CN107109342A - 喷雾冷冻 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于保存例如微生物、尤其是乳酸菌的改善方法，所述方法包括喷雾冷冻。

Description

喷雾冷冻
技术领域
本发明涉及用于干燥和/或冷冻蛋白质或微生物、尤其是乳酸菌的改善方法，所述方法包括将所述蛋白质或微生物的悬浮液/溶液喷雾到气体中。
背景技术
喷雾干燥先前已被用于干燥乳酸菌，但没有获得大的商业成功。例如美国专利US6010725A(Nestle)涉及用于在具有高于250摄氏度(℃)的入口温度的喷雾干燥设备中喷雾干燥微生物的工艺。据说至少有10％的微生物在处理中存活。
近来已提出喷雾冷冻用于冷冻乳酸菌，但商业成功有限。Semyonov等(FoodResearch International 43,193-202(2010))已研究了通过“喷雾冷冻干燥”(即喷雾冷冻，继之以冷冻干燥)微胶囊化的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)细胞的存活率。显然，细菌悬浮液以其液态形式被直接喷雾到氮气中，该工艺产生具有400到1800微米的大小分布的微胶囊。推断大容量冷冻干燥(bulk freeze drying)产生略高于喷雾冷冻干燥的存活率，并且具有约1000-1400微米的大小的粒子产生高于400微米粒子的存活率。
美国专利US7007406(Wang)公开了一种喷雾冷冻设备，其中冷冻产物被收集在过滤器上。
所有上述喷雾冷冻和干燥工艺都具有有限的商业成功，尤其是当待保存的产品是应当在解冻或再水合后有活力的细菌细胞时。
发明内容
本发明人已惊讶地发现，如果存在以下情况，则可通过包括喷雾冷冻的工艺非常有效地且以高存活率保存细菌细胞：
-喷雾冷冻步骤之前是干燥步骤，其中雾化粒子通过与干燥气体接触而被(部分)干燥；
-通过在低温气体中冷冻雾化粒子来实施冷冻；和/或
-借助于旋风分离器收集冷冻产物。
此外，本发明人已观察到，与传统的冷冻工艺相比，本发明的冷冻工艺具有诸如以下的意想不到的优点：
-改善的工艺经济性，因为i)与颗粒冷冻相比，用于冷冻的氮气的消耗更少，ii)可能用通过本发明获得的冷冻产物更有效地操作冷冻干燥器，由加载到冷冻干燥器中的量和冷冻干燥后获得的最终产物的量计算，和iii)获得更紧凑的冷冻产物，从而减少对冷冻器空间和/或更容易的运输的需要，和
-如果使悬浮液/溶液在冷冻步骤前经受预干燥步骤，则改善液体的去除；明显地，蒸发的液体在冷冻步骤中不形成粒子并与低温气体一起被去除，和/或任何形成的粒子都小到使得它们与期望的冷冻产物在例如旋风分离器中分离。
更详细地说，本发明人已证明，使用液氮和/或非常冷的氮气在环境大气压力下对含水制剂的常规喷雾冷冻中，根本不会在冷冻工艺期间发生干燥，因此与在液氮中常规造粒获得的较大颗粒相比，仅提供较小的微粒用于下游冷冻干燥。常规地，喷雾干燥器的通过率如此低使得这些干燥方法不提供例如对冷冻干燥的经济可行的替代方案。过高的干燥器出口温度将有效地破坏并杀死大多数乳酸菌菌株，因为生活在人肠道中的大多数细菌(如乳酸菌-下文简称为LAB，特别是厌氧LAB))在40℃将不会存活很长时间。
在将喷雾干燥和部分脱水的液滴的下游冷冻相结合的尝试中，本发明人在置于喷雾冷冻室顶部的雾化装置周围改装(retrofitted)加热的(氮)气体分配器。喷雾冷冻室被改造成使得上半部分将维持远高于大部分含水LAB悬浮液的凝固点的温度，并且在组合的喷雾干燥/冷冻室的下半部分中，注入液氮以实现由室顶部中的雾化装置产生的部分脱水液滴的喷雾冷冻。
冷冻后，通过来自喷雾室的喷雾干燥和下游喷雾冷冻区段两者的组合量的氮气，将微观冰晶和大得多的冷冻产物颗粒气动送输到下游旋风分离器。微观冰晶小到使得下游旋风分离器不能将它们从氮气中完全分离出来，而大得多的冷冻产物颗粒如所预期的从氮气中被有效地分离。因此，已惊讶地证明，使用旋风分离器用于从低温气体中分离冷冻粒子是有利的。本发明人发现，随同来自喷雾室的温热的上半部分的部分脱水液滴的冷冻，来自初始喷雾干燥工艺的任何水蒸气在与喷雾室的下半部分中的液氮喷雾接触后将几乎立即急速冷冻(shock freeze)成微观冰晶。取决于干燥气体速率/温度和产物进料速率，回收的部分脱水/冷冻产物颗粒(在50到400微米范围的各种大小)通常展示在0.5-50％(w/w)范围的水分含量的降低，并且被发现与通过常规液氮造粒产生的大得多的商业可得冷冻产物颗粒(3000-10000微米或3-10mm)相比具有高约15％的堆积密度，由此增加了用于产物的下游最终干燥步骤的任何冷冻干燥器单元的总容量。
发明人继续了他们的研究，并对回收的部分脱水/冷冻产物颗粒进行了下游最终冷冻干燥，并且发现组合喷雾干燥/冷冻工艺的新发明获得了令人惊讶地高的干燥后的细菌存活率和活性。
令他们惊讶的是，他们还发现，与通过常规液氮造粒产生的冷冻干燥的较大的冷冻产物颗粒相比，冷冻干燥的微颗粒显著收缩，实际上，所述冷冻干燥产物的最终堆积密度是常规冷冻干燥粉末的约21/2倍。密度增加转化为低得多的产物孔隙率和由此改善的产物稳定性以及产物的最终应用中的许多其它优点。
本发明人发现当用于喷雾干燥器/冷冻器中的干燥气体不含氧气时，获得最佳结果，因此我们预期气体应优选惰性气体，如氮气，或任何稀有气体，如氦气、氩气和氖气等。目前通过组合使用惰性干燥/低温/输送气体与环境压力下的干燥压力获得最佳结果，但预期在低于或高于环境压力的压力下实施所述工艺将是优点。
本发明的喷雾干燥/冷冻方法使LAB的存活率和稳定性得以改善，并且与所生产的含有LAB的粉末的干燥组合，这获得了用于含有热和氧不稳定的LAB的产物的经济可行的预干燥/冷冻工艺。
此外，已证明，相对于通过常规液氮造粒产生的冷冻干燥的大得多的冷冻产物颗粒(含有相同的热不稳定材料)相比，组合的干燥/冷冻工艺、之后进行常规冷冻干燥的产物(即干燥粉末)具有几个意想不到的优点，例如改善的存活率(活性更高的材料，即更高的产率)、更容易的适用性(所述粉末更容易分散在水溶液或悬浮液如乳中)。
