CN107108753A - C1酯酶抑制剂融合蛋白及其用途 - Google Patents
C1酯酶抑制剂融合蛋白及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107108753A CN107108753A CN201580067942.4A CN201580067942A CN107108753A CN 107108753 A CN107108753 A CN 107108753A CN 201580067942 A CN201580067942 A CN 201580067942A CN 107108753 A CN107108753 A CN 107108753A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fusion protein
- days
- seq
- amino acid
- people
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 530
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 529
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 77
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 454
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 431
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 427
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 349
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 224
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 213
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 182
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 182
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 54
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 51
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 39
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 39
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 39
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 claims description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 30
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 27
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 20
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 19
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 11
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 11
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 11
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 11
- 101150050927 Fcgrt gene Proteins 0.000 claims description 10
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 8
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 8
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims description 7
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 claims description 7
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 108010028774 Complement C1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100025292 Stress-induced-phosphoprotein 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 5
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000030939 Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy Diseases 0.000 claims description 4
- 101001081555 Homo sapiens Plasma protease C1 inhibitor Proteins 0.000 claims description 4
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 4
- 102000044507 human SERPING1 Human genes 0.000 claims description 4
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 claims description 3
- 206010042033 Stevens-Johnson syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 3
- 206010044223 Toxic epidermal necrolysis Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000087 Toxic epidermal necrolysis Toxicity 0.000 claims description 3
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 claims description 3
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 claims description 3
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 claims description 3
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 claims description 3
- 238000001354 calcination Methods 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010065579 multifocal motor neuropathy Diseases 0.000 claims description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008795 neuromyelitis optica Diseases 0.000 claims description 3
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 claims description 3
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 206010057645 Chronic Inflammatory Demyelinating Polyradiculoneuropathy Diseases 0.000 claims 1
- 102000016917 Complement C1 Human genes 0.000 claims 1
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 claims 1
- 230000007824 polyneuropathy Effects 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 47
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 46
- 108700040183 Complement C1 Inhibitor Proteins 0.000 abstract description 33
- 102000055157 Complement C1 Inhibitor Human genes 0.000 abstract description 33
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 21
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 114
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 100
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 87
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 86
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 58
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 54
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 51
- 230000008859 change Effects 0.000 description 37
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 31
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 206010019860 Hereditary angioedema Diseases 0.000 description 22
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Chemical group 0.000 description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 18
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 16
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 14
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 13
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 13
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 13
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 12
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 10
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 102100025406 Complement C1s subcomponent Human genes 0.000 description 7
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000306 component Substances 0.000 description 7
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 6
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 208000034628 Celiac artery compression syndrome Diseases 0.000 description 5
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 5
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 5
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 5
- 108700005721 conestat alfa Proteins 0.000 description 5
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 4
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 3
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 3
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102000047612 human CCN2 Human genes 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 210000003360 nephrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- -1 phenmethylol Substances 0.000 description 3
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229940009560 ruconest Drugs 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 230000010148 water-pollination Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 2
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 2
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 2
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- 108010093008 Kinins Proteins 0.000 description 2
- 102000002397 Kinins Human genes 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 208000029067 Neuromyelitis optica spectrum disease Diseases 0.000 description 2
- 101000690429 Panax ginseng Floral homeotic protein AGAMOUS Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100032859 Protein AMBP Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 101000828148 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Transposon Ty3-G Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 101000790437 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Transposon Ty3-I Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 2
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 2
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000017529 Serpin domains Human genes 0.000 description 2
- 108050005787 Serpin domains Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 2
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 2
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 2
