CN103698278A - 一种分子间相互作用的测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测量分子间相互作用的方法，具体步骤为：（1）将待测相互作用体系中的一方分子A连接在纳米粒子表面；（2）将纳米粒子固定在微流控芯片中，记录单个纳米粒子的局域表面等离子体共振（LSPR）光谱；（3）将相互作用体系中的另一方分子B按浓度梯度分别通过纳米粒子，同时记录单个纳米粒子LSPR光谱；（4）以B分子浓度为横坐标，LSPR峰值为纵坐标做图，按照算法公式拟合该图得到A分子与B分子相互作用体系的结合常数，结合位点个数，最大LSPR峰值位移。测量结合常数范围在1.0×10³M^－1到1.0×10¹⁰M^－1之间。

Description

一种分子间相互作用的测量方法

技术领域：

本发明涉及一种分子间相互作用的测量方法，特别适用于对生物大分子间，生物大分子与小分子间相互作用的测量。 

背景技术：

生物分子间以相互作用的方式传递信号、执行功能、输运物质等。深入了解分子间相互作用对理解生命现象，开发药物至关重要。结合常数是定量相互作用效果的参数。通常测量结合常数的方法包括毛细管电泳法，色谱法，核磁共振法，酶联免疫吸附分析法，石英晶体微天平法，表面等离子体共振法，等温滴定微量热法，微阵列芯片等方法。最近出现了将金纳米颗粒用于上述方法中以提高检测灵敏度。这些方法都是宏观水平上的分析方法，存在适用范围有限，试样消耗量大，测量时间长等缺点。单个纳米粒子水平上测量相互作用的方法尚未有报道。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种测量分子间相互作用的方法，解决单个粒子水平上不能测量分子间相互作用的问题。 

本发明的目的是以如下技术方案实现的：一种测量分子间相互作用的方法，以光学显微镜为成像平台，以光谱成像检测器为记录仪，以微流控芯片为样品驱动控制装置，以纳米粒子为检测对象，在单个纳米粒子水平上测量分子间相互作用体系的结合常数、结合位点个数；具体步骤如下： 

（1）将待测相互作用体系中的一方分子（简称A分子）连接在纳米粒子表面； 

（2）将纳米粒子固定在微流控芯片中，记录单个纳米粒子的LSPR光谱λ_AP； 

（3）将相互作用体系中的另一方分子（简称B分子）溶液以不同浓度依次分别通过纳米粒子，同时记录单个纳米粒子LSPR光谱λ； 

（4）以B分子浓度为横坐标，LSPR峰值差Δλ=λ-λ_AP为纵坐标做图，按照算法公式拟合该图即可得到A分子与B分子相互作用体系的结合常数，结合位点个数，最大LSPR峰值位移；单个纳米粒子的LSPR位移随B分子浓度的变化趋势与相互作用体系结合常数相关。 

所述光学显微镜成像平台是常规暗场显微镜、激光散射显微镜、LSPR显微镜、微型化显微镜； 

所述光谱成像检测记录仪是基于光栅的光谱成像仪、基于棱镜的光谱成像仪； 

所述纳米粒子材质是金属纳米粒子、金属参杂纳米粒子、半导体纳米粒子、高分子纳米粒子； 

所述纳米粒子形状是球形、棒形、梭形、三角形、星形、多边形及不规则形状； 

所述纳米粒子尺度在10nm－1000nm之间； 

所述分子间相互作用发生在DNA分子间、蛋白质分子与DNA分子间、蛋白质分子与蛋白质分子之间、蛋白质分子与糖分子之间、蛋白质分子与小分子之间、糖分子与DNA分子之间、糖分子与小分子之间； 

所述算法公式为 $\mathrm{\Δ\λ}={\mathrm{\Δ\λ}}_{\max }\left(\frac{{\left[C_0\right]}^n}{\mathrm{\α}/K+{\left[C_0\right]}^n}\right)$

