CN107179360A - 用于法庭科学毒品检测的三唑仑标准物质的纯化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于法庭科学毒品检测的三唑仑标准物质的纯化制备方法，包括如下步骤：(1)检测缴获三唑仑样品中三唑仑的纯度，选择缴获三唑仑样品作为纯化制备三唑仑标准物质的原料；(2)利用高效液相色谱制备三唑仑标准物质。本发明制备纯化方法得到的三唑仑经核磁共振、液相色谱‑串联质谱联用、红外光谱分析确认，其纯度经液相色谱、气相色谱确认定值，并对色谱无响应杂质进行测定；根据标准物质研制要求，其稳定性、均匀性、定值、总不确定度的估计均符合相关规定，达到预期指标。

Description

用于法庭科学毒品检测的三唑仑标准物质的纯化制备方法

技术领域

本发明涉及法庭科学毒品标准品的制备。更具体地，涉及一种用于法庭科学毒品检测的三唑仑标准物质的纯化制备方法。

背景技术

目前，日趋严重的毒品问题已成为全球性的灾难。毒品的泛滥直接危害人民的身心健康，并给经济发展和社会进步带来巨大威胁。因此，建立法庭科学毒品检测量值溯源体系，提高毒品成份量测量技术，保证测量结果的可靠性和可比性，建立测量数据的共享与互认，为法庭提供准确可靠的证据，已成为世界各国毒品鉴定机构普遍关注的问题。

毒品成份量测量技术及溯源性保障是一个有机的整体，是核心测量能力在法庭科学毒品成份量测量领域的重要体现。标准物质是贯穿于这个整体的骨架，是量值的载体，是毒品成份量溯源体系的关键要素，是保证测量结果在时间和空间上的准确性和可比性的重要基础，是实现有效测量即准确、可比、可溯源测量的根本保证。

欧美等国家技术先进的毒品检测实验室大多采用Sigma等公司生产的国际上公认的标准物质，但在我国只能依赖进口的标准物质，量少价高，有许多还不能向中国提供。目前国内毒品分析中使用的“对照品”不仅种类极为有限，而且普遍缺乏完善的结构鉴定、纯度测定、均匀性和稳定性等相应的技术指标。这些都给涉毒案件检测带来一定的不确定性，直接影响到定量结果的准确性。而且，国内毒品标准物质的匮乏，已经成为制约我国实现法庭科学毒品检测化学测量方法标准化、测量结果的溯源和互认的主要障碍。因此，能够制备出用于法庭科学毒品检测的毒品标准物质已经成为我国毒品研究领域亟需解决的问题。

三唑仑的理化性质，又称：三唑仑；三唑氯安定；三唑苯二氮卓；英文通用名称：Triazolam，化学名称：8-氯-6-(2-氯苯基)-1-甲基-4H-[1,2,4]三氮唑并[4,3-A][1,4]苯并二氮杂卓，英文名称：8-chloro-6-(2-chlorophenyl)-1-methyl-4H-[1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]benzodiazepine，沸点：535.6℃at 760mmHg，分子式：C₁₇H₁₂C_l2N₄，分子量：343.21，CA登记号：28911-01-5。结构式为：

理化性质：纯品为白色或类白色结晶性粉末，无臭。本品在冰醋酸或三氯甲烷中易溶，在甲醇中略溶，在水中几乎不溶。储存条件2-8℃。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于法庭科学毒品检测的三唑仑标准物质的纯化制备方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

用于法庭科学毒品检测的三唑仑标准物质的纯化制备方法，包括如下步骤：

(1)检测缴获三唑仑样品中三唑仑的纯度，选择缴获三唑仑样品作为纯化制备三唑仑标准物质的原料；

(2)利用高效液相色谱制备三唑仑标准物质。

上述用于法庭科学毒品检测的三唑仑标准物质的纯化制备方法，在步骤(1)中，包括如下步骤：

(1.1)样品溶液的制备：1.0mg三唑仑样品溶于1mL甲醇中，配成1.0mg/mL三唑仑样品溶液用于定性及定量分析，使用前样品溶液经过0.45μm微孔滤膜过滤；

(1.2)确定液相色谱条件：色谱柱为Shim-pack HRC-ODS柱,250mm×4.6mm I.D.，5μm；流动相为V_甲醇：V_水＝50:50，等度洗脱；紫外检测波长219nm；流速1.0mL/min；柱温35℃；