- 229940009550 c1 esterase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 229960005020 conestat alfa Drugs 0.000 description 2
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000002329 esterase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- FTLYMKDSHNWQKD-UHFFFAOYSA-N (2,4,5-trichlorophenyl)boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl FTLYMKDSHNWQKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150020357 ADE8 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 101000689231 Aeromonas salmonicida S-layer protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 208000028185 Angioedema Diseases 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 102100030981 Beta-alanine-activating enzyme Human genes 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101800001982 Cholecystokinin Proteins 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 102100030563 Coagulation factor XI Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 235000014466 Douglas bleu Nutrition 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 101000930875 Drosophila melanogaster Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 229940122601 Esterase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 101710162677 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101000773364 Homo sapiens Beta-alanine-activating enzyme Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000797623 Homo sapiens Protein AMBP Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101800001691 Inter-alpha-trypsin inhibitor light chain Proteins 0.000 description 1
- 108010025252 Kassinin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 101000822667 Mus musculus Something about silencing protein 10 Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 1
- 241001465803 Orgyia pseudotsugata Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 108050007539 Plasma protease C1 inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102100027637 Plasma protease C1 inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 102100038124 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 240000001416 Pseudotsuga menziesii Species 0.000 description 1
- 235000005386 Pseudotsuga menziesii var menziesii Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 101100085270 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ade5 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101000748795 Thermus thermophilus (strain ATCC 27634 / DSM 579 / HB8) Cytochrome c oxidase polypeptide I+III Proteins 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 239000001785 acacia senegal l. willd gum Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000020244 animal milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000010692 aromatic oil Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 230000037058 blood plasma level Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 201000005795 chronic inflammatory demyelinating polyneuritis Diseases 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000000852 deltoid muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003210 demyelinating effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000013265 extended release Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 229940001501 fibrinolysin Drugs 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 108700004049 glycosylated serum Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 235000014413 iron hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L iron(ii) hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Fe+2] NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 108010059642 isinglass Proteins 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 210000003140 lateral ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 1
- 210000004705 lumbosacral region Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 229910052627 muscovite Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229940099990 ogen Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 208000029211 papillomatosis Diseases 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000003182 parenteral nutrition solution Substances 0.000 description 1
- 201000003045 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- NFIYTPYOYDDLGO-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;sodium Chemical compound [Na].OP(O)(O)=O NFIYTPYOYDDLGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108010067999 preproalbumin Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 229940099982 prolastin Drugs 0.000 description 1
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 229940085605 saccharin sodium Drugs 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000036299 sexual function Effects 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 208000035736 spondylodysplastic type Ehlers-Danlos syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 101150003389 tdh2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012749 thinning agent Substances 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/55—Protease inhibitors
- A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Cell Biology (AREA)
Abstract
本发明尤其提供用于治疗补体介导的疾病,特别是需要防治性治疗和/或维持治疗的慢性疾病的方法和组合物。在一个方面,提供相比于天然血浆源性C1‑INH,具有更长的半衰期的C1‑INH融合蛋白。在一些实施方案中,根据本发明的方法包括向罹患或易患补体介导的疾病的个体施用有效量的重组C1‑INH融合蛋白,以使所述补体介导的疾病的至少一种症状或特征得以预防和/或在强度、严重性或频率方面得以降低。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年10月31日提交的美国临时专利申请序列号62/073657的优先权,所述美国临时专利申请的公开内容据此以引用的方式整体并入本文。
背景
C1-抑制剂(C1-INH),也称为C1酯酶抑制剂,是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)蛋白质超家族的最大成员。它是一种被大量糖基化的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有抑制补体系统的自发性活化的主要功能。C1-INH调控补体级联系统,在调控接触(激肽释放酶(kallikrein)-激肽(kinin))放大级联方面起关键作用,并且参与调控凝血和纤维蛋白溶解系统。Karnaukhova,E.,C1-Esterase Inhibitor:Biological Activities andTherapeutic Applications.J Hematol Thromb Dis,1:113(2013)。
受试者中C1-INH功能异常和/或缺陷已与归因于C1-INH未能抑制补体系统的活化的多种自体免疫疾病相关联。此类疾病的一实例是遗传性血管性水肿(HAE),这是一种特征在于炎症不可预测且反复发作的罕见但潜在危急生命的病症。HAE发作的症状包括自发出现或由轻微创伤触发的面部、口腔和/或气道肿胀。此类肿胀也可出现在身体任何部分中。在一些情况下,HAE与低血浆水平的C1抑制剂相关,而在其它情况下,该蛋白质以正常量或升高量进行循环,但它是功能异常的。除炎症发作之外,这也可导致更严重或危急生命的适应症,诸如自体免疫疾病或红斑狼疮。
作为一种人血浆源性C1酯酶抑制剂,已被核准供防治性使用和治疗急性HAE发作。(也是一种血浆源性人C1-INH,CSL Behring)被指示用于治疗急性HAE发作。人血浆源性C1酯酶抑制剂的供应依赖于血液和血浆捐献品的可用性。(阿法可奈司他(conestat alfa),Pharming N.V.)作为一种在工程改造的兔中表达的重组C1-INH被指示用于静脉内(IV)施用来治疗急性HAE发作。然而,因为在兔中制备,所以它的糖基化特征不同于人血浆源性C1-INH的糖基化特征。结果是Ruconest具有约2.4-2.7小时的极其短暂半衰期。参见FDA标签和处方信息。
因此,本领域中仍然需要用于治疗各种C1酯酶介导的适应症的改进的C1酯酶抑制剂。
发明概述
本发明尤其提供可用于有效治疗各种补体介导的病症,并且可以有成本效益的方式(cost-effective matter)制造的改进的长效重组C1酯酶抑制剂。
具体而言,本发明提供相比于展现更长半衰期的C1酯酶抑制剂融合蛋白。在一些实施方案中,相比于血浆源性C1-INH,本发明的C1抑制剂融合蛋白展现类似或更长的半衰期。举例来说,本发明者已证明根据本发明的某些示例性C1抑制剂融合蛋白具有至少4天的延长的血清半衰期。预期重组C1抑制剂的长久血清半衰期导致优越的体内功效,并且允许达成更好的给药方案和施用途径。在某些实施方案中,相比于核准的C1抑制剂,本发明的C1抑制剂融合蛋白可以较小频率皮下施用,同时仍然实现所需功效(例如防治)。此外,本发明的C1抑制剂融合蛋白可在宿主细胞中重组产生以使公开的C1抑制剂融合蛋白不依赖于血液供应,不引起传播传染剂的风险,并且对于制造来说花费较少。因为它们在宿主细胞中重组产生,所以相比于从人血液、人血液组分(例如血浆)或动物乳汁纯化的那些产品,它们在产生和最终产品方面提供更大一致性。此外,本文提供的C1抑制剂融合蛋白不依赖于畜牧业考虑事项,包括动物年龄和/或成熟期、产奶量、动物疾病等,其全部可影响兔表达的C1-INH的数量与质量(例如糖基化特征、表达的蛋白质的异质性等)两者。因此,本发明提供对重组C1酯酶抑制剂的有成本效益且可靠的制造,以及对HAE和其它补体介导的病症的更安全、更有效的治疗。本发明的其它特征、目标和优势在随后详细描述中是显而易知的。然而,应了解尽管指示本发明的实施方案,但详细描述仅通过说明而非限制方式给出。在本发明的范围内的各种变化和修改将根据详细描述而变得为本领域技术人员显而易知。
在一个方面,本发明提供一种包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白。在一些实施方案中,人C1-抑制剂多肽包含与具有SEQ ID NO:1的全长人C1-抑制剂具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:1具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:1同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:1,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ IDNO:2具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:2具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:2具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:2具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:2具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:2同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:2,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域连接于所述人C1-抑制剂多肽的N末端。在一些实施方案中,Fc结构域是人IgG1Fc结构域。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域连接于所述人C1-抑制剂多肽的N末端。在一些实施方案中,Fc结构域源于人IgG1Fc结构域。在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与人IgG1Fc结构域SEQ ID NO:3具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与人IgG1Fc结构域SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与人IgG1Fc结构域SEQ ID NO:3具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与人IgG1Fc结构域SEQ ID NO:3具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与人IgG1Fc结构域SEQ ID NO:3同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:3,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含L234A突变。在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含L235A突变。在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含L234A突变和L235A突变。在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含L234A突变或L235A突变。
