造成了巨大经济损失。
传染性法氏囊病病毒的基因组编码两个主要的结构蛋白VP2和VP3。其中，VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，能够诱导机体产生中和抗体，因而含有编码VP2蛋白基因的疫苗能够诱发机体产生更好的保护效果。
泛素基因Ub是一种小分子多肽，由76个氨基酸残基组成，泛素与抗原蛋白的结合有利于在机体内的加工递呈，诱导机体产生更强的细胞免疫应答。
重组DNA疫苗是通过将外源基因克隆入真核表达载体中，将重组质粒注射到动物体内，使外源基因在机体内表达形成抗原，诱导机体产生免疫反应。与传统的灭活疫苗相比，重组DNA疫苗不仅能诱导机体的体液免疫应答，而且能诱导机体的细胞免疫应答。与传统的弱毒活疫苗相比，重组DNA疫苗具有安全、稳定、制备简单的优点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种制作简单、成本低廉、安全性高、免疫效果良好的传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒，主要由传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因、鸡的Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。
所述Ub基因通过linker将鸡的Ub基因与传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因连接。
上述表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒，具有序列表SEQ.ID.No.5的碱基序列。
上述表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒的构建方法，用PCR方法扩增传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因和鸡的Ub基因，将鸡的Ub基因与传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因通过引入linker采用酶切位点相连的方法连接并将PCR产物经HindIII和Kpn I双酶切定向插入以HindII和Kpn I双酶切处理的真核表达载体pVAX1中，即得表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒pVAX1-Ub-linker-VP2。
上述表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒在制备预防传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗方面的应用。
上述传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)将Ub-VP2基因片段克隆入真核表达载体pVAX1
将获得的Ub-VP2基因片段与真核表达载体质粒pVAX1分别用限制性内切酶HindII和Kpn I进行双酶切，通过T4DNA连接酶连接，将Ub-VP2基因片段克隆入真核表达载体pVAX1；具体按以下操作进行：
将Ub-VP2基因片段用HindII和Kpn I进行双酶切；酶切条件为37℃作用3h，酶切体系为：
将真核表达载体pVAX1用HindII和Kpn I进行双酶切；酶切条件为37℃作用3h，酶切体系为：
反应完成后，分别对Ub-VP2基因片段酶切产物以及真核表达载体pVAX1酶切产物进行纯化回收；将回收产物用T4DNA连接酶进行连接；连接条件为16℃作用3h，连接体系为：
将连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌，随机挑取10个菌落，于含卡那霉素的LB培养基中37℃培养12h，提取质粒，获得重组DNA质粒；
2)获得传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗
a)用限制性内切酶HindII和Kpn I对获得的重组DNA质粒进行双酶切；
b)对重组DNA质粒进行序列测定；
将经过双酶切电泳及序列测定正确的重组DNA质粒命名为pVAX1-Ub-linker-VP2，即得到传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗。
针对现有传染性法氏囊病防治存在的问题，发明人构建了一种表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒，主要由传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因、鸡的Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。据此，发明人设计并建立了相应的传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗及其制备方法。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
1)传统传染性法氏囊病病毒弱毒疫苗的研制需要在鸡胚或细胞上连续传代获得毒力减弱的疫苗毒株，研制时间长，花费成本高。而本发明只需将编码鸡泛素基因片段的Ub基因与编码传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2的基因序列进行连接，克隆入真核表达载体pVAX1，转化入大肠杆菌感受态DH5d中，用常规方法提取质粒即可得到传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗，操作方法简单，制备时间短，可进行大批量生产。
2)本发明的传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗是重组有传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2蛋白抗原基因的真核表达质粒，以肌肉注射的形式免疫机体后，能够使抗原基因在宿主体内表达，从而诱导机体产生免疫反应。而该DNA疫苗在制备时将泛素基因与抗原基因结合，有利于抗原基因的产物在机体内的加工递呈，诱导机体产生更强的细胞免疫应答，因此产生更好的免疫效果。