(1.3)计算标准曲线的回归方程及确定线性范围：用色谱甲醇稀释三唑仑标准储备液，精密配制成浓度分别为10、20、50、100、200、500、1000μg/mL的三唑仑对照品溶液，按步骤(1.2)中的反相色谱条件测定，每个浓度重复3次，以平均值计算，记录三唑仑色谱峰面积，以对照品的进样浓度为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标作图，并计算标准曲线的回归方程；以峰面积对浓度作图，标准曲线的回归方程为：

Y＝4×10⁷X+79945，R²＝0.9997

表明三唑仑在0.5--1000μg/mL的范围内线性关系良好；

(1.4)按步骤(1.2)中反相色谱方法分析测定样品浓度为1.0mg/mL的三唑仑样品溶液，重复测定3次，记录三唑仑峰面积，计算其平均值，按峰面积外标法计算样品中的三唑仑含量。

上述用于法庭科学毒品检测的三唑仑标准物质的纯化制备方法，在步骤(2)中，包括如下步骤：

(2.1)样品溶液的制备：三唑仑片剂，粉碎，加甲醇充分浸泡，分离出甲醇液，离心浓缩至干，加甲醇定容至10mL；样品溶液均超声溶解5min，并经过0.45μm微孔滤膜过滤；

(2.2)确定液相色谱条件：色谱柱为Shim-pack VP-ODS制备柱，250mm×20mmI.D.，15μm；流动相为V_甲醇：V_水＝55:45，等度洗脱；紫外检测波长219nm；流速8mL/min；上样量700μL；柱温为室温；

(2.3)在样品中三唑仑是以其原体的形式存在的，经制备液相分离后馏分中仍以其原体形式存在，需经过进一步的纯化处理；经旋蒸后将馏分中的甲醇成分去除，冷冻干燥后即可获得三唑仑白色粉末。

本发明的有益效果如下：

本发明制备纯化方法得到的三唑仑晶体中，按照高效液相色谱峰面积归一化法计算三唑仑纯度大于或等于99.1wt％。

本发明制备纯化方法得到的三唑仑经核磁共振、液相色谱-串联质谱联用、红外光谱分析确认，其纯度经液相色谱、气相色谱确认定值，并对色谱无响应杂质进行测定；根据标准物质研制要求，其稳定性、均匀性、定值、总不确定度的估计均符合相关规定，达到预期指标。

本发明的制备纯化方法可为我国司法鉴定部门提供量值准确、可溯源的三唑仑标准物质，填补我国法庭科学领域毒品标准物质空白，以改进分析测量质量，提高定量结果的准确度，最大程度地保证测量结果的有效性。有助于建立法庭科学毒品检测量值溯源体系，有利于实现国内法庭科学毒品检测化学测量方法标准化，实现测量结果的可靠、有效和互认。

克服了现有技术制备纯化方法得到的三唑仑样品存在的纯度低、稳定性差、均匀性差、制备过程复杂等缺陷，提供了一种利用高效液相色谱分离法获得高纯度、高稳定性、回收率高、便于规模化生产的三唑仑标准物质制备方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1三唑仑的紫外光谱图；图2三唑仑样品反相HPLC色谱图；

图3三唑仑样品制备HPLC色谱图；图4三唑仑馏分的反相HPLC色谱图；

图5三唑仑馏分的氢谱图；图6三唑仑馏分的碳谱图；

图7三唑仑的红外谱图；图8三唑仑测定的质谱图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本实施例主要是利用缴获的三唑仑样本，对利用制备液相色谱法分离纯化制备三唑仑的实验条件进行了优化筛选。

一、仪器、试剂及材料

1.1主要仪器

分析型高效液相色谱仪(日本岛津)，包括：LC-20AD高压输液泵；SIL-10A自动进样器；SPD-20A二极管阵列检测器；CTO-20A柱温箱。

制备型高效液相色谱仪(Agilent)，包括：G1361A高压输液泵；G2260A自动进样器；G1315D二极管阵列检测器；G1364B自动馏分收集器。

BUCHI旋转蒸发器(日本BUCHI公司)；KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；飞鸽牌TDL-40B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；XS105Dual Range电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；

1.2主要试剂及材料

甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)，二乙胺(色谱纯，美国ACROSOrganics公司)，三氟乙酸(色谱纯，中国百灵威公司)，超纯水(经Millipore超纯水制备系统净化，法国Millipore公司)。