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含一个或多个延长包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的半衰期的突变。在一些实施方案中,Fc结构域的突变包括一个或多个突变,所述突变选自一个或多个对应于人IgG1的Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433和/或Asn 434的位置。
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含H433K突变。在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含N434F突变。在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含H433K突变和N434F突变。在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含H433K突变或N434F突变。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ IDNO:5具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:5具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:5具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:5具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:5具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:5同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:5,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ IDNO:6具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:6具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:6具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:6具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:6具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:6同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:6,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ IDNO:7具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:7具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:7具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:7具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:7同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:7,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ IDNO:8具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:8具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:8具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:8具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:8具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:8同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:8,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的任一个具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的任一个具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的任一个具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的任一个具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的任一个具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的任一个同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域连接于所述人C1-抑制剂多肽的N末端。在一些实施方案中,Fc结构域是人IgG4 Fc结构域。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域连接于所述人C1-抑制剂多肽的N末端。在一些实施方案中,Fc结构域源于人IgG4 Fc结构域。
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含与SEQ ID NO:9具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与人IgG4 Fc结构域SEQ ID NO:9具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与人IgG4 Fc结构域SEQ ID NO:9具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与人IgG4 Fc结构域SEQ ID NO:9具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与人IgG4 Fc结构域SEQ ID NO:9具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与人IgG4 Fc结构域SEQ ID NO:9同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:9,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包含S241P突变。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:10具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:10具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:10具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:10具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:10同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:10,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ IDNO:11具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:11具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:11具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:11具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:11具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:11同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:11,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ IDNO:12具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:12具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:12具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:12具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:12具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:12同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:12,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ IDNO:13具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:13具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:13具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:13具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:13具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:13同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:13,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ IDNO:14具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:14具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:14具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:14具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:14具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:14同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:14,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ IDNO:15具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:15具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:15具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:15具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:15具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:15同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:15,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含与SEQ IDNO:16具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:16具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:16具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:16具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:16具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包括与SEQ ID NO:16同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:16,包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白包含在所述人C1-抑制剂多肽与所述Fc结构域之间的接头。在一些实施方案中,接头是包含3-100个氨基酸的肽。
在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白结合FcRN。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白抑制C1酯酶活性。
在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域包含降低或消除ADCC活性的突变。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域包含一个或多个降低或消除ADCC活性的突变。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域包含降低或消除CDC活性的突变。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域包含一个或多个降低或消除CDC活性的突变。
在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域包含降低或消除FcγR结合的突变。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域包含一个或多个降低或消除FcγR结合的突变。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域包含降低或消除FcγR效应功能的突变。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域包含一个或多个降低或消除FcγR效应功能的突变。
在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域包含降低或消除C1q结合的突变。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述Fc结构域包含一个或多个降低或消除C1q结合的突变。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,降低或消除C1q结合的突变在所述Fc结构域中。
在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白抑制C1r和/或C1s蛋白酶活性和/或使C1r和/或C1s蛋白酶活性失活。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白抑制体外红血细胞的溶解。
在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,相比于血浆源性人C1-抑制剂,所述融合蛋白具有更长的半衰期。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白具有至少4天的半衰期。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白具有至少5天的半衰期。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白具有至少6天的半衰期。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白具有至少7天的半衰期。