本发明本身并不限于单独的LAB干燥：大多数活细菌/病毒株、大的大分子如蛋白质/肽和其它生物药物/生物产品通常将受益于该不含氧且低温的预干燥/冷冻方法。因此，本发明包括这些实施方案。
根据上述令人惊讶的发现，本发明在第一方面涉及用于通过冷冻和任选地干燥含有热不稳定材料如蛋白质或微生物的溶液或悬浮液来保存该材料的工艺，其特征在于，使所述悬浮液或溶液的液滴与干燥气体接触，并随后使(部分)干燥的液滴与低温气体接触。
在第二方面，本发明涉及通过第一方面的工艺可获得的产物。
在第三方面，本发明涉及可用于第一方面的工艺中的设备，如包括室的设备，所述室具有：i)用于雾化悬浮液的雾化构件，ii)用于干燥气体的入口(任选地整合在所述雾化构件中)，iii)用于低温气体的入口，和iv)任选地与旋风分离器连接的出口，例如基本上如图1或图4上所描绘的设备。
具体实施方式
在第一方面，本发明涉及用于保存(冷冻和/或干燥)微生物(尤其是LAB(乳酸菌))或蛋白质的工艺，所述工艺涉及使含有所述微生物/蛋白质的液滴(例如雾化悬浮液)经受低温气体。该第一方面的引人关注的实施方案是：
1：一种用于保存微生物(尤其是LAB(乳酸菌))的工艺，如通过冷冻和任选地干燥来保存，其包括以下步骤：
a)制备含有所述微生物(优选具有至少1.0E+8个微生物/ml的含量)的含水(或液体)悬浮液的液滴(优选具有10到500微米的大小，如在以下范围的大小：15到400、20到350、50到350、100到350、20到300、20到200、50到300、50到200、100到300或100到200，测量为Dv90值(Dv90被定义为最大粒子直径，存在90％样品体积低于该最大粒子直径，根据粒度分析-激光衍射方法(Particle size analysis-Laser diffraction methods)的ISO 13320:2009标准，以微米测量))，例如通过喷雾(雾化)所述悬浮液进行；和
b)任选地使所述液滴与干燥气体(优选具有在20℃到250℃范围的温度，和/或优选保持1秒到120秒的时间段)接触；和
c)使所述液滴(如由前一步骤产生的液滴)与低温气体(优选具有在-20到-150℃或-50到-100℃范围的温度，和/或优选保持1秒到120秒的时间段)接触；和
d)任选地使来自前一步骤的所得冷冻产物经受进一步干燥步骤，如减压干燥，例如，冷冻干燥；和
e)任选地包装所述微生物，如在气密和/或不透水的包装中(任选地连同不同株的微生物一起)包装。
2：一种用于干燥含有微生物(尤其是LAB)的悬浮液的工艺，其特征在于：
i)在喷雾室中将含有微生物(优选具有至少1.0E+8个微生物/ml的浓度)的含水悬浮液喷雾到低温气体(优选具有在-20到-150℃范围的温度)中；和
ii)收集来自步骤a)的冷冻产物并冷冻干燥直到实现小于0.20的水活度。
3：一种用于干燥含有微生物(尤其是LAB)的悬浮液的工艺，其特征在于：
i)在喷雾室中将含有微生物(优选具有至少1.0E+8个微生物/ml的浓度)的含水悬浮液喷雾到干燥气体(优选具有在30到200℃范围的温度)中；
ii)使来自步骤a1)的产物与室中的低温气体(优选具有在-20到-150℃范围的温度)接触；和
iii)收集来自步骤a)的冷冻粉末并冷冻干燥直到实现小于0.20的水活度。
4：一种用于干燥含有蛋白质(如酶、激素、人蛋白质、治疗活性蛋白质或脂蛋白)或微生物(如细菌、LAB、酵母、真菌、植物细胞、动物细胞或病毒)的溶液或悬浮液(或从中去除液体)的工艺，其特征在于：
a)制备所述悬浮液或溶液的液滴(优选具有10到500微米的大小，如在以下范围的大小：15到400、20到350、50到350、100到350、20到300、20到200、50到300、50到200、100到300或100到200，以微米测量为Dv90)，例如通过喷雾所述溶液或悬浮液进行；和
b)任选地使所述液滴与干燥气体(优选具有在20℃到250℃范围的温度，和/或优选保持1秒到120秒的时间段)接触；和
c)使步骤a)或b)中获得的液滴与低温气体(优选具有在-20到-150℃或-50到-100℃范围的温度，和/或优选保持1sec到120sec的时间段)接触；和
d)使来自前一步骤的所得冷冻产物经受进一步干燥步骤，如减压干燥，例如，冷冻干燥；和
e)任选地包装所述产物，如在气密和/或不透水的包装中来包装。
5：一种用于通过以下方式冷冻含有微生物(尤其是LAB)的悬浮液的工艺：
●将所述悬浮液喷雾到含有干燥气体(优选具有在20℃到250℃范围的温度，和/或优选因此使所述悬浮液与所述气体接触1秒到120秒的时间段)的室中；和
●通过与室中的低温气体(优选具有在-20到-150℃或-50到-100℃范围的温度，和/或优选使所述产物与所述低温气体接触1sec到120sec的时间段)接触来冷冻来自前一步骤的产物；和
●任选地包装所述冷冻的悬浮液，如在气密和/或不透水的包装中来包装。
在上述工艺中，应当理解，干燥步骤进行足以实现期望的干燥程度的时间，并且冷冻进行足以可实现完全冷冻的时间，即产物应当被完全冷冻。本领域技术人员知道如何获得例如两室(两区)喷雾塔中的适合条件，并且知道如何计算喷雾塔的高度，使得喷雾的悬浮液具有分别通过干燥室/干燥区和冷冻室/冷冻区的适合的通过时间。
在上述工艺中，优选通过喷雾制备液滴。喷雾可借助于喷雾喷嘴(雾化装置)，如超声波喷嘴、压力喷嘴、双流体喷嘴(例如使用N2作为雾化气体)或旋转雾化装置来实施，所述雾化优选产生具有10到500微米的大小，如具有选自以下范围中的一个的大小的液滴：15到400、20到350、50到350、100到350、20到300、20到200、50到300、50到200、100到300或100到200，所述大小以微米测量为Dv90值。
可借助于旋风分离器或静电过滤器收集冷冻产物(例如粉末)。目前优选旋风分离器，如以跨越旋风分离器10mm到300mm水柱或50到200mm水柱或大约100mm水柱的最大差压降操作的旋风分离器。
目前优选喷雾干燥和/或冷冻步骤在60到200kPa(如80到c150kPa或60到120kPa、70到110kPa或105到140kPa)的压力下进行。