三唑仑1mg/mL标准溶液(中国百灵威公司)。三唑仑样品(白色片剂)由案件缴获并应用于本研究中。

二、缴获三唑仑样品中三唑仑的纯度测定及三唑仑标准物质的纯化制备

2.1样品溶液的制备

分析型：1.0mg三唑仑样品溶于1mL甲醇中，配成1.0mg/mL三唑仑样品溶液用于定性及定量分析，使用前样品溶液经过0.45μm微孔滤膜过滤。

制备型：三唑仑片剂，粉碎，加甲醇充分浸泡，分离出甲醇液，离心浓缩至干，加甲醇定容至10mL。样品溶液均超声溶解5min，并经过0.45μm微孔滤膜过滤。

2.2液相色谱条件

2.2.1反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析方法:

色谱柱为Shim-pack HRC-ODS柱(250mm×4.6mm I.D.，5μm)；流动相为V_甲醇：V_水＝50:50，等度洗脱；紫外检测波长219nm；流速1.0mL/min；柱温35℃。

2.2.2反相高效液相色谱(RP-HPLC)制备方法:

色谱柱为Shim-pack VP-ODS制备柱(250mm×20mm I.D.，15μm)；流动相为V_甲醇：V_水＝55:45，等度洗脱；紫外检测波长219nm；流速8mL/min；上样量700μL；柱温为室温。

2.3高效液相色谱分析条件的优化

2.3.1色谱柱的选择

采用反相色谱柱Shim-pack VP-ODS柱(250mm×4.6mm I.D.，5μm)，对三唑仑进行分析。

2.3.2检测波长的选择

三唑仑样品中的除主要组分三唑仑，还有一些微量杂质等。经过HPLC-DAD分析，在190-500nm范围内，各种物质在219nm左右均有较强的紫外吸收，如图1所示，所以选择检测波长为219nm。

2.3.3流动相体系的选择

关于反相色谱流动相体系的选择，分别考察了甲醇-水、甲醇-三氟乙酸(TFA)/水、乙腈-水体系体系。试验表明，甲醇-三氟乙酸(TFA)/水不适用分析苯二氮杂卓类药物，甲醇-水体系当甲醇含量较低时色谱峰出现明显分叉，因此试验通过增加甲醇含量使样品中的各组分达到有效的分离。最终，V_甲醇：V_水＝50:50的流动相体系被用来分析三唑仑样品中的各组分，色谱图如图2所示。

2.3.4标准曲线和线性关系

用色谱甲醇稀释三唑仑标准储备液，精密配制成浓度分别为10、20、50、100、200、500、1000μg/mL的三唑仑对照品溶液，按的反相色谱条件测定，每个浓度重复3次，以平均值计算，记录三唑仑色谱峰面积，以对照品的进样浓度(μg/mL)为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标作图，并计算标准曲线的回归方程。

表1三唑仑的浓度与峰面积

以峰面积对浓度作图，标准曲线的回归方程为：

Y＝4×10⁷X+79945，R²＝0.9997

表明三唑仑在0.5--1000μg/mL的范围内线性关系良好。

2.3.5样品中三唑仑含量的测定

按反相色谱方法分析测定浓度为1.0mg/mL的三唑仑样品溶液，重复测定3次，记录三唑仑峰面积，计算其平均值，按峰面积外标法计算样品中的三唑仑含量。

表2样品中三唑仑含量的测定结果

由表2可知，通过峰面积外标法由标准曲线方程计算得到三唑仑样品中三唑仑的含量2.8wt％。

2.4高效液相色谱制备条件的优化

由于本实验中所采用的三唑仑片剂经过萃取处理后其中除主成分三唑仑外，仅含有较少量的杂质成分，因此在制备液相分离时我们利用甲醇-水体系，经过对不同比例甲醇含量下三唑仑收集馏分的纯度及回收情况考察，得到了良好的收集效果。制备液相色谱图如图3所示。

2.5三唑仑组分的进一步纯化

在样品中三唑仑是以其原体的形式存在的，经制备液相分离后馏分中仍以其原体形式存在，需经过进一步的纯化处理。经旋蒸后将馏分中的甲醇成分去除，冷冻干燥后即可获得三唑仑白色粉末。其HPLC色谱图如图4所示。经HPLC分析，峰面积归一化法测定百分含量，三唑仑含量99.88wt％。

