CN107149671A

CN107149671A - 一种药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN107149671A
Application number: CN201610126296.0A
Authority: CN
Inventors: 郭文江
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-03-03
Filing date: 2016-03-03
Publication date: 2017-09-12
Anticipated expiration: 2036-03-03
Also published as: CN107149671B

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种药物组合物及其应用。一种药物组合物，主要由枯草颖肽素和核酸类物质组成，枯草颖肽素在组合物中的质量含量为0.01～98％。本发明将枯草颖肽素和核酸类物质配合使用发现，枯草颖肽素具有增强核酸类物质的活性的特点，两者相互配合，可以作为治疗癌症、病毒感染性疾病的药物，以及疫苗佐剂相关的药物，和/或其它药物、抗原或佐剂复配形成组合物用于治疗相关疾病达到更好的抗肿瘤和增强免疫的作用；并且与核酸类物质的配基相比，枯草颖肽素具有毒性小、效果明显的特点，说明本发明提供的药物组合物还具有毒性小、效果明显的特点。

Description

一种药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种药物组合物及其应用。

背景技术

1980年，Nusslein-Volhard等在研究果蝇胚胎发育过程中发现了Toll样受体基因[Nusslein-Volhard C,Wieschaus E.,Nature,1980,287(5785):795-801]，目前，在哺乳动物及人类中已经发现的人TIRs家族成员有11个。机体最强的抗原呈递细胞—树突细胞可表达TLR。借助TLR识别LPS、GpG-DNA、肽聚糖、脂蛋白以及分支杆菌的细胞壁成分等具有PAMP的分子，树突细胞被活化而成熟，提供获得性免疫的共刺激信号。因此TLR是微生物成分引起树突细胞活化的桥梁。Toll样受体对获得性免疫应答类型具有调控作用。多数TLRs活化后可以诱导抗微生物防御系统，产生IL-1β、IL-6和TNF以及趋化型细胞因子，从而调节机体Th1和Th2两种方面的平衡。

具体地说，TLR3、TLR7/TLR8、TLR9在病毒核酸成份的刺激下，诱导机体产生I型干扰素，后者发挥抗病毒免疫作用。TLR3受体的配基为dsRNA，具体为Poly IC，TLR7，TLR8的配基为ssRNA，TLR9的配基为单链DNA序列，包含有未甲基化的CpG序列。

TLR3可通过MyD88依赖途径诱导炎症性细胞因子如IL-1、TNF-α、IL-6和IL-12的表达，参与非特异性抗病毒反应，同时通过MyD88非依赖途径诱导共刺激分子CD80和CD86以及IFN-β、IP-10等抗病毒性细胞因子的表达，参与诱导DC的分化成熟以及抗病毒免疫反应[Doyle SE,O'Connell R,Vaidya SA,Chow EK,Yee K,Cheng G.Toll-like receptor 3mediates a more potent antiviral responsethan Toll-like receptor 4.J Immunol.2003；170(7):3565-71.]。TLR3在树突状细胞的某些亚群里表达，如单核细胞来源的树突状细胞，和T细胞或自然杀伤细胞，在某些上皮细胞中也有表达，并在头颈部鳞癌细胞中高表达，TLR3受体在不同细胞中的表达定位不一样，在人肺上皮细胞，头颈部鳞癌细胞，DC细胞中的TLR3受体只表达在细胞内部，所以它的配体外源性dsRNA(Poly IC)必须内在化后才能与Toll3受体作用[Muzio M,Bosisio D,Polentarutti N,et al JImmunol 2000,164(11):5998-6004]。

TLR9是治疗病毒感染、癌症、自身免疫性疾病等的一个有前景的药物靶点。TLR9存在于溶酶体的能识别细菌和病毒的未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸序列(UnmethylatedCpGdinucleotides，CpG—DNA)的免疫模式受体(Patternrecognitionrecep.tors，PRRs)，引起树突样细胞(DCs)、巨噬细胞和B淋巴细胞产生早期免疫反应。TLR9相关CpG序列寡DNA分为3种，A型，B型和C型，A型以含有CpG二核苷酸的回文序列为核心，两端为Poly G尾巴，这类CpG能够通过回文序列和Poly G形成高级结构，能够活化pDC(p lasmacytoid dendriticcell,浆细胞样树突状细胞)诱生大量的I型干扰素(IFN-α)，但对B细胞作用较弱。B型CpG-ODN以含有TCGTCG和GTCGTT为特点，对B细胞有很强的免疫刺激活性，但不能活化pDC。C型CpG序列功能处于两者之间，既能活化pDC又能活化B细胞。