在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白具有是或大于约12小时、18小时、24小时、36小时、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天、8天、8.5天、9天、9.5天或10天的体内半衰期。在一些实施方案中,重组C1-INH融合蛋白具有介于0.5与10天之间、介于1天与10天之间、介于1天与9天之间、介于1天与8天之间、介于1天与7天之间、介于1天与6天之间、介于1天与5天之间、介于1天与4天之间、介于1天与3天之间、介于2天与10天之间、介于2天与9天之间、介于2天与8天之间、介于2天与7天之间、介于2天与6天之间、介于2天与5天之间、介于2天与4天之间、介于2天与3天之间、介于2.5天与10天之间、介于2.5天与9天之间、介于2.5天与8天之间、介于2.5天与7天之间、介于2.5天与6天之间、介于2.5天与5天之间、介于2.5天与4天之间、介于3天与10天之间、介于3天与9天之间、介于3天与8天之间、介于3天与7天之间、介于3天与6天之间、介于3天与5天之间、介于3天与4天之间、介于3.5天与10天之间、介于3.5天与9天之间、介于3.5天与8天之间、介于3.5天与7天之间、介于3.5天与6天之间、介于3.5天与5天之间、介于3.5天与4天之间、介于4天与10天之间、介于4天与9天之间、介于4天与8天之间、介于4天与7天之间、介于4天与6天之间、介于4天与5天之间、介于4.5天与10天之间、介于4.5天与9天之间、介于4.5天与8天之间、介于4.5天与7天之间、介于4.5天与6天之间、介于4.5天与5天之间、介于5天与10天之间、介于5天与9天之间、介于5天与8天之间、介于5天与7天之间、介于5天与6天之间、介于5.5天与10天之间、介于5.5天与9天之间、介于5.5天与8天之间、介于5.5天与7天之间、介于5.5天与6天之间、介于6天与10天之间、介于7天与10天之间、介于8天与10天之间、介于9天与10天之间的体内半衰期。
在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白是单价的。在包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白是二聚的。
在一个方面,本发明提供一种包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白。在一些实施方案中,人C1-抑制剂多肽包含与具有SEQ ID NO:1的全长人C1-抑制剂具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:1具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQID NO:1同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:1,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包含与SEQID NO:2具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:2具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:2具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQID NO:2具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:2具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与全长人C1-抑制剂蛋白SEQ ID NO:2同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ IDNO:2,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述白蛋白连接于所述人C1-抑制剂多肽的N末端。。在一些实施方案中,白蛋白多肽包含人血清白蛋白的一个或多个结构域。在一些实施方案中,白蛋白多肽包含人血清白蛋白的D3结构域。在一些实施方案中,白蛋白多肽源于人血清白蛋白。。在一些实施方案中,白蛋白多肽是人血清白蛋白。
在一些实施方案中,适于本发明的白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:20具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与人白蛋白多肽SEQ ID NO:20具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与人白蛋白多肽SEQ ID NO:20具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与人白蛋白多肽SEQ ID NO:20具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与人白蛋白多肽SEQID NO:20具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与人白蛋白多肽SEQ ID NO:20同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:20,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,适于本发明的白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与人白蛋白多肽SEQ ID NO:17具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与人白蛋白多肽SEQ ID NO:17具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与人白蛋白多肽SEQ ID NO:17具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与人白蛋白多肽SEQID NO:17具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与人白蛋白多肽SEQ ID NO:17同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:17,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:18具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:18具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:18具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:18具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:18具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:18同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ IDNO:18,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:19具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:19具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:19具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:19具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:19具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:19同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ IDNO:19,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:21具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:21具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:21具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:21具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:21具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:21同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ IDNO:21,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:22具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:22具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:22具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:22具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:22至少95%同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:22同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:22,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包含与SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22中的任一个具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22中的任一个具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:21或SEQ ID NO:22中的任一个具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22中的任一个具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22中的任一个具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包括与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22中的任一个同一的氨基酸序列。在一些实施方案中,相较于SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22,包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白包含一个或多个截短、缺失、突变或插入。
在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白结合FcRN。在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白抑制C1酯酶活性。在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白抑制C1r和/或C1s蛋白酶活性和/或使C1r和/或C1s蛋白酶活性失活。在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白抑制体外红血细胞的溶解。
在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白包含在所述人C1-抑制剂多肽与所述白蛋白多肽之间的接头。在一些实施方案中,接头是包含3-100个氨基酸的肽。在一些实施方案中,接头包含序列GGG。在一些实施方案中,接头包含序列SEQ ID NO:27。
在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述白蛋白多肽不包含一个或多个选自由464His、510His、535His和/或其组合组成的组的突变。
在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,相比于血浆源性人C1-抑制剂,所述融合蛋白具有更长的半衰期。在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白具有至少4天的半衰期。在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白具有至少5天的半衰期。在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白具有至少6天的半衰期。在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白具有至少7天的半衰期。
在包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白的一些实施方案中,所述融合蛋白具有是或大于约12小时、18小时、24小时、36小时、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天、8天、8.5天、9天、9.5天或10天的体内半衰期。在一些实施方案中,重组C1-INH融合蛋白具有介于0.5与10天之间、介于1天与10天之间、介于1天与9天之间、介于1天与8天之间、介于1天与7天之间、介于1天与6天之间、介于1天与5天之间、介于1天与4天之间、介于1天与3天之间、介于2天与10天之间、介于2天与9天之间、介于2天与8天之间、介于2天与7天之间、介于2天与6天之间、介于2天与5天之间、介于2天与4天之间、介于2天与3天之间、介于2.5天与10天之间、介于2.5天与9天之间、介于2.5天与8天之间、介于2.5天与7天之间、介于2.5天与6天之间、介于2.5天与5天之间、介于2.5天与4天之间、介于3天与10天之间、介于3天与9天之间、介于3天与8天之间、介于3天与7天之间、介于3天与6天之间、介于3天与5天之间、介于3天与4天之间、介于3.5天与10天之间、介于3.5天与9天之间、介于3.5天与8天之间、介于3.5天与7天之间、介于3.5天与6天之间、介于3.5天与5天之间、介于3.5天与4天之间、介于4天与10天之间、介于4天与9天之间、介于4天与8天之间、介于4天与7天之间、介于4天与6天之间、介于4天与5天之间、介于4.5天与10天之间、介于4.5天与9天之间、介于4.5天与8天之间、介于4.5天与7天之间、介于4.5天与6天之间、介于4.5天与5天之间、介于5天与10天之间、介于5天与9天之间、介于5天与8天之间、介于5天与7天之间、介于5天与6天之间、介于5.5天与10天之间、介于5.5天与9天之间、介于5.5天与8天之间、介于5.5天与7天之间、介于5.5天与6天之间、介于6天与10天之间、介于7天与10天之间、介于8天与10天之间、介于9天与10天之间的体内半衰期。
在一个方面,本发明提供一种编码融合蛋白的核酸,所述融合蛋白是本文公开的包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白中的任一种。在另一方面,本发明提供一种编码融合蛋白的核酸,所述融合蛋白是本文公开的包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白中的任一种。
在一个方面,本发明提供一种包含编码融合蛋白的核酸的细胞,所述融合蛋白是本文公开的包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白中的任一种。在另一方面,本发明提供一种包含编码融合蛋白的核酸的细胞,所述融合蛋白是本文公开的包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白中的任一种。
在一些实施方案中,细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中,哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中,哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中,细胞被工程改造以修饰由细胞表达的蛋白质的糖基化。在一些实施方案中,细胞被工程改造以相较于尚未被工程改造的相同细胞,修饰由细胞表达的蛋白质的糖基化。在一些实施方案中,细胞被工程改造以使由细胞表达的蛋白质的糖基化增强、改进、增加和/或人源化。在一些实施方案中,细胞被工程改造以相较于尚未被工程改造的相同细胞,使由细胞表达的蛋白质的糖基化增强、改进、增加和/或人源化。在一些实施方案中,细胞被工程改造以修饰由细胞表达的蛋白质的唾液酸化。在一些实施方案中,细胞被工程改造以相较于尚未被工程改造的相同细胞,修饰由细胞表达的蛋白质的唾液酸化。在一些实施方案中,细胞被工程改造以使由细胞表达的蛋白质的唾液酸化增强、改进、增加和/或人源化。在一些实施方案中,细胞被工程改造以相较于尚未被工程改造的相同细胞,使由细胞表达的蛋白质的唾液酸化增强、改进、增加和/或人源化。
在一个方面,本发明提供一种产生融合蛋白的方法,其包括培养或培育包含编码融合蛋白的核酸的细胞的步骤,所述融合蛋白是本文公开的包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白中的任一种。在一个方面,本发明提供一种产生融合蛋白的方法,其包括培养或培育包含编码融合蛋白的核酸的细胞的步骤,所述融合蛋白是本文公开的包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白中的任一种。