3)本发明的传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗不含有活的传染性法氏囊病病毒，应用时安全可靠，不存在散毒的风险，而且容易保存和运输。试验表明，该疫苗可有效避免和降低传染法氏囊病导致的法氏囊等免疫器官的损伤以及鸡的死亡数量。
附图说明
图1是传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗双酶酶切结果的琼脂糖凝胶电泳图。
图中：1是1kb Ladder DNA Marker；2是传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗HindIII+Kpn I双酶切结果；3是真核表达质粒pVAX1HindIII+Kpn I双酶切结果。
图2是传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗质粒pVAX1-Ub-linker-VP2的结构示意图。
具体实施方式
实验例
步骤一、鸡泛素基因片段Ub与传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因的扩增
1)将200μg鸡肌肉组织(或200μL传染性法氏囊病病毒液)与1mL Trizol溶液混匀，震荡静置5min，加入200μL氯仿，震荡30s，随后12000r/min离心30min，取上清400μL于新离心管，加入400μL异丙醇混匀，于-20℃静置30min后12000r/min离心30min弃掉上清，加入1mL 75％乙醇12000r/min离心10min弃上清液，加入30μL ddH2O获得鸡肌肉组织(或传染性法氏囊病病毒)的RNA，贮存于-20℃备用。
2)将步骤1中获得的鸡肌肉组织(或传染性法氏囊病病毒)的RNA加入下列混合液中：4μL缓冲液(250mM Tris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)、1μL 10μM dNTPs、2μL0.1M DTT、200U M-MLV(Takara)、10μM引物(Ub-R或VP2-R)。将混合物置于42℃水浴锅中30min，获得鸡肌肉组织(或传染性法氏囊病病毒)的cDNA。将2μL鸡肌肉组织(或传染性法氏囊病病毒)的cDNA加入下列试剂：5μL缓冲液(200μLTris-HCl，pH8.4，500mM KCl)、1.5μL 50μM MgCl2、10μM引物(Ub-F或VP2-F)、1μL 10μM dNTPs、2U Taq DNA聚合酶和38.1μL ddH2O，反应在Veriti96PCR仪器(ABI)中进行：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。反应完成后，通过胶回收得到Ub基因和VP2基因片段。
UB-F：5’-CCCAAGCTTCCACCATGCAGATCTTTGTGAAG-3’(SEQ.ID.No.1)：
UB-R：5’-CCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCGGCACCCCTCAGGCGCAG-3’(SEQ.ID.No.2)：
VP2-F：5’-CGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGGGGCGGATCTATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC-3’(SEQ.ID.No.3)；
VP2-R：5’-CGGGGTACCCAGAAGATAGTCTACACCTTCCCCA-3’(SEQ.ID.No.4)。
步骤二、鸡泛素基因片段Ub与VP2基因片段的连接
用引物Ub-F、VP2-R扩增获得的Ub、VP2基因片段得到Ub-VP2基因片段，反应体系为：1μL Ub基因扩增产物、1μL VP2基因扩增产物、5μL缓冲液(200μLTris-HCl，pH8.4，500mMKCl)、1.5μL 50μM MgCl2、10μM引物(Ub-F、VP2-R)、1μL 10μM dNTPs、2U Taq DNA聚合酶和38.1μL ddH2O，反应在Veriti96PCR仪器(ABI)中进行：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。反应完成后，通过胶回收得到Ub-VP2基因片段。
步骤三、传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗的制备
1)将Ub-VP2基因片段克隆入真核表达载体pVAX1
将获得的Ub-VP2基因片段与真核表达载体质粒pVAX1分别用限制性内切酶HindIII和Kpn I进行双酶切，通过T4DNA连接酶连接，将Ub-VP2基因片段克隆入真核表达载体pVAX1；具体按以下操作进行：
将Ub-VP2基因片段用HindIII和Kpn I进行双酶切；酶切条件为37℃作用3h，酶切体系为：
将真核表达载体pVAX1用HindIII和KpnI进行双酶切；酶切条件为37℃作用3h，酶切体系为：
反应完成后，分别对Ub-VP2基因片段酶切产物以及真核表达载体pVAX1酶切产物进行纯化回收；将回收产物用T4DNA连接酶进行连接；连接条件为16℃作用3h，连接体系为：
将连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌，随机挑取10个菌落，于含卡那霉素的LB培养基中37℃培养12h，提取质粒，获得重组DNA质粒；
2)获得传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗
a)用限制性内切酶HindIII和Kpn I对获得的重组DNA质粒进行双酶切；将双酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统系统中观察到约1700bp大小条带时表明Ub-VP2基因片段克已经插入真核表达载体中；
b)对重组DNA质粒进行序列测定；序列测定结果为序列表SEQ.ID.N0.5的碱基序列时，表明Ub-VP2基因片段正确插入真核表达载体内；
将经过双酶切电泳及序列测定正确的重组DNA质粒命名为pVAX1-Ub-linker-VP2，即得到传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗。