其中： 

Δλ为有B分子通过和无B分子通过时LSPR峰值差，Δλ=λ-λ_AP； 

Δλ_max为有B分子通过和无B分子通过时LSPR峰值差的最大值； 

α为结合了B分子的纳米粒子上A分子位点个数与未结合B分子的纳米粒子上A分子位点个数的比值； 

K为A分子与B分子的结合常数； 

n为A分子与B分子的结合位点个数； 

[C₀]为B分子浓度。 

所述拟合图为指数曲线，其线性区域内可以用来检测B分子浓度； 

所述结合常数范围在1.0×10³M^－1到1.0×10¹⁰M^－1之间。 

本发明方法的优点在于：该方法能够应用于弱，中，强相互作用体系，适用范围广，测量范围宽，样品消耗量极低，检测量灵敏度高，测量时间短，通量高。 

附图说明

图1为本发明的单纳米粒子光谱成像光路示意图。 

图中1，光源；2，暗场光阑；3，透镜；4，样品台；5，暗场物镜；6，反射镜；7，光栅；8，成像记录仪。 

图2为本发明的单个纳米粒子光谱成像照片。 

图3为本发明测量肝素与抗凝血酶III相互作用的结果图。 

图4为本发明测量低分子量肝素与抗凝血酶III的相互作用结果图。 

图5为本发明测量肝素与牛血清白蛋白相互作用的结果图。 

图6为本发明测量转铁蛋白与转铁蛋白抗体相互作用的结果图。 

具体实施方式：

实施例1： 

取直径70nm金颗粒溶液20微升，其颗粒密度为1.6×10¹⁰每毫升，固定在玻璃载玻片的不同区域上。随后用25mM2-吗啉乙磺酸冲洗两次，1mM的4,4’-羧丙基二硫化物孵育5分钟，再用超纯水冲洗。用20μL1mg/mL抗凝血酶III孵育30分钟后用超纯水冲洗。分别取2微升不同浓度的肝素溶液，0－50微摩尔/升，滴于固定了金颗粒载玻片的不同区域上，盖上盖玻片，放置在光谱成像仪下观察，见图1。图2为代表性的金颗粒LSPR光谱成像结果。记录下各区域中金颗粒光谱。以肝素浓度为横坐标，LSPR峰位移为纵坐标作图，见图3，按照算法公式拟合，即可得到肝素与抗凝血酶III的结合常数为(3.1±0.3)×10⁶M^-1，结合位点为1。 

实施例2： 

操作步骤同实施例1，仅将肝素替换为低分子量肝素。以低分子量肝素浓度为横坐标，LSPR峰位移为纵坐标作图，见图4，按照算法公式拟合，即可得到肝素与抗凝血酶III的结合常数为(8.0±0.5)×10⁵M^-1，结合位点为1.6。 

实施例3： 

操作步骤同实施例1，仅将抗凝血酶III替换为牛血清白蛋白。以肝素浓度为横坐标，LSPR峰位移为纵坐标作图，见图5，按照算法公式拟合，即可得到肝素与牛血清白蛋白的结合常数为(5.1±0.1)×10³M^-1，结合位点为1。 

实施例4： 

取直径70nm金颗粒溶液20微升，颗粒密度1.6×10¹⁰每毫升，固定在玻璃载玻片的不同区域上。随后用25mM2-吗啉乙磺酸冲洗两次，1mM的4,4’-dithiodibutyric acid孵育5分钟，再用超纯水冲洗。用20μL1mg/mL转铁蛋白抗体孵育30分钟后用超纯水冲洗。分别取2微升不同浓度的转铁蛋白溶液（0－50微摩尔/升之间），滴于固定了金颗粒载玻片的不同区域上，盖上盖玻片，放置在光谱成像仪下观察，见图1。以转铁蛋白浓度为横坐标，LSPR峰位移为纵坐标作图（图6），按照算法公式拟合，即可得到转铁蛋白与转铁蛋白抗体的结合常数(3.0±0.6)×10⁹M^-1，结合位点为2。 

Claims (3)

1.一种测量分子间相互作用的方法，以光学显微镜为成像平台，以光谱成像检测器为记录仪，以微流控芯片为样品驱动控制装置，以纳米粒子为检测对象，在单个纳米粒子水平上测量分子间相互作用体系的结合常数、结合位点个数；具体步骤如下：

（1）将待测相互作用体系中的一方分子（简称A分子）连接在纳米粒子表面；

（2）将纳米粒子固定在微流控芯片中，记录单个纳米粒子的LSPR光谱λ_AP；

（3）将相互作用体系中的另一方分子（简称B分子）溶液以不同浓度依次分别通过纳米粒子，同时记录单个纳米粒子LSPR光谱λ；

（4）以B分子浓度为横坐标，LSPR峰值差Dλ=λ-λ_AP为纵坐标做图，按照算法公式拟合该图即可得到A分子与B分子相互作用体系的结合常数，结合位点个数，最大LSPR峰值位移；

所述纳米粒子材质是金属纳米粒子、金属参杂纳米粒子、半导体纳米粒子、高分子纳米粒子；

所述纳米粒子形状是球形、棒形、梭形、三角形、星形、多边形及不规则形状；

所述纳米粒子尺度在10nm－1000nm之间；

所述分子间相互作用体系是DNA分子与DNA分子、蛋白质分子与DNA分子、蛋白质分子与蛋白质分子、蛋白质分子与糖分子、蛋白质分子与小分子、糖分子与DNA分子、或糖分子与小分子；

所述算法公式为 $\mathrm{\Δ\λ}={\mathrm{\Δ\λ}}_{\max }\left(\frac{{\left[C_0\right]}^n}{\mathrm{\α}/K+{\left[C_0\right]}^n}\right)$

其中：

Δλ为有B分子通过和无B分子通过时LSPR峰值差，Δλ=λ-λ_AP；

Δλ_max为有B分子通过和无B分子通过时LSPR峰值差的最大值；

α为结合了B分子的纳米粒子上A分子位点个数与未结合B分子的纳米粒子上A分子位点个数的比值；

K为A分子与B分子的结合常数；

n为A分子与B分子的结合位点个数；

[C₀]为B分子浓度。

所述拟合图为指数曲线，其线性区域内可以用来检测B分子浓度；

所述结合常数范围在1.0×10³M^－1到1.0×10¹⁰M^－1之间。

2.根据权利要求1所述的一种测量分子间相互作用的方法，其特征在于，所述光学显微镜成像平台是常规暗场显微镜、激光散射显微镜、LSPR显微镜、微型化显微镜。

3.根据权利要求1所述的一种测量分子间相互作用的方法，其特征在于，所述光谱成像检测记录仪是基于光栅的光谱成像仪、基于棱镜的光谱成像仪。

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