CN107110842A - 确定溶剂校正曲线的方法 - Google Patents

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Abstract

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于建立溶剂校正曲线以及使用所述曲线来从分析物的传感图获得校正的传感图或校正的报告点的方法。在另一个实施方案中，本发明提供用于研究分子相互作用的分析系统，其包含包括用于执行所述方法的步骤的程序代码装置的计算机处理装置。还提供用于执行所述方法的步骤的包含存储在计算机可读介质上或承载在电信号或光信号上的程序代码装置的计算机程序产品。

Description

确定溶剂校正曲线的方法
发明领域
本发明涉及用于调节有效(active)和参考检测表面之间的主体信号失配的方法。更具体地说，本发明涉及用于建立溶剂校正曲线以及使用所述曲线从分析物的传感图获得校正的传感图或校正的报告点的方法。本发明还涉及用于执行所述方法的步骤的分析系统和计算机程序产品。
发明背景
能够实时监测分子相互作用的分析传感器系统(即，无标签系统)正受到越来越多的关注。这些系统经常基于光学生物传感器，且通常被称作相互作用分析传感器或生物特异性相互作用分析传感器。代表性生物传感器系统是由GE Healthcare Life Sciences销售的Biacore®仪器，其使用表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)来检测样品中的分子与固定在传感表面上的分子结构之间的相互作用。使用Biacore®系统，有可能在不使用标记的情况下实时确定样品中的具体分子的存在和浓度以及附加的相互作用参数，例如分子相互作用的缔合速率常数和解离速率常数。该装置和理论背景在文献(参见例如，Jonsson，U.等人，BioTechniques 11：620-627(1991))中充分描述。通常，该技术涉及将配体固定到传感器芯片(流动池)的特殊光学传感器表面，使传感器芯片与含有感兴趣的分析物的样品流接触，和随后测量由配体和分析物之间的结合引起的传感器芯片的表面光学特性中的变化。有关SPR的更多细节，还参考美国专利No. 5,313,264、美国专利No. 5,573,956和美国专利No. 5,641,640。
当用弱疏水的分析物分子运行测定时，可能需要在流动缓冲液和样品中包含有机溶剂。对于较小的有机分子分析物(80-1000Da)，通常使用有机溶剂例如2-5%二甲基亚砜(DMSO)。许多这些应用取决于有效表面和参考表面之间的基准减法(referencesubtraction)，以便获得足够的数据品质。然而，取决于固定在有效表面上的配体的量，主体信号(来自流动缓冲液和样品中的折射率的差异)不能被基准减法完全猝灭。这被添加到来自分析物结合的响应中，并且由于失配也随着移液误差而变化，其可以从显著的正值跨到负值。取决于报告点读数，这可能对测定中的数据品质而言是重要的。
然而，这可以通过测量在参考物中参考误差与主体响应的函数且随后通过该函数调节每个样品来校正，即溶剂校正。当进行溶剂校正时，用户必须制备具有代表性主体响应的许多溶液(根据Biacore推荐的程序，8种)。为了建立校正曲线，将这些溶液注射到每一对参考-有效检测表面上。由于程序在整个运行中重复至少一次，并且由于不存在多次使用相同位置的方式，板占用率和用户工作量是显著的。
需要使溶剂校正过程简单和自动化。
发明概述
本发明涉及用于建立溶剂校正曲线以及使用所述曲线从分析物的传感图获得校正传感图或校正报告点的方法。
在一方面，它提供了用于建立溶剂校正曲线的方法，其包括：
a. 提供包含高浓度的有机溶剂的第一溶液和包含低浓度的相同有机溶剂的第二溶液；