有利地，(冷冻产物的)最终干燥步骤可在减压下进行，如通过冷冻干燥进行，优选达到低于0.20的水活度。
第一方面的工艺的其它引人关注的实施方案是：
-一种工艺，其中“保留时间”在喷雾干燥器中小于2分钟，并且优选将所得喷雾干燥(或部分干燥)产物直接引入冷冻室中，如通过使用其中将来自所述喷雾干燥的干燥(或部分干燥)产物借助于重力转移到所述冷冻室中的设备。
-一种工艺，其中在至多300℃、有利地20℃到250℃且更优选100℃到200℃的干燥气体入口温度实施所述喷雾干燥步骤。
-一种工艺，其中所述喷雾干燥步骤在20℃到200℃范围的温度进行和/或优选保持1秒到120秒的时间段。
-一种工艺，其中在所述喷雾干燥步骤之后，液滴具有20到400微米且优选50到300微米的大小。
-一种工艺，其中在所述喷雾干燥步骤之后，与起始悬浮液相比，液滴的水含量降低至少20重量％、优选至少40重量％、至少60重量％或至少75重量％。
-一种工艺，其中在所述干燥步骤之后，与起始悬浮液/溶液相比，液滴的液体(例如水)含量降低至少5重量％、优选至少10重量％。
-一种工艺，其中在所述干燥步骤之后，相对于液滴的总重量，液滴的液体(例如水)含量为20重量％到75重量％。
-一种工艺，其中在所述喷雾干燥步骤之后，相对于液滴的总重量，液滴的水含量为20重量％到85重量％(优选30重量％到80重量％或40重量％到75重量％)。
-一种工艺，其中冷冻干燥步骤的持续时间是适于获得粉末的残余水含量为至少0.15的粉末的时间。
-一种工艺，其中干燥气体含有小于5％，如小于2％的氧气。
-一种工艺，其中低温气体含有小于5％，如小于2％的氧气。
-一种工艺，其中干燥气体选自由以下组成的组：惰性气体(如氮气)、稀有气体(如氦气、氩气或氖气)等、二氧化碳和烷烃气体(如甲烷)和其混合物。
-一种工艺，其中低温气体选自由以下组成的组：惰性气体(如氮气)、稀有气体(如氦气、氩气或氖气)等、二氧化碳和烷烃气体(如甲烷)和其混合物。
-一种工艺，其中低温气体具有在-50到-250℃范围或-80到-160℃范围的(入口)温度。
-一种工艺，其中溶液或悬浮液进一步包含稳定材料/微生物的添加剂。所述添加剂可选自由以下组成的组：肌醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、麦芽糖糊精、脱脂乳粉、酵母提取物、酪蛋白胨、肌苷、肌苷一磷酸、谷氨酸单钠、酪蛋白酸钠和抗坏血酸钠、聚山梨糖醇酯。目前优选热不稳定材料(蛋白质或微生物):添加剂的比率在1:0.5到1:5，如1:1到1:4或1:11/2到1:3(干重w/w)的范围。
-一种工艺，其中微生物选自由以下组成的组：酵母(例如酵母属(Saccharomyces))、乳酸菌、链球菌属种(Streptococcus species)、乳杆菌属种(Lactobacillus species)、乳球菌属种(Lactococcus species)、明串珠菌属种(Leuconostoc species)、双歧杆菌属种(Bifidobacterium species)、酒球菌属种(Oenococcus species)、芽孢杆菌属种(Bacillus species)。
-一种工艺，其中微生物选自由链球菌属种，如嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)组成的组。
-一种工艺，其中微生物选自由双歧杆菌属种，如动物双歧杆菌乳亚种(B.animalis ssp.lactis)或长双歧杆菌(B.longum)组成的组。
-一种工艺，其中微生物选自由乳杆菌属种，如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)或保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)组成的组。
-一种工艺，其中微生物选自由乳球菌属种，如乳酸乳球菌(L.actis)或乳脂乳球菌(L.cremoris)组成的组。
-一种工艺，其中微生物选自由芽孢杆菌属种，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)组成的组。
-一种工艺，该工艺在根据本发明的设备中，如在基本上如图1、图4、图5和/或图6中所描绘的设备中进行。
在第二方面，本发明涉及通过任何上述工艺可获得的产物。在目前优选的实施方案中，所述产物可被包装(例如在气密容器中)。
在一个具体实施方案中，在喷雾之前将添加剂添加到热不稳定材料中，尤其是如果将使所述材料经受冷冻干燥的话。所述添加剂优选为在冷冻期间保护所述材料的不同化合物的混合物。优选的添加剂包括5-50％抗坏血酸(或抗坏血酸盐)、5-50％肌醇和5-50％谷氨酸盐(呈干燥形式，w/w)。此类添加剂也是本发明的一部分。
在第三方面，本发明涉及可用于任何上述工艺中的设备，例如包括室的设备，所述室具有：i)用于雾化悬浮液的雾化构件，ii)用于干燥气体的入口(任选地整合在所述雾化构件中)，iii)用于低温气体的入口，和iv)任选地与旋风分离器连接的出口，例如基本上如图1或图4上所描绘的设备。
第三方面的一个引人关注的实施方案是本发明的设备，其包括两室塔(其中第一室被放置在第二室上方)，其中第一(上)室(11)包括i)用于雾化悬浮液的雾化构件(5)，和ii)用于干燥气体的入口(任选地整合在所述雾化构件中)；并且第二(下)室(12)包括i)用于低温气体的入口，和ii)耦合到第一旋风分离器(14)的出口。应当理解，通过将第一室放置在第二室上方，所述室被连接，使得(部分)干燥的粒子将借助于重力从第一室下落到第二室中。
再一实施方案涉及包括第一(上)室(11)和第二(下)室(12)的设备(如喷雾塔)，其中所述上室包括
-用于雾化悬浮液或溶液的构件(5)；和
-用于干燥气体(1)的入口，和
-用于将干燥气体加热到在20℃到250℃范围的温度的构件(3)；
并且其中所述下室包括
-用于低温气体(4)的入口(适于具有在-50到-250℃范围的温度的气体)和任选的用于储存所述低温气体的罐；和