在另一方面,本发明提供一种包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域,并且由被工程改造以使糖基化修饰、增强、改进、增加和/或人源化的细胞表达或产生的融合蛋白。在另一方面,本发明提供一种包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域,并且由被工程改造以使唾液酸化修饰、增强、改进、增加和/或人源化的细胞表达或产生的融合蛋白。在另一方面,本发明提供一种包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽,并且由被工程改造以使糖基化修饰、增强、改进、增加和/或人源化的细胞表达或产生的融合蛋白。在另一方面,本发明提供一种包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽,并且由被工程改造以使唾液酸化修饰、增强、改进、增加和/或人源化的细胞表达或产生的融合蛋白。
在另一方面,本发明提供一种包含融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物,所述融合蛋白是本文公开的包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白中的任一种。在另一方面,本发明提供一种包含融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物,所述融合蛋白是本文公开的包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白中的任一种。
在一个方面,本发明提供一种治疗补体介导的病症的方法,其包括向需要治疗的受试者施用包含融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物,所述融合蛋白是本文公开的包含人C1-抑制剂多肽和Fc结构域的融合蛋白中的任一种。在一个方面,本发明提供一种治疗补体介导的病症的方法,其包括向需要治疗的受试者施用包含融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物,所述融合蛋白是本文公开的包含人C1-抑制剂多肽和白蛋白多肽的融合蛋白中的任一种。
在一些实施方案中,需要治疗的受试者患有补体介导的病症。在一些实施方案中,补体介导的病症选自遗传性血管性水肿、抗体介导的排斥、视神经脊髓炎谱系病症、创伤性脑损伤、脊髓损伤、缺血性脑损伤、灼烧损伤、中毒性表皮坏死溶解、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、中风、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变(CIDP)、重症肌无力、多灶性运动神经病变。
附图简述
附图仅出于说明目的而非出于限制目的。
图1A是C1-INH的图示。从右至左,三个结构域是信号肽、也被称为N末端结构域的N-末端、和丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。N连接的聚糖显示为具有菱形头部的长垂直线,并且O连接的聚糖显示为短垂直线。图1B是示例性二聚C1-INH Fc融合蛋白的图示。C1-INH多肽部分由矩形指示,并且Fc部分由椭圆形区段指示。图1C是示例性单体C1-INH Fc融合蛋白的图示。
图2A-2D是示例性C1-INH融合蛋白的图示。图2A是具有LALA突变的IgG1Fc融合于全长C1-INH多肽(显示为阴影矩形)的表示。图2B是具有LALA突变的IgG1Fc融合于截短的C1-INH多肽(显示为阴影矩形)的表示。图2C是具有S241P突变的IgG4 Fc融合于全长C1-INH多肽(显示为阴影矩形)的表示。图2D是具有S241P突变的IgG4 Fc融合于截短的C1-INH多肽(显示为阴影矩形)的表示。
图3显示对全长C1-INH人Fc(hFc)IgG1LALA融合蛋白的示例性蛋白质A纯化的结果。该图显示在纯化过程期间,在融合蛋白的捕获和洗脱期间,UV 280nm、UV 260nm、浓度和pH随时间的结果。
图4是在以下四种示例性Fc融合构建体的纯化期间收集的浓度和总蛋白量的图:全长(FL)C1-INH hFc IgG1LALA融合蛋白;截短的(Tr)C1-INH hFc IgG1LALA融合蛋白;全长(FL)C1-INH hFc IgG4m(IgG4S241P)融合蛋白;截短的(Tr)C1-INH hFc IgG4m(IgG4S241P)融合蛋白。
图5是描绘在全长(FL)C1-INH hFc IgG1LALA融合蛋白;截短的(Tr)C1-INH hFcIgG1LALA融合蛋白;全长(FL)C1-INH hFc IgG4m(IgG4S241P)融合蛋白;截短的(Tr)C1-INHhFc IgG4m(IgG4S241P)融合蛋白的纯化样品中检测的内毒素的量的图。
图6显示hFc IgG1-C1-INH、hFc LALA IgG1-C1-INH和hFc IgG4m-C1-INH融合物、重组人C1-INH(rhC1-INH)(在1080细胞中表达)、以及作为阳性对照的IgG1Fc-人卵泡抑素(hFc IgG1-hFst-XTEN)融合物和作为阴性对照的人卵泡抑素-Xten(hFst-XTEN)融合物的示例性C1q结合ELISA的结果。
图7是用于测量示例性融合构建体与FcγR1的细胞外结构域的结合的表面等离子体共振(SPR)Biacore捕获方法的示意图。
图8显示以下示例性效应物失效Fc融合构建体(effector dead Fc fusionconstruct)的SPR分析结果:全长(FL)C1-INH hFc IgG1LALA融合蛋白;截短的(Tr)C1-INHhFc IgG1LALA融合蛋白;全长(FL)C1-INH hFc IgG4m(IgG4S241P)融合蛋白;截短的(Tr)C1-INH hFc IgG4m(IgG4S241P)融合蛋白。包括血浆源性C1-INH作为阳性对照。
图9A和9B呈现用以测量效应物失效构建体抑制C1s裂解比色肽的能力的测定的结果。图9A显示使用测试的各示例性效应物失效构建体的质谱测定法计算的分子量获得的各构建体的滴定曲线。图9B显示使用测试的各示例性效应物失效构建体的凝胶估计的分子量获得的的各构建体的滴定曲线。
图10A描绘用以测量替代性补体途径(APC)的活化的溶血测定的示意性概要。图10B描绘用以测量经典补体途径的活化的溶血测定的示意性概要。
图11A、11B和11C显示用以测量替代性补体途径的活化的溶血测定的结果。图11A显示比较截短的(Tr)C1-INH hFc IgG1LALA融合蛋白、全长(FL)C1-INH hFc IgG1LALA融合蛋白、血浆源性C1-INH制剂和CalBiochem可商购获得的血浆源性C1-INH的结果。根据测试蛋白质的浓度将吸光度读数绘制为对照的百分比。图11B显示对于各样品收集的原始数据的图。图11C显示在测定中操作的对照的图。
图12显示效应物失效融合构建体相较于血浆源性C1-抑制剂和HT1080表达的重组C1-INH两种制剂的兔PK研究的示例性结果。静脉内施用血浆源性C1-INH展现单相血清浓度-时间曲线。
图13A-13F是产生的示例性白蛋白融合构建体的图示。图13A是人血清白蛋白(HSA)融合于C1-INH的图示。图13B是HSA通过GGG接头来接合于C1-INH的图示。图13C是HSA通过(GGGGS)2接头来接合于C1-INH的图示。图13D是HSA的D3结构域融合于C1-INH的图示。图13E是HSA的D3结构域通过GGG接头来接合于C1-INH的图示。图13F是HSA的D3结构域通过(GGGGS)2接头来接合于C1-INH的图示。
图14呈现用以测量一些示例性白蛋白C1-INH融合构建体抑制C1s裂解比色肽的能力的测定的结果,包括血浆源性C1-INH和HT1080表达的重组C1-INH以进行比较。
定义
为使本发明更易于理解,以下首先定义某些术语。以下术语和其它术语的额外定义在整篇说明书中加以阐述。
动物:如本文所用,术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中,“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中,“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中,非人动物是哺乳动物(例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中,动物包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中,动物可为转基因动物、遗传工程改造动物和/或克隆。
近似或约:如本申请中所用,术语“约”和“近似”用作等效语。与或不与约/近似一起用于本申请中的任何数字都意图涵盖由相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。如本文所用,如应用于一个或多个目标值的术语“近似”或“约”是指数值类似于所述参照值。在某些实施方案中,除非另外陈述或另外根据上下文是明显的,否则术语“近似”或“约”是指一定范围的数值落在所述参照值在任一方向(大于或小于)上的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小内(例外之处是当此类数值将超过可能值的100%时)。
生物利用度:如本文所用,术语“生物利用度”通常是指到达受试者的血流的施用剂量的百分比。
生物活性:如本文所用,短语“生物活性”是指任何药剂在生物系统中,并且特别是在生物体中具有活性的特征。举例来说,当向生物体施用时,对该生物体具有生物作用的药剂被视为具有生物活性。在特定实施方案中,当肽具有生物活性时,该肽的分担所述肽的至少一种生物活性的部分通常被称为“生物活性”部分。
载体或稀释剂:如本文所用,术语“载体”和“稀释剂”是指适用于制备药物制剂的药学上可接受的(例如对于向人施用是安全的和无毒的)载体或稀释物质。示例性稀释剂包括无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。
C1-抑制剂或C1酯酶抑制剂或C1-INH:如本文所用,术语“C1-抑制剂”或“C1酯酶抑制剂”或“C1-INH”全都可互换使用,并且除非另外规定,否则是指保留基本上C1-INH生物活性的任何野生型或经修饰的C1-INH多肽(例如具有氨基酸突变、缺失、插入的C1-INH蛋白和/或融合蛋白)。C1-INH可在细胞中重组表达。在某些实施方案中,C1-INH在哺乳动物细胞,优选是CHO细胞或人细胞中表达。
功能性等效物或衍生物:如本文所用,在氨基酸序列的功能性衍生物的情形下,术语“功能性等效物”或“功能性衍生物”表示保留基本上类似于原始序列的生物活性的生物活性(功能或结构)的分子。功能性衍生物或等效物可为天然衍生物,或以合成方式制备。示例性功能性衍生物包括具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列,前提是蛋白质的生物活性得以保持。取代性氨基酸合乎需要地具有与被取代的氨基酸的化学物理性质类似的化学物理性质。所需类似化学物理性质包括在电荷、体积大小、疏水性、亲水性等方面的类似性。
融合蛋白:如本文所用,术语“融合蛋白”或“嵌合蛋白”是指通过接合两个或更多个最初分开的蛋白质或其部分产生的蛋白质。在一些实施方案中,接头或间隔体将存在于各蛋白质之间。
半衰期:如本文所用,术语“半衰期”是为数量诸如蛋白质浓度或活性降至它的如在某一时期开始时测量的值的一半所需的时间。
遗传性血管性水肿或HAE:如本文所用,术语“遗传性血管性水肿”或“HAE”是指一种特征在于炎症不可预测且反复发作的血液病症。HAE通常伴有C1-INH缺乏,其可为C1-INH的水平较低或C1-INH的活性受损或降低的结果。症状包括但不限于可出现在身体的任何部分诸如面部、四肢、生殖器、胃肠道和上气道中的肿胀。
改进、增加或降低:如本文所用,术语“改进”、“增加”或“降低”或语法等效形式指示数值相对于基线测量结果,所述基线测量结果诸如同一个体中在启始本文所述的治疗之前的测量结果,或对照受试者(或多个对照受试者)中在不存在本文所述的治疗下的测量结果。“对照受试者”是与所治疗的受试者受相同形式的疾病折磨,与所治疗的受试者具有大约相同的年龄的受试者。
体外:如本文所用,术语“体外”是指事件发生在人工环境中,例如试管或反应容器中,细胞培养中等,而非在多细胞生物体内。
体内:如本文所用,术语“体内”是指事件发生在多细胞生物体诸如人和非人动物内。在基于细胞的系统的情形下,所述术语可用于指代事件发生在活细胞内(与例如体外系统相对比)。
接头:如本文所用,术语“接头”是指在融合蛋白中,除出现在天然蛋白质中的特定位置处的氨基酸序列以外的氨基酸序列,并且通常被设计以具有可挠性或插入两个蛋白质部分之间的结构诸如α-螺旋。接头也被称为间隔体。接头或间隔体通常自身不具有生物功能。
多肽:如本文所用的术语“多肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸的连续链。所述术语用于指代具有任何长度的氨基酸链,但本领域普通技术人员将了解,所述术语不限于长链,并且可指包含通过肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如为本领域技术人员所知,多肽可被加工和/或修饰。如本文所用,术语“多肽”和“肽”可互换使用。
预防:如本文所用,术语“预防(prevent/prevention)”在与疾病、病症和/或病状的发生关联使用时是指降低发展所述疾病、病症和/或病状的风险。参见对“风险”的定义。
蛋白质:如本文所用的术语“蛋白质”是指一个或多个充当离散单元的多肽。如果单一多肽是离散的功能性单元,并且不需要与其它多肽永久或暂时物理缔合以形成离散的功能性单元,那么术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。如果离散的功能性单元包含一个以上彼此物理缔合的多肽,那么术语“蛋白质”是指物理偶联,并且一起充当离散单元的多个多肽。
风险:如将根据上下文所了解,疾病、病症和/或病状的“风险”包括特定个体将发展疾病、病症和/或病状(例如肌营养不良)的可能性。在一些实施方案中,将风险表示为百分比。在一些实施方案中,风险是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90直至100%。在一些实施方案中,将风险表示为相对于与某一参照样本或一组参照样本相关的风险的风险。在一些实施方案中,某一参照样本或一组参照样本具有疾病、病症、病状和/或事件(例如肌营养不良)的已知风险。在一些实施方案中,某一参照样本或一组参照样本来自与特定个体类似的个体。在一些实施方案中,相对风险是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。
受试者:如本文所用,术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中,受试者是人类。受试者可为患者,其是指向医疗提供者呈递以供诊断或治疗疾病的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可受疾病或病症折磨或易患疾病或病症,但可能显示或可能不显示所述疾病或病症的症状。
基本上:如本文所用,术语“基本上”是指展现总体或接近总体范围或程度的目标特征或性质的定性情况。生物领域普通技术人员将了解生物和化学现象很少(如果曾发生的话)达到完全和/或进行至完全或实现或避免绝对结果。因此,术语“基本上”在本文中用于体现许多生物和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
基本上同源性:短语“基本上同源性”在本文中用于指代氨基酸或核酸序列之间的比较。如将由本领域普通技术人员所了解,如果两个序列在相应位置中含有同源性残基,那么它们通常被视为“基本上同源”。同源性残基可为同一残基。或者,同源性残基可为将具有适当类似结构和/或功能特征的非同一残基。举例来说,如本领域普通技术人员所熟知,某些氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸,和/或具有“极性”或“非极性”侧链。将一个氨基酸取代成相同类型的另一个氨基酸可常被视为“同源性”取代。
如本领域中所熟知,可使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列,所述算法包括商业计算机程序中可用的那些,诸如针对核苷酸序列的BLASTN以及针对氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性此类程序描述于Altschul等,Basic localalignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990;Altschul等,Methods inEnzymology;Altschul等,“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs”,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997;Baxevanis等,Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998;以及Misener等(编),Bioinformatics Methods and Protocols(Methods inMolecular Biology,第132卷),Humana Press,1999中。除鉴定同源性序列之外,以上提及的程序也通常提供对同源性程度的指示。在一些实施方案中,如果在一段相关残基上,两个序列的相应残基中有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多是同源的,那么它们被视为基本上同源。在一些实施方案中,相关链段是完整序列。在一些实施方案中,相关链段是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个残基。