b. 在集成微流体盒(IFC)的流动通道中以预定比例在线混合所述两种溶液，所述流动通道包含具有未固定有配体或类似物的光学传感器表面的流动池；
c. 从步骤(b)的光学传感器表面获得所述混合溶液的传感图，所述传感图包含所述传感图的稳定部分处的报告点；
d. 在集成微流体盒(IFC)的另一个流动通道中以如步骤(b)中的相同预定比例在线混合所述两种溶液，所述流动通道包含具有固定有配体或类似物的光学传感器表面的流动池；
e. 从步骤(d)的光学传感器表面获得所述混合溶液的传感图，所述传感图包含所述传感图的稳定部分处的报告点；
f. 以所述两种溶液的不同预定比例重复步骤(b)和(c)各n次；和
g. 使用所述报告点建立溶剂校正曲线；
其中n为至少3。
在另一方面，它提供了用于获得分析物的校正响应的方法，其包括：
a. 在包括含有用于分析物的固定配偶体(partners)的光学传感器表面的流动池中生成具有分析物的溶液的传感图；
b. 在具有不含有用于分析物的固定配偶体的光学传感器表面的相同或另一个流动池中生成溶液的传感图；
c. 通过以下方式获得校正的响应，首先对于各个信号，从(a)的信号中减去(b)的信号以生成修改的传感图，随后根据通过本发明的某些实施方案获得的校正曲线调节所述修改的传感图的信号或来自所述传感图的报告点。
在再一方面，它提供了一种用于在微通道中混合两种液体的方法，其包括：
a. 提供包含特定组合物的第一液体和包含另一种组合物的第二液体；
b. 在微通道中以预定比例在线混合两种液体；
其中，混合所述两种液体包括各自以单独的预设流动速率注射所述两种液体，使组合液体行进通过所述微通道，并使所述流动反向，使得所述组合液体第二次通过所述微通道。
在另一方面，本发明提供了用于研究分子相互作用的分析系统，其包括计算机处理装置，所述计算机处理装置包括用于执行所述方法的步骤的程序代码装置。
在又一方面，本发明提供了用于执行所述方法的步骤的包含存储在计算机可读介质上或承载在电信号或光信号上的程序代码装置的计算机程序产品。
本发明的其它细节和优点将从下面的描述和权利要求而显而易见。
附图简述
图1A和B说明当两种溶液混合三次时，IFC的一部分的细节，示出流动通道中的方向(箭头)和混合模式。
图2示出与用手动混合方法论(预混合)产生的曲线相比，用本发明(返回的)产生的溶剂校正点。
图3示出使用本发明的实施方案收集的数据的传感图。
发明详述
小分子应用越来越多地使用无标签系统进行。如上所述，这些应用通常取决于溶剂校正，其需要大量的动手时间，容易出错并且在仪器中占据大量的试剂/样品位置。对于具有多通道构造的系统，这些问题将恶化。与手动操作相比，本发明的实施方案显著地减少了用户努力和位置占用的量。本发明的实施方案对于使用具有平行通道的集成微流体盒(IFC)(即所谓的多通道系统)的测定特别有用。
本发明涉及用于建立溶剂校正曲线以及获得分析物的校正响应的新方法。本发明还涉及用于执行所述方法的步骤的分析系统和计算机程序产品。
因此，在一方面，本发明涉及用于建立溶剂校正曲线的方法，其包括：
a. 提供包含高浓度的有机溶剂的第一溶液和包含低浓度的相同有机溶剂的第二溶液；
b. 在集成微流体盒(IFC)的流动通道中以预定比例在线混合所述两种溶液，所述流动通道包含具有未固定有配体或类似物的光学传感器表面的流动池；
c. 从步骤(b)的光学传感器表面获得所述混合溶液的传感图，所述传感图包含所述传感图的稳定部分处的报告点；
d. 在集成微流体盒(IFC)的另一个流动通道中以如步骤(b)中的相同预定比例在线混合所述两种溶液，所述流动通道包含具有固定有配体或类似物的光学传感器表面的流动池；
e. 从步骤(d)的光学传感器表面获得所述混合溶液的传感图，所述传感图包含所述传感图的稳定部分处的报告点；
f. 以所述两种溶液的不同预定比例重复步骤(b)和(c)各n次；和