-用于冷冻产物的出口，所述出口连接到旋风分离器(13)；并且其中所述上室被放置成使得所述(部分)干燥的粒子下落到所述下室中以用于随后的冷冻。
一个引人关注的实施方案是一种设备，如根据前一实施方案的设备，其包括第一(上)室和第二(下)室，其中所述上室包括
-用于雾化悬浮液或溶液的构件；和
-注入干燥气体的构件；和
-用于供应温度在20℃到250℃范围的所述干燥气体的构件；
并且其中所述下室包括
-用于注入低温气体的构件；和
-用于供应温度在-50℃到-250℃范围的所述低温气体的构件；和
-用于冷冻产物的出口，所述出口优选连接到旋风分离器。
在一个目前优选的实施方案中，第一室连接到用于加热干燥气体的加热器。还优选第二室连接到适于低温气体的罐。
在设备应当在不同于环境压力的压力下操作的情况下，所述设备应当包括用于降低第一室和/或第二室中的压力(例如，到低于0.9巴的压力)的构件，或用于增加第一室和/或第二室中的压力(例如，到高于1.1巴的压力)的构件。
目前优选第一室具有允许悬浮液/溶液中的至少5％的液体在通过期间蒸发的高度，并且其中第二室具有允许从上室进入的产物完全冷冻的高度。在一个实施方案中，第一室是基本上圆柱形，并且具有0.5到5m的直径和为直径1到4倍的高度。在再一实施方案中，第二室是基本上圆柱形，并且具有0.5到5m的直径和为直径1到2倍的高度。在一个优选实施方案中，第一室和第二室连接，使得第一室是基本上圆柱形的结构的上部，并且第二室是基本上圆柱形的结构的下部，所述基本上圆柱形的结构具有0.5到5m的直径和为直径2到6倍的总高度。
所述设备可进一步包括耦合到第一旋风分离器的材料出口的第二旋风分离器。有利地，本发明的设备进一步包括第一旋风分离器和第二旋风分离器之间的气体入口，使得气体将从第一旋风分离器排出的材料输送到第二旋风分离器。所述气体可以是低温气体，和/或含有小于5％氧气，如小于2％氧气的气体。所述气体可选自由以下组成的组：惰性气体(如氮气)、稀有气体(如氦气、氩气或氖气)等、二氧化碳和烷烃气体(如甲烷)和其混合物。
在一个优选实施方案中，如所述(参见图1)使用以下设备：
主要惰性气体供应(a)连接到气体加热器(b)的入口。所述气体加热器连接到组合的喷雾干燥/冷冻室顶部入口(d)，并将惰性气体加热到由入口控制回路(c)设定的入口温度。
液体进料供应(e)连接到液体进料泵(f)的吸入侧，所述液体进料泵(f)将液体制剂泵送到组合的喷雾干燥/冷冻室(d)的顶部上的雾化装置(g)。雾化装置(g)将液体进料喷雾成一团气溶胶液滴，所述气溶胶液滴通过消耗由加热的惰性气体供应的热量而干燥成部分脱水的液滴。
当部分脱水的液滴连同现在冷却且潮湿的惰性气体一起离开组合的喷雾干燥/冷冻室(d)的上部温热区段时，当它们进入组合的喷雾干燥/冷冻室(d)的液氮冷却的下区段时，两者均快速冷却。冷氮气将微观水晶体以及现在冷冻的部分脱水产物拉向室出口，并将微粒朝向下游旋风分离器(h)气动地运输，其中从惰性气体和微观冰晶中分离冷冻的部分脱水粒子。冷的惰性气体和微观冰晶被引导到温水洗涤器单元(i)，并且下游排气风扇(j)产生由室压力控制回路(k)设定的所需室压力。为了改善对组合的干燥/冷冻室出口温度的控制，使用出口温度控制回路(l)来控制液氮注入(y)。
在最后一方面，本发明涉及本发明的设备的用途，其中将干燥气体(具有在20℃到250℃范围的温度)和含有蛋白质或微生物的液体喷雾到上室中；并且将低温气体(具有在-50到-250℃范围的温度)喷雾到下室中。
定义
如本文所用的术语“乳酸菌”(LAB)指革兰氏阳性的微需氧或厌氧细菌，其发酵糖并产生酸，包含作为主要产生酸的乳酸、乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸菌被发现于“乳杆菌(Lactobacillales)”目内，该目包括乳球菌属种、链球菌属种、乳杆菌属种、明串珠菌属种、假明串珠菌属种(Pseudoleuconostoc spp.)、片球菌属种(Pediococcus spp.)、短杆菌属种(Brevibacterium spp.)、肠球菌属种(Enterococcus spp.)和丙酸杆菌属种(Propionibacterium spp.)。另外，属于严格厌氧菌双歧杆菌的乳酸生产菌(即双歧杆菌属种)通常包括在所述乳酸菌群中。它们经常单独或与其它乳酸菌组合用作食物培养物。LAB的引人关注的种选自包括以下种和亚种的菌株的组：两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、动物双歧杆菌乳亚种、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruckiibulgaricus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、嗜热链球菌、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentoceus)、布赫内氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、小片球菌(Pediococcus pervulus)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichi)、詹氏丙酸杆菌(Propionibacterium jenseni)和其混合物。
术语“LAB”还包括菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)、干酪乳杆菌(LC-431)、乳酸乳球菌(R704)、动物双歧杆菌乳亚种(BB-12)、嗜热链球菌(ST-Fe2)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)(LB CH-2)。
