实施例:
该实施例合成通式如式Ⅱ所示的化合物:
其中:R=3-F,2-CN,3-PhO,3-CF3,2-NO2,4-NO2,2-OCH3,4-SCH3。
合成方法为:
A:在250mL三口烧瓶中将适量的4-羟基香豆素,丙二腈和不同取代基的芳香醛按照1:1:1摩尔混合后加热至溶解;
B:加入催化量的4-二甲氨基吡啶,加热回流3-4小时;
C:冷却后固体析出,抽滤,固体再用无水乙醇重结晶,最终得纯品。
结构鉴定:
利用质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)、红外吸收光谱(IR)和紫外吸收光谱(UV)等有机波谱,对上述合成的系列新型吡喃类化合物进行分子量、结构和纯度等鉴定。
鉴定结果为:
化合物1:
2-Amino-4-(3-fluorophenyl)-3-cyano-5-oxo-4H,5H-pyrano[3,2c]chromene:
1H NMR(DMSO-d6,δ,ppm):7.893-7.916(q,1H),7.707-7.751(m,1H),7.465-7.524(m,4H),7.340-7.395(m,1H),7.081-7.146(m,3H),4.522(s,1H).
化合物2:
2-Amino-4-(2-cyanophenyl)-3-cyano-5-oxo-4H,5H-pyrano[3,2c]chromene:
1H NMR(DMSO-d6,δ,ppm):7.908-7.931(q,1H),7.814-7.836(q,1H),7.728-7.771(m,1H),7.642-7.683(m,1H),7.451-7.584(m,6H),4.822(s,1H).
化合物3:
2-Amino-4-(3-phenoxyphenyl)-3-cyano-5-oxo-4H,5H-pyrano[3,2c]chromene:
1H NMR(DMSO-d6,δ,ppm):7.879-7.899(d,1H),7.707-7.747(t,1H),7.451-7.519(m,4H),7.300-7.392(m,3H),7.112-7.149(t,1H),6.978-7.041(m,4H),6.821-6.841(d,1H),4.477(s,1H).
化合物4:
2-Amino-4-(3-trifluoromethylphenyl)-3-cyano-5-oxo-4H,5H-pyrano[3,2c]chromene:
1H NMR(DMSO-d6,δ,ppm):7.902-7.926(q,1H),7.713-7.756(m,1H),7.467-7.659(m,8H),4.654(s,1H).
化合物5:
2-Amino-4-(2-nitrophenyl)-3-cyano-5-oxo-4H,5H-pyrano[3,2c]chromene:
1H NMR(DMSO-d6,δ,ppm):7.898-7.917(d,2H),7.707-7.750(m,1H),7.641-7.679(q,1H),7.588(s,2H),7.456-7.562(m,4H),5.248(s,1H)
化合物6:
2-Amino-4-(4-nitrophenyl)-3-cyano-5-oxo-4H,5H-pyrano[3,2c]chromene:
1H NMR(DMSO-d6,δ,ppm):8.175-8.196(d,2H),7.910-7.933(q,1H),7.723-7.766(m,1H),7.475-7.611(m,6H),4.682(s,1H).
化合物7:
2-Amino-4-(3-methoxyphenyl)-3-cyano-5-oxo-4H,5H-pyrano[3,2c]chromene:
1H NMR(DMSO-d6,δ,ppm):7.890-7.913(q,1H),7.697-7.736(q,1H),7.424-7.516(m,4H),7.219-7.259(t,1H),6.800-6.841(q,3H),4.432(s,1H),3.726(s,3H).
化合物8:
2-Amino-4-(4-methylsulfanylphenyl)-3-cyano-5-oxo-4H,5H-pyrano[3,2c]chromene:
1H NMR(DMSO-d6,δ,ppm):7.889-7.913(q,1H),7.701-7.744(m,1H),7.427-7.521(m,4H),7.204(s,4H),4.425(s,1H),2.451(s,3H).
实施例合成化合物体外抗金黄色葡萄球菌生物膜活性的测定:
试验中所用金黄色葡萄球菌菌株来自美国模式培养物研究所(American TypeCulture Collection,ATCC)。
(1)结晶紫染色实验过程如下:
A:分别从划线培养的M-H琼脂培养基上挑取不同实验菌株的单克隆菌落,接种于4mL的TSB培养基中,以220r/min,37℃的条件培养至对数生长期。
B:在96孔板每孔中加入100μl的M-H肉汤培养基,吸取100μl的菌液加入第1孔中吹打混匀后吸取100μl加入第2孔中,依次类推,最后1孔混匀后吸取100μl弃去。
C:在酶标仪上选定630nm检测,记录OD630值为0.1时菌液所稀释的倍数(此时菌液浓度约为108CFU/mL),将菌液用含2%葡萄糖的TSB培养基稀释至相对应的倍数后再按1:100的比例向菌液稀释至106CFU/mL。
D:向96孔板每孔分别加入TSB溶解的浓度为4μg/mL上述各化合物100μL后,加入已制备的浓度为106CFU/mL的菌液100μL,取一排孔加入200μL含2%葡萄糖的TSB培养基作为空白对照,将96孔板放入37℃孵箱恒温孵育24h。
E:吸去上清,用0.01M的PBS洗三遍,每孔加入150μl甲醇固定30min,轻柔弃去甲醇,加入150μl 1%的结晶紫溶液染色15min。
F:轻柔吸去结晶紫溶液,用0.01M的PBS轻洗3遍,放入烘箱烘干,每孔加入33%冰醋酸溶液150μl,使用酶标仪在630nm处测吸光度。
将没有经过化合物处理的细菌作为空白对照组(Control),和对照组相比,化合物4在浓度为4μg/mL时,对生物膜的形成具有显著的抑制作用(**P<0.01),如图9所示。
(2)荧光染色实验过程如下:
A:取指数生长期耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)USA300,用含有0.5%葡萄糖的TSB培养基稀释后接种到24孔板,每孔1ml。
B:向24孔板每孔中加入2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml的化合物4,对照孔不加化合物,培养24h。
C:向每孔中加入10mg/ml异硫氰酸荧光素(FITC)染料孵育细菌2h,离心后弃上清液,用PBS缓冲液漂洗细菌3次。
D:荧光显微镜488mm波长处观察细菌生物膜的形态。
和空白对照组相比,化合物4呈浓度依赖性抑制生物膜的形成,如图10所示。A:空白对照组,B:2μg/ml化合物4处理组,C:4μg/ml化合物4处理组,D:8μg/ml化合物4处理组。