g. 使用所述报告点建立溶剂校正曲线；
其中n为至少3。
在某些实施方案中，当n为3时，预定比例包括1:0(100%的第一溶液且不含第二溶液)；0:1(100%的第二溶液且不含第一溶液)；以及第一和第二溶液的混合，例如以0.5:0.5的比率混合。在某些实施方案中，预定比例间隔在1:0和0:1之间。在某些优选的实施方案中，预定比例均匀间隔在1:0和0:1之间。
在某些实施方案中，在注射开始之后的规定时间置入报告点。优选地，对于相同类型的所有注射，时间是相同的。此外，在注射或一系列注射之前的规定时间置入基准报告点。这里使用的响应是这两者之间的差别；称作相对响应。
对于校正曲线，来自固定的流动池的传感图减去来自参考物(未固定的)的传感图，相对报告点响应给出y轴值。来自参考传感图的相同的相对报告点值给出x轴值。当绘制超过3个点时，可以通过例如将点拟合为二次多项式来生成溶剂校正曲线。
当样品运行时，使用参考响应作为从y轴给出校正数的x值，将该值加到参考物的相对响应减去样品响应，以给出校正的响应。
在某些实施方案中，混合所述两种溶液包括各自以单独的预设流动速率注射两种溶液，使组合溶液行进通过一个或多个流动池，并使所述流动反向，使得组合溶液第二次通过一个或多个流动池。任选地，流动可以再一次反向，使得组合溶液第三次通过一个或多个流动池。
在某些实施方案中，混合所述两种溶液包括各自以单独的预设流动速率注射两种溶液，使组合溶液在进入流动池之前行进通过一个或多个通道和/或阀。
在某些实施方案中，通过控制各溶液的流动速率实现混合两种溶液。
在某些实施方案中，溶液的流动速率由一个或多个泵控制。在某些实施方案中，溶液之一可以由泵控制，而另一种溶液可以通过由针吸入引入。在一些实施方案中，第二个泵存在于流动池的另一侧，两个泵共同作用以将溶液移动跨过流动池。
在某些实施方案中，集成微流体盒包含多个平行通道。
在某些实施方案中，有机溶剂是具有不同于缓冲液的主要组分(例如水)的折射率的溶剂。在某些实施方案中，有机溶剂是DMSO或甘油。选择第一溶液和第二溶液中的有机溶剂的浓度，使得其涵盖对应于样品和流动缓冲液之间的溶剂失配的范围。在一些实施方案中，第一和第二溶液中的有机溶剂的浓度可以是该范围的+/- 50%、该范围的+/- 40%、该范围的+/- 30%或该范围的+/- 20%。例如，当样品和流动缓冲液之间的潜在的溶剂失配为约2%时，第一溶液可具有3%的有机溶剂浓度，第二溶液可具有1%的有机溶剂浓度。
在另一方面，本发明涉及用于获得分析物的校正响应的方法，其包括：
a. 在包括含有用于分析物的固定配偶体的光学传感器表面的流动池中生成具有分析物的溶液的传感图；
b. 在包括不含有用于分析物的固定配偶体的光学传感器表面的相同或另一个流动池中生成相同溶液的传感图；
c. 通过以下方式获得校正的响应，首先对于各个信号，从(a)的信号中减去(b)的信号以生成修改的传感图，随后根据通过本发明的某些实施方案获得的校正曲线调节所述修改的传感图的信号或来自所述传感图的报告点。
在某些实施方案中，分析物可以是任何大分子颗粒，例如溶液中的化学化合物或生物分子。大分子颗粒可以是例如蛋白质、多糖、核酸分子。在某些优选的实施方案中，分析物是小分子。在某些实施方案中，分析物是具有在约80至约1000道尔顿之间的尺寸的小分子。
在某些实施方案中，配体或其类似物在本文中以其对于包含能够与分析物(目标化合物)相互作用的官能团的实体的常规含义使用。配体的基团的实例是带正电荷的基团(阴离子交换配体)；带负电荷的基团(阳离子交换配体)；疏水基团；具有对特定目标化合物的亲和力的基团，例如抗原对抗体的亲和力(亲和力配体)；等。