在本上下文中，术语“喷雾干燥”意指从溶液或悬浮液中部分去除液体(例如水)，即浓缩含期望微生物或蛋白质的溶液/悬浮液。在本发明的喷雾干燥工艺中，目前优选去除液滴中的10％到70％的水，和/或喷雾干燥后的产物中的干热不稳定材料(微生物/蛋白质)的比率已增加超过25％但小于400％(与起始材料的比率相比)。因此，喷雾干燥后的产物优选液体或湿产物，而不是干燥粉末。目前优选具有微生物的液体(例如含水)悬浮液或具有蛋白质的液体(例如含水)溶液。通过不完全干燥产物，较少的热不稳定材料被灭活。本领域技术人员知道如何确保所述材料不被灭活，例如，通过降低干燥气体的温度和/或减少与干燥气体的接触时间，和/或通过减小液滴不得不在喷雾干燥室中行进的距离。
如果使喷雾冷冻后的产物经受冷冻干燥，则目前优选所得产物的水活度(aw)低于0.2。
在本上下文中，术语在适合的包装中“包装”(适合量的)冷冻或干燥的微生物涉及最终包装以获得可运送到顾客的产品。因此适合的包装可以是容器、瓶或类似物，并且适合的量可以是例如1g到30000g，但目前优选包装中的微生物的量为50g到10000g。
除非本文另外指明或者上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在下文权利要求书的上下文中)所用术语“一(a和an)”和“所述”以及类似指示物应当理解为涵盖单数与复数二者。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当理解为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指明，否则本文叙述的值的范围仅仅意在作为个别地表示此范围内的每一单独值的简化方法，并且每一单独值都被并入本说明书中，就如同其在本文中被个别地叙述一样。除非本文另有指明或上下文明显矛盾，否则，本文所描述的所有方法都可按任何合适的顺序进行。除非另外要求保护，否则，使用本文所提供的任何和所有实例或示例性用语(例如，“诸如”)仅仅意在用于更好地阐明本发明，而并不对本发明范围构成限制。本说明书中的任何用语都不应当理解为表明任何非要求保护的要素对于实施本发明是必不可少。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。本领域普通技术人员在阅读上述说明后可明白那些优选实施方案的变化形式。本发明人预期本领域技术人员适当地采用此类变化形式，并且本发明人预期本发明以不同于本文具体描述的其它方式实施。因此，本发明包括所附权利要求中所陈述主题的所有修改和等同，如可适用的法律所允许。此外，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素以其所有可能变化形式的任何组合。
附图
图1描绘了可根据本发明使用的优选喷雾干燥装备
(a)干燥气体供应
(b)干燥气体加热器
(c)入口温度控制回路
(d)组合的喷雾干燥/冷冻室
(e)液体进料供应
(f)液体进料泵
(g)雾化装置
(h)旋风分离器
(i)温水洗涤器单元
(j)排气风扇
(k)室压力控制回路
(l)出口温度控制回路
(m)粉末排出
(y)低温气体入口
图2描绘了菌株ST-44在-20℃和+5℃储存3个月后的稳定性数据，参见实施例4。
图3描绘了菌株ST-4895在-20℃和+5℃储存3个月后的稳定性数据，参见实施例2。
图4描绘了根据本发明的喷雾干燥/冷冻设备
1.干燥气体供应
2.供气风扇
3.加热器
4.低温气体供应
5.喷嘴(显示了任选的气体供应)
6.液体进料
7.液体进料罐
8.蛋白质或微生物悬浮液，任选具有冷冻保护剂
9.水入口
10.液体进料泵
11.干燥室
12.冷冻室
13.冷冻粉末排出
14.旋风分离器
15.排气风扇
16.排气
T.温度调节器
P.压力调节器
F.干燥气体调节器
图5和图6描绘了所述设备的优选实施方案
实验
实施例1
将1281g嗜热链球菌(菌株ST-Fe 2)浓缩物的样品保持在<5℃。这含有1.7E+11CFU/g，具有大约12.8％(w/w)干固体。与此平行，通过在搅拌下将以下成分添加到470g冷自来水(大约10℃)中来制备579g溶液：33g抗坏血酸钠、32g酪蛋白酸钠、22g肌醇和22g谷氨酸单钠(MSG)。
将样品和添加剂溶液混合。这产生具有大约14.6％(w/w)待喷雾干燥的干燥固体的1.86kg液体制剂。该液体制剂现在含有大约1.2E+11CFU/g，并且在整个测试中保持为冷(<5℃)。
对GEA Niro Mobile Minor实验室喷雾干燥器加以改良，以适应使用两个380mm的顶部延伸区段进行喷雾干燥，之后在标准喷雾室的下部固定区段中注入液氮，以适应来自所述室的上部区段的部分脱水产物液滴的原位冷冻。向上部喷雾干燥区段供应加热的纯氮干燥气体，并向下部冷冻区段供应能够产生比-100℃冷的冷冻微粒的液氮。
使用保持在大约100kg/h的质量流速的氮干燥气体将上部喷雾干燥器区段入口温度保持在190℃。使用2流体喷嘴(Schlick 0-2)用于雾化上述液体制剂，使用等同于0.8巴(g)的雾化压力的大约5kg/h(氮气)的雾化气流。
将液体制剂喷雾到上部喷雾干燥器区段中。进料速率保持在2kg/h，并且喷雾干燥/冷冻室出口温度保持在-140到-110℃范围。
在下游旋风分离器下方收集平均粒度为105微米的自由流动的冷冻粉末。55min后已收集了约1100g部分脱水的冷冻制剂，其对应于约70％的产率。水分含量现在为18.5％(w/w)，其被测量为在Sartorious IR上在115℃的总挥发物。这对应于我们的产物中大约24％(w/w)的总水量的减少。
得到的部分脱水的冷冻粉末现在含有1.5E+11CFU/g。将冷冻粉末冷冻干燥，在0.3毫巴的室压力下进行，温度以1.5℃/min从-42℃增加到32℃。当产物的重量已恒定/稳定至少2小时时，结束冷冻干燥。干燥产物在5℃储存3个月后具有可接受的稳定性(pH 5.6，如使用标准CINAC分析所测量)。
实施例2
使用相同的装备、条件和添加剂溶液，但使用菌株ST-4895，重复实施例1。因此，将1281g嗜热链球菌菌株ST-4895浓缩物的样品与579g添加剂溶液混合，产生具有大约14.6％(w/w)待喷雾干燥的干燥固体的1.86kg液体制剂。该液体制剂现在含有大约1.2E+11CFU/g。干燥并冷冻后，获得冷冻粉末。