基本上同一性:短语“基本上同一性”在本文中用于指代氨基酸或核酸序列之间的比较。如将由本领域普通技术人员所了解,如果两个序列在相应位置中含有同一残基,那么它们通常被视为“基本上同一”。如本领域中所熟知,可使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列,所述算法包括商业计算机程序中可用的那些,诸如针对核苷酸序列的BLASTN以及针对氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性此类程序描述于Altschul等,Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990;Altschul等,Methods in Enzymology;Altschul编,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997;Baxevanis等,Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genesand Proteins,Wiley,1998;以及Misener等(编),Bioinformatics Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology,第132卷),Humana Press,1999中。除鉴定同一序列之外,以上提及的程序也通常提供对同一性程度的指示。在一些实施方案中,如果在一段相关残基上,两个序列的相应残基中有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多是同一的,那么它们被视为基本上同一。在一些实施方案中,相关链段是完整序列。在一些实施方案中,相关链段是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个残基。
罹患:正“罹患”疾病、病症和/或病状的个体已被诊断有或显示所述疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。
易患:“易患”疾病、病症和/或病状的个体尚未被诊断有所述疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中,易患疾病、病症和/或病状的个体可不展现所述疾病、病症和/或病状的症状。在一些实施方案中,易患疾病、病症、病状或事件(例如DMD)的个体可具有一个或多个以下特征:(1)与发展所述疾病、病症和/或病状相关的遗传突变;(2)与发展所述疾病、病症和/或病状相关的遗传多态性;(3)与所述疾病、病症和/或病状相关的蛋白质的表达和/或活性增加和/或降低;(4)与发展所述疾病、病症、病状和/或事件相关的习惯和/或生活方式;(5)已经受、计划经受或需要移植。在一些实施方案中,易患疾病、病症和/或病状的个体将发展所述疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中,易患疾病、病症和/或病状的个体将不发展所述疾病、病症和/或病状。
治疗有效量:如本文所用,术语治疗剂的“治疗有效量”意指当向罹患或易患疾病、病症和/或病状的受试者施用时,足以治疗、诊断、预防所述疾病、病症和/或病状的症状和/或延迟其发作的量。本领域普通技术人员应了解,治疗有效量通常通过包含至少一个单位剂量的给药方案施用。
治疗:如本文所用,术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指用于部分或完全减轻、改善、缓和、抑制、预防特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征、延迟其发作、减轻其严重性、和/或降低其发生率的任何方法。治疗可向不展现疾病的征象和/或仅展现所述疾病的早期征象的受试者施用以达成降低发展与所述疾病相关的病理学的风险的目的。
某些实施方案的详细描述
本发明尤其提供基于C1-INH作为蛋白质治疗剂,用于治疗包括遗传性血管性水肿(HAE)的补体介导的病症的方法和组合物。
融合的目的在于延长半衰期。结果是给药频率降低,防治性功效增加。
本发明的各个方面详细描述于以下章节中。章节的使用不意图限制本发明。各章节可适用于本发明的任何方面。在本申请中,除非另外陈述,否则“或”的使用意指“和/或”。本文引用的所有技术的公开内容都以引用的方式整体并入本文。
C1-INH
人C1-INH是一种具有广泛范围的抑制和非抑制生物活性的重要抗炎性血浆蛋白质。就序列同源性、它的C末端结构域的结构和蛋白酶抑制机理来说,它属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族(即最大类别的血浆蛋白酶抑制剂),其也包括抗凝血酶、α1-蛋白酶抑制剂、纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂和调控不同生理系统的许多其它结构类似蛋白质。C1-INH是补体系统、激肽产生接触系统和内在凝血途径中的蛋白酶的抑制剂。Cai,S.和Davis,A.E.,Complement Regulatory Protein C1Inhibitor Binds to Selectins andInterferes with Endothelial-Leukocyte Adhesion,J Immunol,171:4786-4791(2003)。具体来说,已显示C1-INH会抑制补体系统的C1r和C1s。C1-INH也是凝血因子XI和XII以及激肽释放酶和凝血和纤维蛋白溶解系统的其它丝氨酸蛋白酶(包括组织型纤维蛋白溶酶原活化因子和纤维蛋白溶酶)的主要调控剂。
C1-INH的血浆含量较低或它的功能异常导致活化补体级联与接触血浆级联两者,并且也可影响其它系统。已显示C1-INH血浆含量降低至低于55μg/mL(约为正常值的25%)的水平会诱导C1自发性活化。
描绘C1-INH的结构的示意图提供于图1A中。显示信号肽、N末端结构域和丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。22个氨基酸的信号肽为分泌所需,并且从C1-INH蛋白的其余部分裂解。C1-INH具有两个结构域:具有365个氨基酸,是典型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域的C末端结构域,和具有113个氨基酸的N末端结构域。蛋白质通过连接各结构域的两个二硫桥来稳定。这些二硫桥由N末端结构域的Cys101与C末端(丝氨酸蛋白酶抑制剂)结构域的Cys406形成二硫键,以及N末端结构域的Cys108与C末端结构域的Cys183形成二硫键来形成。丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域负责C1-INH的蛋白酶活性。P1-P1’表示Arg444-Thr445易切断键。
糖基化蛋白质的超过26%的重量是碳水化合物。聚糖不均匀分布在人C1-INH中。N末端被大量糖基化,具有三个N连接的(显示为具有菱形头部的长垂直线)和至少七个O连接的(显示为短垂直线)碳水化合物基团。三个N连接的聚糖连接于丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域中的天冬酰胺残基Asn216、Asn231和Asn330(显示为具有菱形头部的长垂直线)。尽管格外长的且被大量糖基化的N末端结构域的功能性作用仍不明确,但它可能为蛋白质的构象稳定性、识别、对内毒素和选择素的亲和力、以及清除所必需。碳水化合物部分的内在异质性极大促成整个C1-INH的异质性,这是为何难以产生模拟血浆源性C1-INH的性质的重组C1-INH的一个原因。
如本文所用,适于本发明的C1-INH融合蛋白包含保留基本上C1-INH生物活性的任何野生型和经修饰的C1-INH多肽(例如具有氨基酸突变、缺失、截短和/或插入的C1-INH蛋白)。通常,使用重组技术产生C1-INH融合蛋白。
通常,合适的重组C1-INH融合蛋白具有是或大于约12小时、18小时、24小时、36小时、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天、8天、8.5天、9天、9.5天或10天的体内半衰期。在一些实施方案中,重组C1-INH融合蛋白具有介于0.5与10天之间、介于1天与10天之间、介于1天与9天之间、介于1天与8天之间、介于1天与7天之间、介于1天与6天之间、介于1天与5天之间、介于1天与4天之间、介于1天与3天之间、介于2天与10天之间、介于2天与9天之间、介于2天与8天之间、介于2天与7天之间、介于2天与6天之间、介于2天与5天之间、介于2天与4天之间、介于2天与3天之间、介于2.5天与10天之间、介于2.5天与9天之间、介于2.5天与8天之间、介于2.5天与7天之间、介于2.5天与6天之间、介于2.5天与5天之间、介于2.5天与4天之间、介于3天与10天之间、介于3天与9天之间、介于3天与8天之间、介于3天与7天之间、介于3天与6天之间、介于3天与5天之间、介于3天与4天之间、介于3.5天与10天之间、介于3.5天与9天之间、介于3.5天与8天之间、介于3.5天与7天之间、介于3.5天与6天之间、介于3.5天与5天之间、介于3.5天与4天之间、介于4天与10天之间、介于4天与9天之间、介于4天与8天之间、介于4天与7天之间、介于4天与6天之间、介于4天与5天之间、介于4.5天与10天之间、介于4.5天与9天之间、介于4.5天与8天之间、介于4.5天与7天之间、介于4.5天与6天之间、介于4.5天与5天之间、介于5天与10天之间、介于5天与9天之间、介于5天与8天之间、介于5天与7天之间、介于5天与6天之间、介于5.5天与10天之间、介于5.5天与9天之间、介于5.5天与8天之间、介于5.5天与7天之间、介于5.5天与6天之间、介于6天与10天之间、介于7天与10天之间、介于8天与10天之间、介于9天与10天之间的体内半衰期。
通常,合适的重组C1-INH融合蛋白具有是或大于约4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天、8天、8.5天、9天、9.5天或10天的体内半衰期。在一些实施方案中,重组C1-INH融合蛋白具有介于4天与9天之间、介于4天与8天之间、介于4天与7天之间、介于4天与6天之间、介于4天与5天之间、介于4.5天与10天之间、介于4.5天与9天之间、介于4.5天与8天之间、介于4.5天与7天之间、介于4.5天与6天之间、介于4.5天与5天之间、介于5天与10天之间、介于5天与9天之间、介于5天与8天之间、介于5天与7天之间、介于5天与6天之间、介于5.5天与10天之间、介于5.5天与9天之间、介于5.5天与8天之间、介于5.5天与7天之间、介于5.5天与6天之间、介于6天与10天之间、介于7天与10天之间、介于8天与10天之间、介于9天与10天之间的体内半衰期。
在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽包括与以下野生型人C1-INH蛋白(氨基酸1-478)(氨基酸1-97加下划线)具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
NPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPT IQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:1).
在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽包括与以下野生型人C1-INH蛋白(氨基酸98-478)具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
GSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQID NO:2).
如本文所公开,SEQ ID NO:1代表人C1-INH蛋白的典型氨基酸序列。在一些实施方案中,C1-INH多肽可为截短的C1-INH,诸如SEQ ID NO:2。在一些实施方案中,合适的重组C1-INH多肽可为野生型或天然存在的蛋白质的同源物或类似物。举例来说,人野生型或天然存在的C1-INH多肽的同源物或类似物相较于野生型或天然存在的C1-INH蛋白(例如SEQID NO:1)可含有一个或多个氨基酸或结构域取代、缺失和/或插入,同时保留基本上C1-INH蛋白活性。因此,在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽与人C1-INH蛋白(SEQID NO:1)基本上同源。在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽具有与SEQ IDNO:1至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的氨基酸序列。在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽与人C1-INH蛋白(SEQ ID NO:1)基本上同一。在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽具有与SEQ ID NO:1至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一的氨基酸序列。
人C1-INH蛋白的同源物或类似物可根据为本领域普通技术人员所知的用于改变多肽序列的方法制备,所述方法诸如见于汇编此类方法的参考文献中的方法。如将由本领域普通技术人员所了解,如果两个序列在相应位置中含有同源性残基,那么它们通常被视为“基本上同源”。同源性残基可为同一的残基。或者,同源性残基可为将具有适当类似结构和/或功能特征的非同一残基。举例来说,如本领域普通技术人员所熟知,某些氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸,和/或具有“极性”或“非极性”侧链。将一个氨基酸取代成相同类型的另一个氨基酸可常被视为“同源性”取代。在一些实施方案中,保守性氨基酸取代包括在以下组内的氨基酸之间进行的取代:(a)M、I、L、V;(b)F、Y、W;(c)K、R、H;(d)A、G;(e)S、T;(f)Q、N;和(g)E、D。在一些实施方案中,“保守性氨基酸取代”是指不改变其中进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或尺寸特征的氨基酸取代。
如本领域中所熟知,可使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列,所述算法包括商业计算机程序中可用的那些,诸如针对核苷酸序列的BLASTN以及针对氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性所述程序描述于Altschul等,Basic localalignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990;Altschul等,Methods inEnzymology;Altschul等,“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs”,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997;Baxevanis等,Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998;以及Misener等(编),Bioinformatics Methods and Protocols(Methods inMolecular Biology,第132卷),Humana Press,1999中。除鉴定同源性序列之外,以上提及的程序也通常提供对同源性程度的指示。
在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽相较于野生型人C1-INH蛋白含有一个或多个氨基酸缺失、插入或替换。举例来说,合适的重组C1-INH多肽可为截短多肽,诸如具有SEQ ID NO:2的多肽。
在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽包括与以下截短的野生型人C1-INH蛋白(氨基酸98-478)具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
GSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQID NO:2).
在一些实施方案中,C1-INH多肽可为截短的C1-INH,同时保留基本上C1-INH蛋白活性,诸如SEQ ID NO:2。因此,在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽与人C1-INH蛋白(SEQ ID NO:2)基本上同源。在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽具有与SEQ ID NO:2至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的氨基酸序列。在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽与人C1-INH蛋白(SEQ ID N0:2)基本上同一。在一些实施方案中,适于本发明的重组C1-INH多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列。
适于本发明的重组C1-INH融合蛋白可为C1-INH结构域与通常可通过例如增强或增加C1-INH蛋白的半衰期、稳定性、效能和/或递送,或降低或消除免疫原性、清除率或毒性来促进C1-INH的治疗作用的另一结构域或部分之间的融合蛋白。C1-INH融合蛋白的此类合适的结构域或部分包括但不限于Fc结构域和白蛋白结构域。
Fc结构域
在一些实施方案中,合适的C1-INH融合蛋白含有Fc结构域或其结合FcRn受体的部分。作为一非限制性实例,合适的Fc结构域可源于诸如IgG的免疫球蛋白子类。在一些实施方案中,合适的Fc结构域源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中,合适的Fc结构域源于IgM、IgA、IgD或IgE。特别合适的Fc结构域包括源于人抗体或人源化抗体的那些。在一些实施方案中,合适的Fc结构域是经修饰的Fc部分,诸如经修饰的人Fc部分。
A.IgG1
C1-抑制剂Fc融合蛋白可以二聚体形式存在,如图1A中所示。
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包括与以下野生型人IgG1 Fc结构域具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:3).