因此，在IFC内使用合并注射并通过使所述流动反向(即，使样品流回检测点上)改进样品混合，用于建立溶剂校正曲线的改进方法通过重复具有两种极端溶液之间的改变混合比例的程序建立。为了生成准确的溶剂校正曲线，需要至少4个来自不同浓度的有机溶剂溶液的报告点。优选地，溶剂校正曲线包括八个或更多个报告点。
溶剂校正曲线：SPR信号反映传感器表面的折射率(RI)中的变化。RI由于靠近传感器表面的结合事件而变化，并且与表面上的质量的增加有关。如果注射的样品具有不同于流动缓冲液的RI，则获得额外的信号。该信号被称作溶剂效应。当溶剂效应小(大约100 RU)时，通常可以通过从参考表面减去信号而从总信号中消除。然而，引入高RI溶剂如DMSO可以在注射期间引起RI的大的偏移，并且仅从参考流动池中减去数据不再足够。为了校正这些效应，采用溶剂校准程序。具有不同浓度的溶剂的缓冲溶液可以按顺序注射到参考和配体结合表面上。从参考表面获得的校准溶液的响应涵盖相对于基线的-800至+1200 RU的典型范围。通过绘制配体结合流动池之间的响应相对于无配体的流动池中的响应的差异产生溶剂校正曲线。该曲线用于校正在样品注射期间获得的响应水平。
现在使用两个各自在流动池的任一侧上的泵描述本发明的说明性实施方案。图1A说明当两种溶液移动通过流动池三次时，IFC的一部分的细节，示出流动通道中的方向(箭头)和混合模式。与手动过程相比，用户只需在这里制备2种不同的溶液。在该图中，当两种溶液通过流动池(顶部通道)时，将两种溶液(顶部通道中的暗和浅的阴影)混合，如通过中间阴影说明。溶液的运动由通道内部的箭头指示。在第一次通过之后，溶液不能足够好地混合以获得良好的溶剂校正曲线。因此，溶液的流动在中间通道中反向，以进一步混合溶液。因此，附图的两个上部分示出溶液两次通过流动池。第三部分示出任选的第三次通过。如果需要，可以重复第二次和第三次通过以甚至进一步改进混合。实际上，两次通过为生成良好的溶剂校正曲线提供充分混合的溶液。
在第一次通过期间，泵之一的较高流动速率由较宽的箭头指示。另一个泵的较低流动速率和所得的差速流动由较窄的箭头指示。如果例如流动池右边的第二个泵的流动速率为10μl/ min而第一个泵的流动速率(左边，对于溶液1)为3μl/ min，与溶液2的所得的差速流动速率相差7μl/ min。所得的混合比率将为30%的溶液1和70%的溶液2。然而，如传感图(图3，合并部分)中观察到的混合是不完全的。在注射结束后，可以停止第一个泵。通过反转第二个泵，注射的溶液可以再次送回流动池。溶液现在已有更多的时间通过扩散混合。结果是溶液第二次通过流动池(图3返回部分)时得到更均匀的溶液。尽管图中示出两个流动池，但仅仅是一个实施例。在某些实施方案中，单个流动池可以存在于两个泵之间。备选地，超过两个流动池可以存在于两个泵之间。
在备选的实施方案中，通过通道和阀泵送混合溶液也可以实现混合溶液的所需均匀性。图1B示出其中两个泵操作以将溶液在通道中混合的备选实施方案，并且仅将混合溶液引导到一个或多个流动池中。图1B说明当两种溶液移动通过流动池三次时，IFC的一部分的细节，示出流动通道中的方向(箭头)和混合模式。在该图中，当两种溶液通过通道(顶部)时，将两种溶液(顶部通道中的暗和浅的阴影)混合，如通过中间阴影说明。溶液的运动由通道内部的箭头指示。在第一次通过之后，溶液不能足够好地混合以获得良好的溶剂校正曲线。因此，溶液的流动在中间通道中反向，以进一步混合该溶液。底部示出第三次通过。在第一次通过期间，泵之一的较高流动速率由较宽的箭头指示。另一个泵的较低流动速率和所得的差速流动由较窄的箭头指示。如果例如右边的第二个泵的流动速率为10μl/ min而第一个泵(左边，对于溶液1)的流动速率为3μl/ min，与溶液2的所得的差速流动速率相差7μl/ min。所得的混合比率将为30%的溶液1和70%的溶液2。在注射结束后，可以停止第一个泵。通过反转第二个泵，注射的溶液可以再次送回。溶液现在已具有更多时间通过扩散混合。结果是溶液第二次通过通道时得到更均匀的溶液，而当溶液第三次通过通道时得到甚至更好的混合溶液。