各种各样的DNA和RNA，包括天然的或合成的CpG序列，PolyIC序列，容易在体内被各种核酸酶降解，且本身带有负电荷，难于达到位于细胞内的TLR3及TLR9。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种药物组合物，本发明经过大量试验发现，抗菌肽枯草颖肽素具有促进TLR3、TLR9配基免疫刺激功能的作用，包括其抗肿瘤、抗病毒、佐剂和免疫抑制治疗方面的功能；抗菌肽枯草颖肽素能和各种核酸序列相作用，包括人工合成任意分子量大小的核酸序列，单链核酸或双链核酸，人工合成的无化学修饰的核酸序列(由天然核苷酸组成)，人工合成的包含有非天然核苷酸的核酸序列，包括磷酸酯的硫代修饰，微生物中分离的基因组核酸，质粒核酸等，均可促进其免疫调节功能，促进其与TLR相互作用(包括促进作用和抑制作用)；应用动物免疫模型对枯草颖肽素样品进行了免疫学初步评价，发现实验样品枯草颖肽素具有较好的促进CpG序列的免疫调节作用。

本发明的第二目的在于提供所述的药物组合物的应用，该药物组合物可以与其他抗肿瘤活性成分、疫苗一起使用，其中，该药物组合物可以作为佐剂或者佐剂复合物中的成分使用；也可制成食品、饮料和保健品，用以治疗癌症、病毒感染性疾病以及提高免疫力。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种药物组合物，主要由枯草颖肽素和核酸类物质组成；

所述枯草颖肽素在所述组合物中的质量百分含量为0.01％～98％；

所述枯草颖肽素的结构如下所示：

其中，N为半胱氨酸、丝氨酸、天冬酰胺中的任一种；R为单糖结构或二糖结构；

第1，2，3，5，8，9，10，12，15，17，18，20，21，23，25，26，27，28位的氨基酸分别为Gly，Ala，Ile，Leu，Val五种脂肪族氨基酸中的任一种。

枯草颖肽素有两个二硫键，拥有一个糖结构的化合物或类似化合物，类似化合物包括非关键氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸的替代、修饰、缺失和增加，以及单糖结构的替代、修饰、缺失和增加，也包括在多肽链或糖上耦联其它化学结构单元形成的衍生物。

枯草颖肽素在治疗病毒性肝炎、保肝护肝具有非常好的效果；具有非常好的调节免疫的功能；还可以应用于食品、饮料和保健品中，能很好的增强人体体质，提高人体免疫机能；还可以作为佐剂在病毒灭活疫苗、基因重组疫苗、多糖结合疫苗中应用，很好的增强了各疫苗的免疫作用。本发明将枯草颖肽素和核酸类物质配合使用发现，枯草颖肽素具有增强核酸类物质的活性的特点，两者相互配合，可以作为治疗癌症、病毒感染性疾病的药物，以及疫苗佐剂相关的药物，和/或其它药物、抗原或佐剂复配形成组合物用于治疗相关疾病达到更好的抗肿瘤和增强免疫的作用；并且与核酸类物质的配基相比，枯草颖肽素具有毒性小、效果明显的特点，说明本发明提供的药物组合物还具有毒性小、效果明显的特点。

另外，枯草颖肽素在药物组合物中的质量百分含量可以为0.01～98％中的任意点值。如枯草颖肽素在药物组合物中的质量百分含量可以为0.01％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、50％、60％、70％、90％、98％等等。

进一步地，R为葡萄糖、半乳糖、乳糖中的任一种。

对枯草颖肽素的结构进行举例说明，其中，第三位为甘氨酸，第22位为半胱氨酸，R为葡萄糖的结构如图1所示；第三位为丙氨酸，第22位为半胱氨酸，R为葡萄糖的结构如图2所示；第三位为甘氨酸，第22位为苏氨酸，R为葡萄糖的结构如图3所示；第三位为甘氨酸，第22位为天冬酰胺，R为葡萄糖的结构如图4所示；第三位为甘氨酸，第22位为半胱氨酸，R为乳糖的结构如图5所示。