i.LALA
野生型IgG1具有低水平的补体级联活化,任何所述活化都可能不合乎罹患补体介导的病症的患者的需要。降低或消除补体活化和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的效应物失效构建体的IgG选择可为重要的。合适的Fc结构域包括具有突变L234A和L235A(LALA)的IgG1。
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包括与以下具有LALA突变的人IgG1Fc结构域(突变残基加下划线)具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:4).
ii.NHance
预期Fc结构域与FcRn受体之间的结合改进会导致血清半衰期延长。因此,在一些实施方案中,合适的Fc结构域包含一个或多个导致与FcRn的结合改进的氨基酸突变。Fc结构域内实现与FcRn的结合改进的各种突变在本领域中是已知的,并且可适合于实施本发明。在一些实施方案中,合适的Fc结构域包含一个或多个在一个或多个对应于人IgG1的Thr250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433和/或Asn 434的位置处的突变。
举例来说,合适的Fc结构域可含有突变H433K(His433Lys)和/或N434F(Asn434Phe)。作为一非限制性实例,合适的Fc结构域可含有突变H433K(His433Lys)和N434F(Asn434Phe)(Nhance)。可包括在Fc结构域中的额外氨基酸取代包括例如美国专利号6,277,375;8,012,476;和8,163,881中所述的那些,所述专利以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包括与以下具有Nhance突变的人IgG1Fc结构域(突变残基加下划线)具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALKFHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:5).
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包括与以下具有LALA突变与Nhance突变两者的人IgG1 Fc结构域(突变残基加下划线)具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALKFHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:6).
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包括与以下具有信号肽,并且具有Nhance突变的人IgG1 Fc结构域(信号肽和突变残基加下划线)具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
METPAQLLFLLLLWLPDTTGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALKFHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:7).
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包括与以下具有信号肽,并且具有LALA突变与Nhance突变两者的人IgG1 Fc结构域(突变残基加下划线)具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
METPAQLLFLLLLWLPDTTGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALKFHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:8).
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包括与以下野生型人IgG4 Fc结构域具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:9).
在一些实施方案中,适于本发明的Fc结构域包括与以下具有S241P突变的人IgG4Fc结构域(突变残基加下划线)具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:10).
在一些实施方案中,合适的Fc结构域包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源或同一性的氨基酸序列。
B.IgG4
在一些实施方案中,在HAE的情况下,“效应物失效”Fc融合蛋白的IgG4IgG选择是重要的(消除补体活化和ADCC)。具体来说,据报道IgG4相比于野生型IgG1具有较低补体活化。表达天然IgG4会产生混合种类的构建体尺寸分级。因此,基于先前技术,由于由IgG4S241P突变体所展现的稳定性增加和二聚结构维持,所以选择IgG4S241P用于这个程序。
根据本发明的人IgG4核心铰链区序列优选包含根据如按照Kabat的EU索引的S228P取代。根据Kabat等(1987Sequences of proteins of immunologicalinterest.United States Department of Health and Human Services,WashingtonDC.),这个取代也已被称为S241P。该取代具有使得铰链区的核心的序列与野生型IgG1或IgG2同种型抗体的铰链区核心序列相同的作用。关于IgG4同种型抗体,它导致产生IgG4抗体的同源形式,并且因此消除常常导致产生异二聚IgG4抗体的重链解离和重新缔合。在一些实施方案中,IgG4对于在高浓度下的稳定性是优选的。
C.示例性C1-INH融合蛋白
在特定实施方案中,合适的重组C1-INH融合蛋白包括C1-INH多肽、Fc结构域,其中所述C1-INH多肽包含与野生型人C1-INH多肽(SEQ ID NO:1)或截短的C1-INH多肽(SEQ IDNO:2)具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,存在使C1-INH多肽与Fc结构域缔合的接头。在一些实施方案中,合适的重组C1-INH融合蛋白具有在约0.5-10天(例如约0.5-5.5天、约0.5-5天、约1-5天、约1.5-5天、约1.5-4.5天、约1.5-4.0天、约1.5-3.5天、约1.5-3天、约1.5-2.5天、约2-6天、约2-5.5天、约2-5天、约2-4.5天、约2-4天、约2-3.5天、约2-3天)的范围内的体内半衰期。在一些实施方案中,合适的重组C1-INH融合蛋白具有在约2-10天的范围内(例如在约2.5-10天、约3-10天、约3.5-10天、约4-10天、约4.5-10天、约5-10天、约3-8天、约3.5-8天、约4-8天、约4.5-8天、约5-8天、约3-6天、约3.5-6天、约4-6天、约4.5-6天、约5-6天的范围内)的体内半衰期。
通常,合适的重组C1-INH融合蛋白具有是或大于约12小时、18小时、24小时、36小时、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天、8天、8.5天、9天、9.5天或10天的体内半衰期。在一些实施方案中,重组C1-INH融合蛋白具有介于0.5与10天之间、介于1天与10天之间、介于1天与9天之间、介于1天与8天之间、介于1天与7天之间、介于1天与6天之间、介于1天与5天之间、介于1天与4天之间、介于1天与3天之间、介于2天与10天之间、介于2天与9天之间、介于2天与8天之间、2天与7天之间、2天与6天之间、2天与5天之间、2天与4天之间、介于2天与3天之间、介于2.5天与10天之间、介于2.5天与9天之间、介于2.5天与8天之间、介于2.5天与7天之间、介于2.5天与6天之间、介于2.5天与5天之间、介于2.5天与4天之间、介于3天与10天之间、介于3天与9天之间、介于3天与8天之间、介于3天与7天之间、介于3天与6天之间、介于3天与5天之间、介于3天与4天之间、介于3.5天与10天之间、介于3.5天与9天之间、介于3.5天与8天之间、介于3.5天与7天之间、介于3.5天与6天之间、介于3.5天与5天之间、介于3.5天与4天之间、介于4天与10天之间、介于4天与9天之间、介于4天与8天之间、介于4天与7天之间、介于4天与6天之间、介于4天与5天之间、介于4.5天与10天之间、介于4.5天与9天之间、介于4.5天与8天之间、介于4.5天与7天之间、介于4.5天与6天之间、介于4.5天与5天之间、介于5天与10天之间、介于5天与9天之间、介于5天与8天之间、介于5天与7天之间、介于5天与6天之间、介于5.5天与10天之间、介于5.5天与9天之间、介于5.5天与8天之间、介于5.5天与7天之间、介于5.5天与6天之间、介于6天与10天之间、介于7天与10天之间、介于8天与10天之间、介于9天与10天之间的体内半衰期。
在某些实施方案中,如图2A和图2B中所示,Fc部分可直接融合于全长(1-478个氨基酸)以及截短(98-478)的C1-抑制剂的N末端区域。作为非限制性实例,合适的C1-INH Fc融合蛋白可具有以下显示的氨基酸序列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:11)
或
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ IDNO:12)
或
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:13)
或
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ IDNO:14)
或
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:32)
或
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQID NO:33)
或
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:15)
或
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQID NO:16).