备选地，两个泵都可以位于附图左手侧的通道处。
执行的实验示出以这种方式产生的溶剂校正曲线(例如，相对于参考响应绘制并拟合为二次多项式的固定有配体的响应-参考响应)给出与来自手动混合溶液的溶剂校正曲线重叠的曲线(图2)，因此手动和自动方法获得相同的结果，即在两种情况下校正是相同的。在图2中，x轴和y轴两者的单位均为RU。
应当注意，本文所用的术语“光学传感器表面”或“固体支撑物”应被广泛解释，并且意在包含可在其上固定一种或多种结合剂和通过所选择的具体检测系统检测的与其进行分子相互作用的任何固体(柔性或刚性)基材。基材可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或它们的组合，并且可以是颗粒、股、沉淀物、凝胶、片、管、球体、容器、毛细管、垫、切片、膜、板、滑片等的形式，具有任何方便的形状，包括盘、球体、圆等。基材表面可以具有任何二维构造，并且可以包括例如梯级、隆起、扭结、阶面等，并且可以是与基材的其余部分不同的材料的层的表面。在某些实施方案中，光学传感器表面是基于倏逝波传感的检测器的部分。优选地，光学传感器表面是基于表面等离子体共振的检测器的部分。
在流动池(例如在上述Biacore®仪器中使用的类型的流动池)中执行本发明的某些方法可能许多次是方便的。可以在本发明中使用的其它流动池也是本领域技术人员所熟知的并且不需要在本文中描述。
在另一方面，提供了一种用于在微通道中混合两种液体的方法，其包括：
b. 提供包含特定组合物的第一液体和包含另一种组合物的第二液体；
c. 在微通道中以预定比例在线混合两种液体；
其中，混合所述两种液体包括各自以单独的预设流动速率注射所述两种液体，使组合液体行进通过所述微通道，并使所述流动反向，使得所述组合液体第二次通过所述微通道。
在用于混合两种液体的方法的某些实施方案中，流动可以再一次反向，使得组合液体第三次通过微通道。
在某些实施方案中，通过控制各液体的流动速率来实现混合两种液体。
在某些实施方案中，液体的流动速率由一个或多个泵控制。
只要结合检测点进行混合，通过评估作为混合有效性的参数的平滑度(例如，在图3中比较合并部分与返回部分)，可以容易地评估液体混合的有效性。
以下一般原理适用于本发明的某些方面。
可以使用许多不同的相互作用分析技术来表征表面结合相互作用和折射率的主体变化。市售可得的生物传感器包括基于表面等离子体共振(SPR)的上述Biacore®系统仪器，并允许实时监测表面相互作用。
SPR的现象是众所周知的。当光在某些条件下在不同折射率的两种介质之间的界面处反射，并且界面被金属膜(通常为银或金)涂覆时出现SPR。在Biacore®仪器中，介质是样品和通过微流体流动系统与样品接触的传感器芯片的玻璃。金属膜是芯片表面上的薄金层。SPR使反射光的强度在特定的反射角下降低。在Biacore®系统的样品侧中，该最小反射光强度的角度随着接近反射光相反侧上的表面的折射率而变化。
当样品中的分子与传感器芯片表面上的捕获分子结合时，表面的浓度且因此折射率改变并检测SPR响应。在相互作用过程期间，针对时间绘制响应将提供相互作用进程的定量测量。这种图通常被称作传感图。在Biacore®系统中，SPR响应值以共振单位(RU)表示。1RU表示在最小反射光强度的角度中0.00001°的变化，其对于大多数蛋白质大致相当于传感器表面上约1pg / mm2的浓度变化。当含有分析物的样品接触传感器表面时，与传感器表面结合的捕获分子(配体)在被称作“缔合”的步骤中与分析物相互作用。当使样品最初与传感器表面接触时，该步骤通过RU增加在传感图上指示。相反，当样品流例如被缓冲液流替代时，通常会发生“解离”。当分析物与表面结合的配体解离时，该步骤在传感图上通过RU随时间的下降而指示。