进一步地，第37位精氨酸后还包括一个甘氨酸。其中的一种结构如图6所示。

将枯草颖肽素与核酸类物质以一定的比例配合使用，两者协同作用增强，达到更好的抗肿瘤和提高免疫活性的作用。优选地，所述枯草颖肽素与所述核酸类物质的质量比为3-8:1。更优选地，所述枯草颖肽素与所述核酸类物质的质量比为4-5:1。

本发明将枯草颖肽素和核酸类物质配合使用发现，枯草颖肽素具有促进TLR配基核酸作用强度的特点，与其它化学修饰的TLR3和TLR9配基相比，枯草颖肽素具有毒性小、效果明显的特点。枯草颖肽素和TLR9配基CpG序列作用，形成免疫复合物，促进CpG序列原有刺激功能的提高，该发明通过动物实验证实了枯草颖肽素与核酸复合制成的佐剂可作为粘膜佐剂对流感疫苗、乙肝疫苗、Hib结合疫苗以及肺炎结合疫苗的注射剂型均有免疫增强作用；通过实验证明其可以通过增强CpG序列的功能而产生抗肿瘤的作用，抗病毒的作用也由于复合佐剂的添加而增强；通过实验证实枯草颖肽素与核酸复合制成的佐剂能够和TLR3激动剂单链IC序列相互作用，能够起到提高其免疫佐剂效果的作用。进一步地，所述核酸类物质包括聚肌胞、CpG寡核苷酸、TLR9激动剂单链IC序列、TLR9抑制序列中的任一种或多种。

本发明应用细胞及动物模型对枯草颖肽素样品体内外药效学初步评价，发现实验样品枯草颖肽素具有较好的促进TLR3和TLR9配体活性的功能，其具体序列包括但不仅包括：CpG寡核苷酸：如SEQ ID No.1所示的核酸序列CpG2006、如SEQ ID No.2所示的核酸序列CpG2007、如SEQ ID No.3所示的核酸序列CpG2135、如SEQ ID No.4所示的核酸序列CpG2142、如SEQ ID No.5所示的核酸序列CpG2216、如SEQ ID No.6所示的核酸序列CpG1826、如SEQ ID No.7所示的核酸序列CpG10104、如SEQ ID No.8所示的核酸序列CpG SD-101以及如SEQ ID No.9所示的核酸序列CpG序列M362；

如SEQ ID No.10所示的TLR9激动剂单链IC序列，如SEQ IDNo.11所示的TLR9抑制序列。

本发明还提供了所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

枯草颖肽素和核酸类物质配合使用具有一定的抗肿瘤效果，但与抗肿瘤活性成分配合使用效果更佳。进一步地，所述药物组合物还包括抗肿瘤活性成分。即所述治疗肿瘤的药物包括枯草颖肽素、核酸类物质和抗肿瘤活性成分。其中，抗肿瘤活性成分的使用量按照正常的使用量、或者减量或者遵医嘱托使用即可，而枯草颖肽素和核酸类物质则作为佐剂使用，使用量按照现有的佐剂的规定使用量使用即可，一般在动物中的使用量为0.1-1mg/kg，如在小鼠中的使用量一般为1mg/kg，在大鼠和禽类中的使用量为0.1mg/kg。

肿瘤的治疗方法，包括给予受试者有效量的抗肿瘤活性成分以及枯草颖肽素和核酸类物质。

给药方式可以为口服、静脉注射或者是透皮渗透方式，施加于需要治疗的患者，具体可根据病人的病情、年龄等，由医师决定。

根据临床的要求，药物组合物可制成各种剂型。进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

进一步地，所述药学可接受的辅料包括稀释剂、赋形剂、崩解剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活化剂、稳定剂中的任一种或多种组合。

进一步地，所述药物的剂型包括注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂中的任一种。

本发明提供的药物组合物的剂型按照本领域的常规方法制备即可。

进一步地，所述肿瘤为黑色素瘤、结肠癌及肺癌中的任一种。

如本发明提供的药物组合物用于治疗黑色素瘤，药物组合物还包括治疗黑色素瘤的活性成分，如顺铂；如本发明提供的药物组合物用于治疗结肠癌，药物组合物还包括治疗结肠癌的活性成分，如阿霉素；如本发明提供的药物组合物用于治疗肺癌，药物组合物还包括治疗肺癌的活性成分，如环磷酰胺。