将喷雾冷冻的粉末冷冻干燥(参见实施例1)。将干燥产物的稳定性与从ST-4895的“标准”颗粒冷冻浓缩物获得的冷冻干燥产物进行比较。通过使用标准CINAC分析来检查冷冻干燥产物的性能。关于三个月的稳定性数据，参见图3。通过根据本发明的工艺产生的产物即使与颗粒冷冻产物相比也是稳定的。
实施例3
使用相同的装备、条件和添加剂溶液，但使用嗜热链球菌菌株ST-143，重复实施例1。因此，将1281g嗜热链球菌(菌株ST-143)浓缩物的样品与579g添加剂溶液混合。这产生具有大约14.6％(w/w)待喷雾干燥的干燥固体的1.86kg液体制剂。该液体制剂现在含有大约1.2E+11CFU/g。干燥并冷冻后，获得冷冻粉末。
实施例4
使用相同的装备、条件和添加剂溶液，但使用嗜热链球菌菌株ST-44，重复实施例1。因此，将1281g菌株ST-44浓缩物的样品与579g添加剂溶液混合。
这产生具有大约14.6％(w/w)待喷雾干燥的干燥固体的1.86kg液体制剂。该液体制剂现在含有大约1.2E+11CFU/g。干燥并冷冻后，获得冷冻粉末。
将喷雾冷冻粉末如实施例1中进行冷冻干燥，并将干燥产物的稳定性与通过冷冻干燥ST-44的颗粒冷冻浓缩物(如实施例2中的方法)获得的产物进行比较。关于三个月的稳定性数据，参见图2。根据本发明产生的产物即使与颗粒冷冻产物相比也是稳定的。
实施例5
将2640g动物双歧杆菌乳亚种(菌株)浓缩物的样品保持在<5℃。这含有2E+11CFU/g，具有大约14.5％(w/w)干固体。与此平行，通过在搅拌下将以下成分添加到876g冷自来水(大约10℃)中来制备1080g溶液：60g抗坏血酸钠、79g脱脂乳粉、33g肌醇和33g MSG。将样品和添加剂溶液混合。这产生具有大约15.7％(w/w)待喷雾干燥的干燥固体的3.72kg液体制剂。该液体制剂现在含有大约1.4E+11CFU/g，并且在整个测试中保持为冷(<5℃)。在如实施例1中进行干燥和冷冻后，获得冷冻粉末。将冷冻粉末冷冻干燥，并且干燥的产物在5℃储存3个月后具有可接受的细胞计数(2.9E+11CFU/g)。
实施例6
将1145g保加利亚乳杆菌(菌株LB CH-2)浓缩物的样品保持在<5℃。这含有1.1E+11CFU/g，具有大约11.5％(w/w)干固体。与此平行，通过在搅拌下将以下成分添加到282g冷自来水(大约10℃)中来制备375g溶液：27g抗坏血酸钠、36g脱脂乳粉、15g肌醇和15g MSG。将样品和添加剂溶液混合。这产生具有大约14.7％(w/w)待喷雾干燥的干燥固体的1.52kg液体制剂。该液体制剂现在含有大约8.5E+10CFU/g，并且在整个测试中保持为冷(<5℃)。在如实施例1中进行干燥和冷冻后，获得冷冻粉末。将冷冻粉末冷冻干燥，并且干燥的产物在5℃储存3个月后具有可接受的稳定性(pH6，如使用标准CINAC分析所测量)。
参考文献
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WO15063090A2、WO14029758A1、WO14029783A1(Chr Hansen A/S)
粒度分析-激光衍射方法的ISO 13320:2009标准
本专利文献中引用的所有参考文献均在此以引用方式整体并入本文。

Claims (52)

1.一种用于保存微生物(尤其是LAB(乳酸菌))的方法，如通过冷冻和干燥来保存，其包括以下步骤：
a)制备含有所述微生物的含水(或液体)悬浮液的液滴，例如通过喷雾所述悬浮液制备含有所述微生物的含水(或液体)悬浮液的液滴；和
b)使所述液滴与干燥气体接触；和
c)使由前一步骤产生的所述液滴与低温气体接触；和
d)任选地使来自前一步骤的所得冷冻产物经受进一步干燥步骤，例如减压干燥，例如，冷冻干燥；和
e)任选地包装所述微生物，例如在气密和/或不透水的包装中包装所述微生物。
2.一种用于干燥含有微生物(尤其是LAB)的悬浮液的方法，其特征在于：
c)在喷雾室中将含有微生物的含水悬浮液喷雾到低温气体中；和
d)收集来自前一步骤的冷冻产物并冷冻干燥直到实现小于0.20的水活度。
3.一种用于干燥含有微生物(尤其是LAB)的悬浮液的方法，其特征在于：
b)在喷雾室中将含有微生物的含水悬浮液喷雾到干燥气体中；
c)使来自前一步骤的产物与室中的低温气体接触；和
d)收集来自前一步骤的冷冻粉末并冷冻干燥直到实现小于0.20的水活度。
4.一种用于干燥含有蛋白质(例如酶、激素、人蛋白质、治疗活性蛋白质或脂蛋白)或微生物(例如细菌、LAB、酵母、真菌、植物细胞、动物细胞或病毒)的溶液或悬浮液(或从所述溶液或悬浮液去除液体)的方法，其特征在于：
a)制备所述悬浮液或溶液的液滴，例如通过喷雾所述溶液或悬浮液制备所述悬浮液或溶液的液滴；和
b)使所述液滴与干燥气体接触；和
c)使步骤b)中获得的所述液滴与低温气体接触；和
d)使来自前一步骤的所得冷冻产物经受进一步干燥步骤，例如减压干燥，例如，冷冻干燥；和
e)任选地包装所述产物，如在气密和/或不透水的包装中包装所述产物。
5.一种用于通过以下方式冷冻含有微生物(尤其是LAB)的悬浮液的方法：
●将所述悬浮液喷雾到含有干燥气体的室中；和
●通过与室中的低温气体接触来冷冻来自前一步骤的产物；和
●任选地包装冷冻的悬浮液，例如在气密和/或不透水的包装中。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述喷雾借助于喷雾喷嘴(雾化装置)，例如超声波喷嘴；压力喷嘴；双流体喷嘴(例如使用N2作为雾化气体)；或旋转雾化装置来实施，所述雾化优选产生具有10到500微米的大小，例如具有选自以下范围中的一个的大小的液滴：15到400、20到350、50到350、100到350、20到300、20到200、50到300、50到200、100到300或100到200，所述大小以微米测量为Dv90值。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述冷冻产物(例如来自冷冻步骤的粉末)借助于旋风分离器(优选具有跨越所述旋风分离器大约100mm水柱的最大差压降)或静电过滤器来收集。