Biacore®仪器的技术方面和SPR的现象的详细讨论可以在美国专利No. 5,313,264中发现。用于生物传感器传感表面的基质涂层的更详细信息在例如美国专利No. 5,242,828和5,436,161中给出。此外，结合Biacore®仪器使用的生物传感器芯片的技术方面的详细讨论可在美国专利No. 5,492,840中发现。上述美国专利的全部公开内容通过引用并入本文中。
尽管针对Biacore®系统已经进行以上描述，但是应当理解，本发明可以结合许多其它技术使用，所述技术用于基于折射率变化和其它物理现象(也需要在固体支撑表面的溶剂校正)检测结合的相互作用。然而，实时检测系统是优选的，特别是基于化学传感器或生物传感器技术的系统。
生物传感器广泛定义为使用用于分子识别的部件(例如具有固定的抗体的层)的设备，所述部件与固态物理化学换能器直接结合或与正与换能器结合的移动载体珠/颗粒直接结合。虽然这种传感器通常基于无标签技术，检测例如固定层的质量、折射率或厚度的变化，还存在依赖一些种类的标记的传感器。典型的传感器检测技术包括但不限于质量检测方法，例如光学、热-光学和压电或声波(包括例如表面声波(SAW)和石英晶体微天平(QCM))方法以及电化学方法，例如电势测定、电导测定、电流测定和电容/阻抗方法。关于光学检测方法，代表性方法包括检测质量表面浓度的方法，例如反射-光学方法，包括外部和内部反射方法两者，其可以是角度、波长、极化或相解析，例如倏逝波椭圆光度法和倏逝波光谱(EWS，或内部反射光谱)，这两者都可包括经由表面等离子体共振(SPR)、布鲁斯特角折射法、临界角折射法、受抑全反射(FTR)、散射全内反射(STIR)的倏逝场增强，其可包括散射增强标记、光学波导传感器；外部反射成像、基于倏逝波成像例如临界角解析成像、布鲁斯特角解析成像、SPR角解析成像等。此外，可提及光度测定和成像/显微镜方法“本身”或与反射方法组合的光度测定和成像/显微镜方法(基于例如表面增强拉曼光谱(SERS)、表面增强共振拉曼光谱(SERRS)、倏逝波荧光(TIRF)和磷光)，以及波导干涉仪、波导泄漏模式光谱、反射干涉光谱(RIfS)、透射干涉法、全息光谱和原子力显微镜(AFR)。
实施例
表面制备：
将传感器芯片CM5对接(docked)，并通过使用来自GE Healthcare的胺偶联成套工具的胺偶联来固定12000 RU人血清白蛋白。注射10mM乙酸盐pH 5.0中的50μg/ ml人血清白蛋白7分钟。
缓冲液和溶剂校正溶液如下所述制备：
使用由GE Healthcare提供的储备溶液10 x PBS-P +(具有0.5% P20)来制备流动缓冲液。
1. 制备2升1.02 x PBS-P +：用Milli-Q水将204ml 10 x PBS-P +储备液稀释至2000ml。该缓冲液用于制备流动缓冲液和溶剂校正储备溶液。
2. 溶剂校正储备溶液和测定流动缓冲液的制备：根据表1制备10ml具有1.5%和2.8% DMSO的溶剂校正储备溶液和1升具有2% DMSO的测定流动缓冲液。
表1.用于溶剂校正的溶液和2% DMSO流动缓冲液。
3. 溶剂校正工作溶液的制备：使用1.5%和2.8% DMSO储备溶液，制备根据表2(体积以μl计)的用于溶剂校正曲线的一系列等分物。
表2.溶剂校正溶液的制备。体积以μl计。
缓冲液/小瓶 1 2 3 4 5 6 7 8
1.5%DMSO 0 200 400 600 800 1000 1200 1400
2.8%DMSO 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
4. 针对“预混合”数据，将这些溶液1-8一个接一个地注射通过两个流动池。
5. 在合并-返回实验中，仅使用溶液1和8，但以不同的流动速率注射，并在如上所述的IFC中混合。