本发明还提供了所述的药物组合物作为疫苗佐剂的应用。该药物组合物可作为佐剂或佐剂复合物的成分在各种疫苗如病毒灭活疫苗、基因重组疫苗、多糖结合疫苗中使用。

疫苗佐剂分为粘膜免疫佐剂和注射用佐剂。本发明提供的药物组合物作为粘膜佐剂和注射用佐剂使用，均具有促进流感病毒、重组乙肝病毒等病毒类疫苗的注射免疫效果以及促进肺炎结合疫苗、b型流感嗜血杆菌等多糖结合疫苗的注射免疫效果。

进一步地，所述疫苗为流感疫苗、乙肝疫苗、Hib结合疫苗以及肺炎结合疫苗中的任一种。

其中，疫苗的使用量按照正常的使用量、或者减量或者遵医嘱托使用即可，而枯草颖肽素和核酸类物质则作为佐剂使用，使用量按照现有的佐剂的规定使用量使用即可，一般在动物中的使用量为0.1-1mg/kg，如在小鼠中的使用量一般为1mg/kg，在大鼠和禽类中的使用量为0.1mg/kg。

本发明提供的药物组合物还可以用于制备治疗免疫缺陷性疾病的药物，或与其它药物复配用于治疗免疫缺陷疾病的组合物。

本发明还提供了所述的药物组合物在食品、饮料和保健品中的应用。即本发明提供的药物组合物可以添加到面粉中做成各种糕点或面食，或是制成其他的食品；也可以添加各种饮品中制成各种饮料；也可以通过添加一些辅料单独制成保健品，也可以与其他具有保健作用的材料混合一起制成保健品。食用添加有本发明提供的药物组合物的食品、饮料和保健品，能很好的增强人体体质，提高人体免疫机能。

优选地，所述枯草颖肽素的纯度大于等于98％。比如枯草颖肽素的纯度可以为98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％等等。该纯度的枯草颖肽素含有的杂质少，药效好。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了枯草颖肽素和核酸类物质配合使用，达到更好的抗肿瘤以及提高免疫力的功效。

(2)本发明还提供了药物组合物中枯草颖肽素和核酸类物质的配比关系，以达到更好的抗肿瘤和提高免疫活性的作用。

(3)本发明还提供了核酸类物质的种类，经试验验证，均达到了更显著的抗肿瘤和提高免疫活性的效果。

(4)本发明还提供了枯草颖肽素和核酸类物质组成的组合物在抗肿瘤药物以及作为疫苗佐剂方面的应用。

(5)本发明提供的药物组合物还可以应用于食品、饮料和保健品中，能很好的增强人体体质，提高人体免疫机能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明提供的一种枯草颖肽素的结构图；

图2为本发明提供的另一种枯草颖肽素的结构图；

图3为本发明提供的另一种枯草颖肽素的结构图；

图4为本发明提供的另一种枯草颖肽素的结构图；

图5为本发明提供的另一种枯草颖肽素的结构图；

图6为本发明提供的另一种枯草颖肽素的结构图；

图7为本发明实施例1制得的枯草颖肽素纯品HPLC色谱图；

图8为本发明实施例1制得的枯草颖肽素纯品质谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

样品枯草颖肽素的纯化实验及纯度检测

1.1发酵液的制备

菌种为枯草芽孢杆菌B.subtilis CVCC20076，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；将接种于固体培养基上，培养至菌苔铺满培养基表面为第1代；刮取菌苔接种至液体培养基中，摇床振荡培养至菌液为第2代；将其接种至种子罐，搅拌培养至生产用种子为第3代，将生产用种子接种至培养罐，搅拌培养收获发酵液200L。

1.2纯化步骤及结果

离心并过滤：将发酵液在4℃下置于离心机上离心，10000r/min离心15min，获得上清液，弃除沉淀。

阴离子交换层析：将上清液用0.45μm陶瓷滤芯过滤以去除芽孢，得到滤液；然后滤液经20mmol/L Tris-HCl，pH 9.0缓冲液平衡好的阴离子层析柱(16×300mm)层析，收集穿透峰，得到样品溶液。

疏水层析：疏水层析柱(16×300mm)用20mmol/L Tris-HCl、1mol/L(NH₄)₂SO₄，pH 8.0的缓冲液平衡。样品溶液中先加硫酸铵至浓度为1mol/L，上样后先用平衡缓冲液洗脱未吸附蛋白，洗至基线后，再分别用含0.9、0.6、0.3、0.1、0mol/L的(NH₄)₂SO₄的20mmol/LTris-HCl，pH 8.0的缓冲液梯度洗脱，流速为2ml/min。收集活性部分，超滤浓缩。