应用例
一、动物免疫试验
1日龄非免疫三黄鸡20只，饲养至7日龄随机分成2组，每组10只，即为免疫组和对照组。免疫组试验鸡经腿部肌肉注射免疫传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗100μg/只，对照组试验鸡经腿部肌肉注射相同体积PBS。14日龄时，免疫组试验鸡进行第二次加强免疫，免疫方式和剂量同7日龄第一次免疫，对照组试验鸡经腿部肌肉注射相同体积PBS。
二、动物攻毒试验
当免疫组和对照组试验鸡饲养至28日龄时，用属于超强毒的传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)地方分离株NN1172对免疫组和对照组试验鸡进行攻毒，按1×104EID50/只剂量滴口攻毒。攻毒后，将免疫组和对照组试验鸡继续饲养10天，观察记录两组试验鸡发病、死亡情况。
结果：对照组鸡在感染传染性法氏囊病病毒后3天，试验鸡开始表现出临床症状(食欲降低，精神沉郁，羽毛松乱)，以及出现死亡，累计死亡3只，符合传染性法氏囊病发病的特征；免疫组鸡在感染传染性法氏囊病病毒后，有1只试验鸡出现临床症状并死亡，其余试验鸡没有表现出临床症状，解剖时法氏囊、胸腺等免疫器官的损伤也未观察到。说明利用本发明的传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗免疫试验鸡，可避免和降低传染法氏囊病的发生导致的鸡法氏囊等免疫器官的损伤及死亡数量。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西大学
<120> 传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗及其制备方法
<130> 传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗及其制备方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
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ttcgggcctt aaggaggata gctgtgccgg tggtctccac actgttccca cccgccgctc 1680
ctctggccca tgcaattggg gaaggtgtag actatcttct g 1721

Claims (6)

1.一种表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒，其特征在于主要由传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因、鸡的Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。
2.根据权利要求1所述的表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒，其特征在于：所述Ub基因通过linker将鸡的Ub基因与传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因连接。
3.根据权利要求2所述的表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.5的碱基序列。
4.权利要求1所述的表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒的构建方法，其特征在于用PCR方法扩增传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因和鸡的Ub基因，将鸡的Ub基因与传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因通过引入linker采用酶切位点相连的方法连接并将PCR产物经HindIII和KKpn I双酶切定向插入以HindIII和KKpn I双酶切处理的真核表达载体pVAX1中，即得表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒pVAX1-Ub-linker-VP2。
5.权利要求1所述表达传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2的重组质粒在制备预防传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗方面的应用。
6.权利要求5所述传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将Ub-VP2基因片段克隆入真核表达载体pVAX1
将获得的Ub-VP2基因片段与真核表达载体质粒pVAX1分别用限制性内切酶HindIII和KKpn I进行双酶切，通过T4DNA连接酶连接，将Ub-VP2基因片段克隆入真核表达载体pVAX1；具体按以下操作进行：
将Ub-VP2基因片段用HindIII和KKpn I进行双酶切；酶切条件为37℃作用3h，酶切体系为：
将真核表达载体pVAX1用HindIII和KKpn I进行双酶切；酶切条件为37℃作用3h，酶切体系为：
反应完成后，分别对Ub-VP2基因片段酶切产物以及真核表达载体pVAX1酶切产物进行纯化回收；将回收产物用T4DNA连接酶进行连接；连接条件为16℃作用3h，连接体系为：
将连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌，随机挑取10个菌落，于含卡那霉素的LB培养基中37℃培养12h，提取质粒，获得重组DNA质粒；
2)获得传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗
a)用限制性内切酶HindIII和KKpn I对获得的重组DNA质粒进行双酶切；
b)对重组DNA质粒进行序列测定；
将经过双酶切电泳及序列测定正确的重组DNA质粒命名为pVAX1-Ub-linker-VP2，即得到传染性法氏囊病病毒重组泛素化DNA疫苗。
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