使用手动和合并-返回注射获得的结果是比得上的，如图2中所例示。
虽然已经示出和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的教导的情况下，可以进行变化和修改。上述说明书和附图中阐述的事项仅作为说明而不作为限制来提供。当以他们基于现有技术的合适视角来看时，本发明的实际范围旨在所附权利要求书中限定。

Claims (16)

1.一种用于建立溶剂校正曲线的方法，其包括：
a. 提供包含高浓度的有机溶剂的第一溶液和包含低浓度的相同有机溶剂的第二溶液；
b. 在集成微流体盒(IFC)的流动通道中以预定比例在线混合所述两种溶液，所述流动通道包含具有未固定有配体或类似物的光学传感器表面的流动池；
c. 从步骤(b)的光学传感器表面获得所述混合溶液的传感图，所述传感图包含所述传感图的稳定部分处的报告点；
d. 在所述集成微流体盒(IFC)的另一个流动通道中以如步骤(b)中的相同预定比例在线混合所述两种溶液，所述流动通道包含具有固定有配体或类似物的光学传感器表面的流动池；
e. 从步骤(d)的光学传感器表面获得所述混合溶液的传感图，所述传感图包含所述传感图的稳定部分处的报告点；
f. 以所述两种溶液的不同预定比例重复步骤(b)和(c)各n次；和
g. 使用所述报告点建立溶剂校正曲线；
其中n为至少3。
2.权利要求1的方法，其中混合所述两种溶液包括以单独的预设流动速率注射所述两种溶液，使组合溶液行进通过所述一个或多个流动池，并使所述流动反向，使得所述组合溶液第二次通过所述一个或多个流动池。
3.权利要求2的方法，其中所述流动再一次反向，使得所述组合溶液第三次通过所述一个或多个流动池。
4.权利要求1的方法，其中混合所述两种溶液包括各自以单独的预设流动速率注射所述两种溶液，使所述组合溶液在进入所述流动池之前行进通过通道和/或阀。
5.权利要求1的方法，其中混合所述两种溶液通过控制各种溶液的流动速率来实现。
6.权利要求1的方法，其中所述溶液的流动速率通过一个或多个泵控制。
7.权利要求1的方法，其中所述IFC包含多个平行通道。
8.权利要求1的方法，其中所述有机溶剂为DMSO。
9.一种用于获得分析物的校正响应的方法，其包括：
a. 在包括含有用于分析物的固定配偶体的光学传感器表面的流动池中生成具有分析物的溶液的传感图；
b. 在具有不含有用于分析物的固定配偶体的光学传感器表面的相同或另一个流动池中生成所述溶液的传感图；
c. 通过以下方式获得校正的响应，首先对于各个信号，从(a)的信号中减去(b)的信号以生成修改的传感图，随后根据权利要求1的校正曲线调节所述修改的传感图的信号或来自所述传感图的报告点。
10.权利要求9的方法，其中所述分析物是具有在约80至约1000道尔顿之间的尺寸的小分子。
11.权利要求9的方法，其中所述光学传感器表面是基于倏逝波传感的检测器的部分。
12.权利要求9的方法，其中所述光学传感器表面是基于表面等离子体共振的检测器的部分。
13.一种用于在微通道中混合两种液体的方法，其包括：
a. 提供包含特定组合物的第一液体和包含另一种组合物的第二液体；
b. 在微通道中以预定比例在线混合两种液体；
其中混合所述两种溶液包括各自以单独的预设流动速率注射所述两种液体，使所述组合液体行进通过所述微通道，并使所述流动反向，使得所述组合液体第二次通过所述微通道。
14.权利要求13的方法，其中所述流动再一次反向，使得所述组合液体第三次通过所述微通道。
15.权利要求13的方法，其中混合所述两种液体通过控制各种液体的流动速率来实现。
16.权利要求13的方法，其中所述液体的流动速率通过一个或多个泵控制。
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