阳离子交换层析：阳离子交换柱(16×300mm)用20mmol/LTris-HCl，pH 7.6的缓冲液平衡。上样后先用平衡缓冲液洗脱未吸附蛋白，洗至基线后再用不同NaCl浓度的20mmol/L Tris-HCl，pH7.6缓冲液梯度洗脱，流速3ml/min，收集活性部分，得到收获液。

超滤、除菌、冻干并进行纯度检测：将收获液用1KD膜包超滤，使用10倍注射用水换液，之后用0.2μm孔径的除菌滤膜进行除菌过滤并进行冻干处理，得到枯草颖肽素纯化纯品。

将纯化纯品经LC-MS检测，具体实验条件如下所示，层析柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD 1.8μm，2.1*150mm；柱温：60℃，检测波长215nm，流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.085％甲酸+20％水+80％乙腈。得到枯草颖肽素的HPLC色谱图和枯草颖肽素的质谱图，分别如图1和图2所示。

从图1可以看出，枯草颖肽素的纯化纯品经LC-MS检测达到99％以上。图8得到的图谱鉴定得到枯草颖肽素的结构如图1所示。

实施例2

枯草颖肽素和核酸类物质共同作用体内抗肿瘤活性实验

2.1实验仪器及实验动物

电子天平(上海精密科学仪器，JA1003N)、小鼠秤(上海友声衡器有限公司，ASC-A)、血细胞分析仪(BT2000-PLUS)、小鼠灌胃管等。

C57BL/6，Balb/c小鼠，全雌；等级SPF级；周龄：5-7周；体重：实验开始时体重均数18.0～25.0g；来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司(SLAC)。

2.2实验动物的分组及模型建立

首先根据体重随机分为模型对照组、阳性药组、枯草颖肽素组、核酸组、枯草颖肽素核酸复合配方组、联合给药组，每组8只。

模型建立：取各种肿瘤细胞用生理盐水1：3稀释制成细胞悬液，分别取生长良好的B16-F10黑色素瘤细胞悬液接种于C57BL/6雌性小鼠、CT-26结肠癌细胞悬液接种于Balb/c雌性小鼠及LLC1肺癌细胞悬液接种于C57BL/6雌性小鼠，接种方式为小鼠右腋皮下0.2ml，接种量为：含瘤细胞2×10⁶。

2.3给药剂量

模型对照组：生理盐水，给药容积为0.1ml·10g^-1d^-1；

阳性药组：

顺铂(5mg·kg^-1·d^-1)；环磷酰胺(5mg·kg^-1·d^-1)；阿霉素(2mg·kg^-1·d^-1)；

枯草颖肽素组(GL-01)：10mg·kg^-1·每次；核酸组：均2.5mg·kg^-1·每次，分别使用两种核酸：CpG2006和CpG1826；

枯草颖肽素核酸复合配方组：枯草颖肽素和两种核酸联合使用，枯草颖肽素和核酸按照5:1的比例混合，所用剂量与单独用枯草颖肽素组和核酸组相同；

联合给药组：与阳性药组等剂量阳性药+枯草颖肽素核酸复合配方组剂量相同，每周称两次体重，给药量根据最新体重计算。

2.4用药期限

B16-F10黑色素瘤、CT-26结肠癌及LLC1肺癌接种0天后给药，每种肿瘤均给药15天。

2.5给药频率

阳性药每天给药一次，为腹腔给药；核酸、枯草颖肽素、复合配方组及联合给药组中的核酸及枯草颖肽素每三天给药一次，为皮下给药。

2.6检测指标：小鼠体重，称瘤重，计算抑瘤率，抑瘤率计算公式为：(模型对照组肿瘤重量-实验组肿瘤重量)/模型对照组肿瘤重量×100％。

2.7数据统计处理方法：数据使用表示，数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA法检验)，组间用LSD法两两比较，检验水准α＝0.05。具体结果如表1-3所示。

表1B16-F10各组小鼠瘤重及抑瘤率(n＝6)

表2CT-26各组小鼠瘤重及抑瘤率(n＝6)

表3 3LL组小鼠瘤重及抑瘤率(n＝6)