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于喷雾干燥步骤在60到200kPa范围，例如在80到150kPa、或60到120kPa、70到110kPa、或105到140kPa范围的压力下进行。
9.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于冷冻步骤在60到200kPa范围，例如在80到150kPa、或60到120kPa、70到110kPa、或105到140kPa范围的压力下进行。
10.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于(所述冷冻产物的)最终干燥步骤在减压下进行，例如通过冷冻干燥，优选达到低于0.20的水活度。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在喷雾干燥器中“保留时间”小于2分钟，并且优选将所得喷雾干燥(或部分干燥)产物直接引入冷冻室中，如通过使用其中将来自喷雾干燥的干燥(或部分干燥)产物借助于重力转移到所述冷冻室中的设备。
12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在至多300℃、有利地20℃到250℃且更优选100℃到200℃的干燥气体入口温度实施喷雾干燥步骤。
13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中喷雾干燥步骤在20℃到250℃范围，例如在30到230℃范围或在60到200℃范围的温度进行。
14.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之后，所述液滴具有20到400微米且优选50到300微米的大小。
15.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之后，与起始悬浮液/溶液相比，所述液滴的液体(例如水)含量降低至少5重量％、优选至少10重量％、至少0重量％、至少40重量％、或至少60重量％。
16.根据前述权利要求所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之后，相对于所述液滴的总重量，所述液滴的液体(例如水)含量为20重量％到85重量％(优选30重量％到80重量％，或40重量％到75重量％)。
17.根据任一前述权利要求所述的方法，其中冷冻干燥步骤的持续时间是适于获得粉末的残余水含量为至少0.15的所述粉末的时间。
18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述干燥气体含有小于5％，例如小于2％的氧气。
19.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述低温气体含有小于5％，例如小于2％的氧气。
20.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述干燥气体选自由以下组成的组：惰性气体(例如氮气)、稀有气体(例如氦气、氩气或氖气)等、二氧化碳和烷烃气体(例如甲烷)和其混合物。
21.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述低温气体选自由以下组成的组：惰性气体(例如氮气)、稀有气体(例如氦气、氩气或氖气)等、二氧化碳和烷烃气体(例如甲烷)和其混合物。
22.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述低温气体具有在-50到-250℃范围或在-80到-160℃范围的入口温度，和/或所述低温气体在冷冻步骤期间具有-20℃到150℃或-50℃到-100℃的温度。
23.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述溶液或悬浮液进一步包含稳定材料/微生物的添加剂。
24.根据前述权利要求所述的方法，其中所述添加剂选自由以下组成的组：肌醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、麦芽糖糊精、脱脂乳粉、酵母提取物、酪蛋白胨、肌苷、肌苷一磷酸、谷氨酰胺和其盐(例如谷氨酸单钠)、酪蛋白或其盐(例如酪蛋白酸钠)、抗坏血酸和其盐(例如抗坏血酸钠)和聚山梨糖醇酯。
25.根据前述权利要求所述的方法，其中热不稳定材料(蛋白质或微生物):添加剂的比率处于1:0.1到1:10或1:0.5到1:5，例如1:1到1:4或1:11/2到1:3(干重w/w)范围。
26.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述微生物选自由以下组成的组：酵母(例如酵母属(Saccharomyces))、乳酸菌、链球菌属种(Streptococcus species)、乳杆菌属种(Lactobacillus species)、乳球菌属种(Lactococcus species)、明串珠菌属种(Leuconostoc species)、双歧杆菌属种(Bifidobacterium species)、酒球菌属种(Oenococcus species)和芽孢杆菌属种(Bacillus species)。
27.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述微生物选自由链球菌属种，例如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)组成的组。
28.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述微生物选自由双歧杆菌属种，例如动物双歧杆菌乳亚种(B.animalis ssp.lactis)或长双歧杆菌(B.longum)组成的组。