2.6三唑仑标准物质的结构确证

2.6.1核磁法

为了确定制备液相分离所得到的化合物的结构，我们进行了核磁共振分析,谱图如图5、图6所示。

溶剂：CDCl₃

2.6.2红外光谱分析

在AVATAR 330FT-IR红外光谱仪(Thermo Nicolet公司)光上测定了三唑仑的红外光谱，如图7所示，结果与标准谱图完全一致。

2.6.3液相色谱-串联质谱联用分析

在Agilent LC-MS/MS 6410仪上测定了三唑仑的质谱。在ESI正离子模式下，碎裂电压135V，碰撞能量20eV，样品的质谱图如图8。

从质谱图中可以得到下列信息：

(1)准分子离子峰[M+H]⁺的m/z343.1，与三唑仑的相对分子质量342g/mol相差1，因而检测样品的分子量与三唑仑的相符。

(2)特征的[M+4+H]+和[M+2+H]+同位素峰(m/z347.1和345.1)且与[M+H]+的丰度比值约为1:6:9，说明三唑仑结构中含有两个Cl原子

(3)准分子离子峰[M+H]⁺m/z343.1与峰m/z308.1相差35，丢失的碎片可能是Cl。

2.7三唑仑标准物质的定值结果

经HPLC以及GC方法定值分析，三唑仑标准物质纯度为99.7wt％，扩展不确定度为0.10％(k＝2)。均匀性良好，稳定性至少1年以上。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (3)

1.用于法庭科学毒品检测的三唑仑标准物质的纯化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)检测缴获三唑仑样品中三唑仑的纯度，选择缴获三唑仑样品作为纯化制备三唑仑标准物质的原料；

(2)利用高效液相色谱制备三唑仑标准物质。

2.根据权利要求1所述的用于法庭科学毒品检测的三唑仑标准物质的纯化制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，包括如下步骤：

(1.1)样品溶液的制备：1.0mg三唑仑样品溶于1mL甲醇中，配成1.0mg/mL三唑仑样品溶液用于定性及定量分析，使用前样品溶液经过0.45μm微孔滤膜过滤；

(1.2)确定液相色谱条件：色谱柱为Shim-pack HRC-ODS柱,250mm×4.6mm I.D.，5μm；流动相为V_甲醇：V_水＝50:50，等度洗脱；紫外检测波长219nm；流速1.0mL/min；柱温35℃；

(1.3)计算标准曲线的回归方程及确定线性范围：用色谱甲醇稀释三唑仑标准储备液，精密配制成浓度分别为10、20、50、100、200、500、1000μg/mL的三唑仑对照品溶液，按步骤(1.2)中的反相色谱条件测定，每个浓度重复3次，以平均值计算，记录三唑仑色谱峰面积，以对照品的进样浓度为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标作图，并计算标准曲线的回归方程；以峰面积对浓度作图，标准曲线的回归方程为：

Y＝4×10⁷X+79945，R²＝0.9997

表明三唑仑在0.5--1000μg/mL的范围内线性关系良好；

(1.4)按步骤(1.2)中反相色谱方法分析测定样品浓度为1.0mg/mL的三唑仑样品溶液，重复测定3次，记录三唑仑峰面积，计算其平均值，按峰面积外标法计算样品中的三唑仑含量。

3.根据权利要求1所述的用于法庭科学毒品检测的三唑仑标准物质的纯化制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，包括如下步骤：

(2.1)样品溶液的制备：三唑仑片剂，粉碎，加甲醇充分浸泡，分离出甲醇液，离心浓缩至干，加甲醇定容至10mL；样品溶液均超声溶解5min，并经过0.45μm微孔滤膜过滤；

(2.2)确定液相色谱条件：色谱柱为Shim-pack VP-ODS制备柱，250mm×20mm I.D.，15μm；流动相为V_甲醇：V_水＝55:45，等度洗脱；紫外检测波长219nm；流速8mL/min；上样量700μL；柱温为室温；

(2.3)在样品中三唑仑是以其原体的形式存在的，经制备液相分离后馏分中仍以其原体形式存在，需经过进一步的纯化处理；经旋蒸后将馏分中的甲醇成分去除，冷冻干燥后即可获得三唑仑白色粉末。