从表1的B16-F10荷瘤小鼠中可以看出，枯草颖肽素核酸复合配方组和联合给药组的抑瘤效果明显高于各个单独用药组，说明联合用药有更大的优势。同样地，从表2的CT-26荷瘤小鼠中可以看出，枯草颖肽素核酸复合配方组和联合给药组的抑瘤效果明显高于各个单独用药组，说明联合用药有更大的优势。同样地，从表3的3LL荷瘤小鼠中可以看出，枯草颖肽素核酸复合配方组和联合给药组的抑瘤效果明显高于各个单独用药组，说明联合用药有更大的优势。因此，从表1-3可以看出，在所有的荷瘤小鼠模型中，抗菌肽均能促进核酸的抑瘤作用，并且添加现有的阳性药物抑瘤效果更佳。

实施例3

枯草颖肽素和核酸类物质共同作为疫苗佐剂在重组乙肝疫苗方面的应用

3.1材料

重组酵母乙肝疫苗，深圳康泰，批号c201301003；小鼠乙肝病毒抗体(HBVAb)ELISA检测试剂盒。

3.2实验动物

清洁级Balb/c小鼠，雌性小鼠，6-8周龄，体重18-22g。

3.3主要试剂

枯草颖肽素、CpG2006、聚肌胞(购自杭州美亚药业有限公司)。

3.4动物分组及免疫检测

小鼠随机分为6组，每组10只，分组情况如下：1.生理盐水对照；2.重组HBsAg蛋白疫苗；3.重组HBsAg蛋白疫苗60μg+CpG2006(5μg)；4.重组HBsAg蛋白疫苗60μg+聚肌胞(5μg)；5.重组HBsAg蛋白疫苗60μg+枯草颖肽素(25μg)；6.重组HBsAg蛋白疫苗60μg+CpG2006(5μg)+枯草颖肽素(25μg)；7.重组HBsAg蛋白疫苗60μg+聚肌胞(5μg)+枯草颖肽素(25μg)；8.重组HBsAg蛋白疫苗60μg+CpG2006(5μg)+聚肌胞(5μg)+枯草颖肽素(25μg)。其中各组的有效成分标注用量为1剂用量，每次注射1剂。接种途径：由左后肢腓肠肌或胫前肌注射，每只免疫200μl。第0天、14天和21天各免疫一次，末次免疫后1周尾静脉采血分离血清，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒进行乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)检测，并解剖小鼠，分离出血清，进行酶联免疫吸附试验(ELISA)，具体按照试剂盒说明书操作进行。

ELISA法定量检测免疫后小鼠血清中HBs IgG抗体的含量，结果如表4所示。

表4分组情况及检测结果

从表4可以看出，枯草颖肽素能够显著促进核酸类物质作为佐剂的免疫增强效果。

实施例4

枯草颖肽素和核酸类物质联用对禽流感疫苗的免疫增强作用

4.1材料

4.1.1疫苗：H9亚型禽流感病毒灭活疫苗

4.1.2实验动物：15日龄海兰褐小公鸡210只。

4.1.3主要试剂：枯草颖肽素、CpG2006、聚肌胞和灭活禽流感H9抗原。

4.2动物分组及免疫检测

15日龄海兰褐小公鸡210只随机分为6组，每组35只，按常规方法饲养。28日龄时，进行以下处理：1.生理盐水对照；2.重组禽流感灭活疫苗；3.重组禽流感灭活疫苗0.5ml+CpG2006(5μg)；4.重组禽流感灭活疫苗0.5ml+枯草颖肽素(25μg)；5.重组禽流感灭活疫苗0.5ml+CpG2006(5μg)+枯草颖肽素(25μg)；6.重组禽流感灭活疫苗0.5ml+聚肌胞(5μg)+枯草颖肽素(25μg)；7.重组禽流感灭活疫苗0.5ml+聚肌胞(5μg)+枯草颖肽素(25μg)；8.重组禽流感灭活疫苗0.5ml+CpG2006(5μg)+聚肌胞(5μg)+枯草颖肽素(25μg)。其中各组的有效成分标注用量为1剂用量，每次注射1剂，共免疫一次。

免疫后第三周翅静脉采血分离血清进行抗体滴度检测，具体步骤如下：

用微量血凝与血凝抑制法，在微量血凝板上倍比稀释病毒液，加入等量的1％红细胞，以红细胞凝集50％的最高稀释度，作为判断血凝价的终点；

计算4单位抗原稀释倍数，将病毒液稀释为4单位血凝价；

待检血清在微量血凝板上作倍比稀释，每孔加入等量含4单位血凝价的病毒液，震荡混匀并静置3-5分钟后，每孔加入等量1％红细胞悬液，震荡混匀，室温放置30min左右观察结果。以完全抑制红细胞凝集的血清稀释度作为判断终点。