29.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述微生物选自由乳杆菌属种，例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)或保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)组成的组。
30.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述微生物选自由乳球菌属种，例如乳酸乳球菌(L.actis)或乳脂乳球菌(L.cremoris)组成的组。
31.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述微生物选自由芽孢杆菌属种，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)组成的组。
32.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是芽孢杆菌属种的代谢物，例如枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的代谢物。
33.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是酶(例如天冬氨酸蛋白酶(例如凝乳酶)、蛋白酶或乳糖酶或脂肪酶)。
34.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是乳蛋白质，例如乳清或酪蛋白。
35.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是治疗活性蛋白质，例如激素、胰岛素、生长因子或抗体。
36.一种能通过根据任一前述权利要求所述的方法获得的产物。
37.根据前述权利要求所述的产物，其被包装(例如在气密容器中)。
38.一种可用于根据任一前述权利要求所述的方法中的设备，例如包括室的设备，所述室具有：i)用于雾化所述悬浮液的雾化构件，ii)用于干燥气体的入口(任选地整合在所述雾化构件中)，iii)用于低温气体的入口，和iv)任选地与旋风分离器连接的出口，例如基本上如图1或图4上所描绘的设备。
39.根据前述权利要求所述的设备，其包括两室塔(其中第一室被放置在第二室上方)，其中所述第一(上)室(11)包括i)用于雾化所述悬浮液的雾化构件(5)，和ii)用于所述干燥气体的入口(任选地整合在所述雾化构件中)；并且所述第二(下)室(12)包括i)用于低温气体的入口，和ii)耦合到第一旋风分离器(14)的出口。
40.一种包括第一(上)室(11)和第二(下)室(12)的设备(如喷雾塔)，其中所述上室包括
-用于雾化悬浮液或溶液的构件(5)；和
-用于干燥气体(1)的入口，和
-用于将干燥气体加热到在20℃到250℃范围的温度的构件(3)；
并且其中所述下室包括
-用于低温气体(4)的入口(适于具有在-50到-250℃范围的温度的气体)和任选的用于储存所述低温气体的罐；和
-用于冷冻产物的出口，所述出口连接到旋风分离器(13)；并且其中所述上室被放置成使得(部分)干燥的粒子下落到所述下室中以用于随后的冷冻。
41.一种设备，例如根据前述权利要求所述的设备，其包括第一(上)室和第二(下)室，其中所述上室包括
-用于雾化悬浮液或溶液的构件；和
-注入干燥气体的构件；和
-用于供应温度在20℃到250℃范围的所述干燥气体的构件；
并且其中所述下室包括
-用于注入低温气体的构件；和
-用于供应温度在-50℃到-250℃范围的所述低温气体的构件；和
-用于冷冻产物的出口，所述出口优选连接到旋风分离器。
42.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述第一室连接到用于加热所述干燥气体的加热器。
43.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述第二室连接到适于低温气体的罐。
44.根据任一前述权利要求所述的设备，其包括用于降低所述第一室和/或所述第二室中的压力(例如降低到低于0.9巴的压力)的构件。
45.根据任一前述权利要求所述的设备，其包括用于增加所述第一室和/或所述第二室中的压力(例如增加到高于1.1巴的压力)的构件。
46.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述上室具有允许所述悬浮液/溶液中的至少5％的液体在通过期间蒸发的高度，并且其中所述下室具有允许从所述上室进入的产物完全冷冻的高度。
47.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述第一室是基本上圆柱形，并且具有0.5到5m的直径和为所述直径1到4倍的高度。
48.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述第二室是基本上圆柱形，并且具有0.5到5m的直径和为所述直径1到2倍的高度。
49.根据任一前述权利要求所述的设备，其中所述第一室和第二室连接，使得所述第一室是基本上圆柱形的结构的上部，并且所述第二室是所述基本上圆柱形的结构的下部，所述基本上圆柱形的结构具有0.5到5m的直径和为所述直径2到6倍的总高度。
50.根据任一前述权利要求所述的设备的用途，其中将干燥气体(具有在20℃到250℃范围的温度)和含有蛋白质或微生物的液体喷雾到所述上室中；并且将低温气体(具有在-50到-250℃范围的温度)喷雾到所述下室中。
51.根据权利要求1到35中任一项所述的方法，所述方法在根据权利要求38到49中任一项所述的设备中进行。
52.根据权利要求1到35中任一项所述的方法，所述方法在基本上如图1、图4、图5和/或图6中所描绘的设备中进行。
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