具体的分组情况以及测定的滴度结果见表5。

表5分组状况和滴度结果

从表5可以看出，枯草颖肽素能够显著促进核酸类物质作为佐剂的免疫增强效果。

实施例5

抗菌肽作为6B型肺炎结合疫苗注射剂型的免疫增强作用

5.1材料

5.1.1疫苗：6B型肺炎链球菌多糖结合疫苗。

5.1.2实验动物：清洁级SD雌性大鼠，5-7周龄，体重150-250g。

5.1.3主要试剂：枯草颖肽素佐剂和磷酸铝佐剂(浓度均为1mg/ml)。

5.2动物分组及免疫检测

大鼠随机分为3组，每组10只，分组情况如下：1.生理盐水组；2.6B型肺炎结合疫苗(15μg)；3.6B型肺炎结合疫苗15μg+CpG2006(5μg)；4.6B型肺炎结合疫苗15μg+聚肌胞(5μg)；5.6B型肺炎结合疫苗(15μg)+枯草颖肽素(25μg)；6.6B型肺炎结合疫苗(15μg+CpG2006(5μg)+枯草颖肽素(25μg)；7.6B型肺炎结合疫苗(15μg)+聚肌胞(5μg)+枯草颖肽素(25μg)；8.6B型肺炎结合疫苗(15μg)+CpG2006(5μg)+聚肌胞(5μg)+枯草颖肽素(25μg)。其中各组的有效成分标注用量为1剂用量，每次注射1剂。分别于0天和7天腹腔注射免疫2次，21天采血，收集血清，用ELISA方法检测小鼠血清中的抗肺炎球菌荚膜多糖IgG抗体效价。

分组情况以及抗肺炎球菌荚膜多糖IgG抗体效价结果如表6所示。

表6不同组别抗肺炎小鼠球菌荚膜多糖IgG抗体效价结果

从表6可以看出，枯草颖肽素能够显著促进核酸类物质作为佐剂的免疫增强效果。

实施例6

枯草颖肽素体内抗DHBV活性研究

6.1实验药物：枯草颖肽素；拉米夫定(3TC)：购于葛兰素史。克制药(苏州)有限公司。

6.2实验动物：1日龄河南省樱桃谷鸭，雌雄不拘，体重50±5g。

6.3樱桃谷鸭感染DHBV动物模型的建立

1-3日龄樱桃谷鸭100只，通过普通PCR方法筛选出先天DHBV阴性，选择体况良好基本一致的樱桃谷鸭供实验用。

选用3日龄体况良好的阴性鸭90只经胫静脉注射DHBV阳性鸭血清0.2ml(Srivastav et al.,2010)。感染后7天经胫静脉采血，分离血清，PCR方法筛选DHBV阳性鸭用于实验。

6.4动物的分组与给药

取DHBV阳性鸭80只，随机分为5组，每组16只。分别为：1.生理盐水组；2.拉米夫定组(5mg/kg/d)；3.CpG2216(50μg)组；4.聚肌胞(50μg)组；5.枯草颖肽素(250μg)组；6.CpG2216(50μg)+枯草颖肽素(250μg)复合免疫增加剂组；7.枯草颖肽素(250μg)+聚肌胞(50μg)复合免疫增强剂组；8.CpG2216(50μg)+聚肌胞(50μg)+枯草颖肽素(250μg)复合免疫增强剂组。其中各组的有效成分标注用量为1剂用量，每次注射1剂。

以上各组均在相同饲养条件下饲养，试验所有给药组按照各组剂量每天同一时间于饲喂前根据体重，拉米夫定经口腔灌服给药，其它经肌肉注射给药，共给药15天。分组情况如表7所示。

表7实验分组情况

在用药第5天(T5)，用药第10天(T10)，用药第15天(T15)和停药后第3天(P3)，以无菌操作方法从颈静脉采血，每次每组各采4只；分离血清，将血清置于-70℃待检。用已建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测DHBV方法检测各样品DHBV DNA含量，用已建立的ELISA方法检测血清中DHBsAg含量。

根据公式计算每组鸭用药后不同时间(T5、T10、T15、P3)血清和肝脏中DHBV DNA的抑制率和拷贝数，比较各组鸭血清DHBVDNA的动态变化，结果如表8所示。同时检测样品在用药各个时期血清中DHBsAg滴度变化，结果如表9所示。

表8各实验组鸭不同时间血清中DHBV-DNA抑制效果

和对照组相比，*P<0.05，**P<0.01

表9各实验组鸭不同时间血清中DHBsAg抑制效果

采用FQ-PCR方法检测各个时间段每组鸭血清中DHBV DNA含量，结果如表8显示：模型组鸭血清中DHBV DNA含量水平较高，各用药组和模型组相比DHBV DNA含量均有下降，其中CpG2216(50μg)+聚肌胞(50μg)+枯草颖肽素(250μg)复合免疫增强剂组组鸭DHBV DNA水平显著降低。

采用ELISA方法检测各个时间段每组鸭血清中DHBsAg含量，结果如表9显示：模型组鸭血清中DHBsAg含量水平较高，各用药组和模型组相比DHBsAg含量均有下降，其中CpG2216(50μg)+聚肌胞(50μg)+枯草颖肽素(250μg)复合免疫增强剂组鸭DHBsAg水平显著降低。

本发明还将枯草颖肽素与其他CpG寡核苷酸如CpG2007、CpG2135、CpG2142、CpG2216、CpG10104、CpG SD-101、CpG序列M362以及TLR9激动剂单链IC序列和TLR9抑制序列进行配合使用，特别是与相应的抗肿瘤活性成分或者相应的疫苗配合使用，达到了非常好的抗肿瘤、增强免疫活性的功效。

此外，本发明还将实施例1中得到的枯草颖肽素结构进行了改进，采用Fmoc固相合成法合成了如图1-6所示的结构以及将图1中的葡萄糖替换为半乳糖，同时进行了如实施例2-6的验证，结果同实施例1中得到的枯草颖肽素的效果一致。

进一步地，本发明采用Fmoc固相合成法还合成了如下结构：将图1中的第1，2，3，5，8，9，10，12，15，17，18，20，21，23，25，26，27，28位的氨基酸替代为Gly，Ala，Ile，Leu，Val五种脂肪族氨基酸中的任一种得到的枯草颖肽素结构，同时进行了如实施例2-6的验证，结果同实施例1中得到的枯草颖肽素的效果一致。

另外，本发明还将实施例2-6中的枯草颖肽素与所述核酸类物质的质量比替换为3:1、4:1、6:1、、8:1等等，其中仍以5:1效果更佳，其他结果比5:1略差。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种药物组合物，其特征在于，主要由枯草颖肽素和核酸类物质组成；

所述枯草颖肽素在所述药物组合物中的质量百分含量为0.01％～98％；

所述枯草颖肽素的结构如下所示：

第1，2，3，5，8，9，10，12，15，17，18，20，21，23，25，26，27，28位的氨基酸为分别Gly，Ala，Ile，Leu，Val五种脂肪族氨基酸中的任一种。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，R为葡萄糖、半乳糖、乳糖中的任一种；

第37位精氨酸后还优选包括一个甘氨酸。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述枯草颖肽素与所述核酸类物质的质量比为3-8:1；优选为4-5:1。

4.根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述核酸类物质包括聚肌胞、CpG寡核苷酸、TLR9激动剂单链IC序列、TLR9抑制序列中的任一种或多种。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述CpG寡核苷酸包括：如SEQ ID No.1所示的核酸序列CpG2006、如SEQID No.2所示的核酸序列CpG2007、如SEQ ID No.3所示的核酸序列CpG2135、如SEQ ID No.4所示的核酸序列CpG2142、如SEQ IDNo.5所示的核酸序列CpG2216、如SEQ ID No.6所示的核酸序列CpG1826、如SEQ ID No.7所示的核酸序列CpG10104、如SEQ IDNo.8所示的核酸序列CpG SD-101以及如SEQ ID No.9所示的核酸序列CpG序列M362；

所述TLR9激动剂单链IC序列如SEQ ID No.10所示，所述TLR9抑制序列如SEQ ID No.11所示。

6.权利要求1-5任一项所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述治疗肿瘤的药物包括枯草颖肽素、核酸类物质和抗肿瘤活性成分；

所述肿瘤优选为黑色素瘤、结肠癌及肺癌中的任一种。

8.权利要求1-5任一项所述的药物组合物作为疫苗佐剂的应用。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述疫苗为流感疫苗、乙肝疫苗、Hib结合疫苗以及肺炎结合疫苗中的任一种。

10.权利要求1-5任一项所述的药物组合物在食品、饮料和保健品中的应用。