在一些实施方案中,合适的重组C1-INH Fc融合蛋白具有与SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:32或SEQID NO:33具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源性或同一性的氨基酸序列。
预期C1-INH-Fc融合蛋白可以各种构型提供,包括同二聚构型或单体构型。举例来说,合适的同二聚构型可被设计以使融合配偶体(例如C1-INH多肽加接头)的C末端连接于两个Fc多肽链的N末端。合适的单体构型可被设计以使融合配偶体(例如C1-INH多肽加接头)的C末端融合于一个Fc二聚体。
对于某些应用和施用途径例如皮下施用,单体(在本文中也称为单价)形式可为优选的。单体构型可降低空间位阻,增加半衰期,和/或可增加生物利用度。
对于C1-INH Fc融合构建体,单价形式也可为优选的,因为C1-INH是自杀性抑制剂。因为它是自杀性抑制剂,所以二聚体Fc融合物的一个C1-INH“臂”的结合将导致结合的C1-INH融合蛋白的清除率增加,即使在第二臂仍然未结合的情况下。
单体Fc融合蛋白与二聚Fc融合蛋白两者的优势是发现相比于单独C1-INH的表达,在Fc情况下的表达在较高水平下发生。已显示比较二聚C1-INH Fc构建体与重组C1-INH的活性测定具有类似C1q结合活性。也测试包括接头,并且发现不影响Fc-C1-INH融合蛋白结合它的靶标的能力。
制备单体抗体融合蛋白的方法包括例如PCT公布号WO2011/063348;WO2012/020096;WO2013/138643;WO2014087299;Dumont,J.等,Monomeric Fc Fusions:Impact onPharmacokinetic and Biological Activity of Protein Therapeutics,Biodrugs,20(3):151-160(2006);Ishino,T.等,Protein Structure and Folding:Half-lifeExtension of Biotherapeutics Modality by N-Glycosylation for the Engineeringa Monomeric Fc Domain,J.Biol.Chem.,288:16529-16537(2013)中所述的那些,所述专利和参考文献的公开内容以引用的方式并入本文。
可通过使用与表达单独Fc的质粒共同转染的含有Fc-C1的质粒来制备单价C1-抑制剂。此外,它可通过使用双启动子质粒来制备,其中一个启动子产生Fc-C1,而另一启动子产生单独Fc。也可使用双特异性技术制备单价Fc,其中使Fc的铰链区中的特定氨基酸突变以赋予Fc区的稳定性(例如钮和孔(Knob and hole)技术或驱使形成单价C1的其它稳定化突变)。
如本文所用,关于本文标识的参照蛋白质序列(例如参照C1-INH蛋白质序列)的“氨基酸序列同一性百分比(%)”定义为在比对序列,以及必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比,并且不将任何保守性取代考虑为序列同一性的一部分之后,候选序列中与参照序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以本领域技能内的各种方式实现,例如使用可公开获得的计算机软件诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数,包括为在所比较序列的全长上实现最大对准所需的任何算法。优选地,WU-BLAST-2软件用于确定氨基酸序列同一性(Altschul等,Methods in Enzymology 266,460-480(1996);http://blast.wustl/edu/blast/README.html)。WU-BLAST-2使用若干搜索参数,其中大多数被设置成缺省值。可调整参数设为以下值:重叠间距=1,重叠分数=0.125,字阈值(world threshold)(T)=11。HSP评分(S)和HSP S2参数是动态值,并且由程序自身视特定序列的组成来确定,然而,最小值可被调整,并且如上所指示加以设置。
白蛋白结构域
白蛋白是一种占血清蛋白质的约一半的可溶性单体蛋白质。白蛋白主要充当类固醇、脂肪酸和甲状腺激素的载体蛋白,并且在使细胞外液体积稳定方面起作用。白蛋白表现为分子量是66,500的球状未糖基化的血清蛋白质。白蛋白在肝中以具有N末端肽的前白蛋白原(preproalbumin)形式合成,所述N末端肽在初生蛋白质从糙面内质网释放之前被移除。产物白蛋白原转而在高尔基小泡(Golgi vesicle)中被裂解以产生分泌白蛋白。
白蛋白由三个同源性结构域(I-III)组成,并且这些结构域各自包含两个子结构域(A和B)。人血清白蛋白的主要配体结合区域位于子结构域IIA和IIIA中的空腔中,所述空腔主要由疏水性和带正电荷残基形成,并且展现类似化学性质。人血清白蛋白具有585个氨基酸和66,500Da的分子质量。氨基酸包括35个半胱氨酸,其中除一个之外全都涉及于17个稳定化二硫键的形成中。
白蛋白具有19天的延长血清半衰期。FcRn控制白蛋白的长久血清半衰期。FcRn是一种双重结合受体,其除白蛋白之外也结合IgG,并且保护两种蛋白质免遭细胞内降解。已显示白蛋白分子的C末端结构域对于与FcRn的结合至关重要。缺乏结构域IIIB或突变464His、510His和535His几乎完全消除FcRn结合。
本发明的白蛋白融合蛋白是单体。在一些实施方案中,由于以上关于单体Fc融合物实施方案所述的原因,所以这个特征可为与二聚Fc融合物实施方案相比的优势。
在一些实施方案中,适于本发明的白蛋白多肽包括与以下野生型人血清白蛋白具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYKTTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL(SEQ IDNO:17).
在一些实施方案中,适于本发明的白蛋白多肽包括与以下野生型人血清白蛋白的D3结构域具有至少50%(例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列:
METPAQLLFLLLLWLPDTTGVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL(SEQID NO:20).
接头或间隔体
C1-INH结构域可直接或间接连接于Fc结构域或白蛋白结构域。在一些实施方案中,合适的重组C1-INH融合蛋白含有接合C1-INH多肽和Fc结构域的接头或间隔体。在一些实施方案中,合适的重组C1-INH融合蛋白含有接合C1-INH多肽和白蛋白多肽的接头或间隔体。氨基酸接头或间隔体通常被设计以具有可挠性或插入两个蛋白质部分之间的结构诸如α-螺旋。接头或间隔体可相对较短,或可较长。通常,在长度方面,接头或间隔体含有例如3-100(例如5-100、10-100、20-10030-100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100、5-55、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20)个氨基酸。在一些实施方案中,在长度方面,接头或间隔体等于或长于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。通常,较长接头可降低空间位阻。在一些实施方案中,接头将包含甘氨酸和丝氨酸残基的混合物。在一些实施方案中,接头可另外包含苏氨酸、脯氨酸和/或丙氨酸残基。因此,在一些实施方案中,接头包含10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、10-15个之间的氨基酸。在一些实施方案中,接头包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95个氨基酸。在一些实施方案中,接头不是由ALEVLFQGP组成的接头。
作为非限制性实例,适于本发明的接头或间隔体包括但不限于GGG接头和GGGGSGGGGS((GGGGS)2接头SEQ ID NO:27)。在一些实施方案中,接头包含序列GGG和/或序列SEQ ID NO:27。
其它合适的接头包括GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG接头,SEQ ID NO:34);GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG2接头,SEQ ID NO:35);和GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(GAG3接头,SEQ ID NO:36)。
合适的接头或间隔体也包括具有与以上示例性接头例如GGG接头、GGGGSGGGGS((GGGGS)2接头SEQ ID NO:27)、GAG接头(SEQ ID NO:34)、GAG2接头(SEQ ID NO:35)或GAG3接头(SEQ ID NO:36)具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源性或同一性的氨基酸序列的那些。适于与一些实施方案一起使用的额外接头可见于2012年3月2日提交的US2012/0232021中,所述专利的公开内容据此以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中,提供使C1-INH多肽与白蛋白结构域缔合,而不实质上影响C1-INH多肽结合它的任何同源配体(例如C1s等)的能力的接头。在一些实施方案中,提供接头以使相较于单独C1-INH多肽,C1-INH肽与它的一种或多种同源配体的结合不改变。在一些实施方案中,提供接头以使相较于单独C1-INH多肽,C1-INH肽与它的一种或多种同源配体的结合不降低或减小。
产生重组C1-INH融合蛋白
适于本发明的重组C1-INH融合蛋白可通过任何可用手段来产生。举例来说,可通过利用被工程改造以表达重组C1-INH融合蛋白编码核酸的宿主细胞系统来重组产生重组C1-INH融合蛋白。或者或另外,可通过使内源性基因活化来产生重组C1-INH融合蛋白。或者或另外,重组C1-INH融合蛋白可部分或完全通过化学合成来制备。
当重组产生蛋白质时,可使用任何表达系统。仅举几例来说,已知表达系统包括例如大肠杆菌(E.coli)、卵、杆状病毒、植物、酵母或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中,在哺乳动物细胞中产生适于本发明的重组C1-INH融合蛋白。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤株系(NSO/l,ECACC编号:85110503);人视网膜母细胞(PER.C6,CruCell,Leiden,The Netherlands);由SV40转化的猴肾CV1株系(COS-7,ATCC CRL 1651);人胚肾株系(被亚克隆以悬浮培养生长的HEK293或293细胞,Graham等,J.Gen Virol.,36:59,1977);人纤维肉瘤细胞系(例如HT1080);幼小仓鼠肾细胞(BHK21,ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980);小鼠塞尔托利细胞(sertoli cell)(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980);猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1 587);人宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL 2);犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL 34);水牛大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL1442);人肺细胞(W138,ATCC CCL 75);人肝细胞(Hep G2,HB8065);小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI细胞(Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982);MRC 5细胞;FS4细胞;和人肝细胞瘤株系(Hep G2)。
在一些实施方案中,本发明提供由人细胞产生的重组C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,本发明提供由CHO细胞或HT1080细胞产生的重组C1-INH融合蛋白。
通常,被工程改造以表达重组C1-INH融合蛋白的细胞可包含编码本文所述的重组C1-INH融合蛋白的转基因。应了解编码重组C1-INH融合蛋白的核酸可含有调控序列、基因控制序列、启动子、非编码序列和/或用于表达重组C1-INH融合蛋白的其它适当序列。通常,使编码区可操作地与这些核酸组分中的一个或多个连接。
转基因的编码区可包括一个或多个沉默突变以针对特定细胞类型优化密码子使用。举例来说,可针对在脊椎动物细胞中表达来优化C1-INH融合物转基因的密码子。在一些实施方案中,可针对在哺乳动物细胞中表达来优化C1-INH融合物转基因的密码子。在一些实施方案中,可针对在人细胞中表达来优化C1-INH融合物转基因的密码子。在一些实施方案中,可针对在CHO细胞中表达来优化C1-INH融合物转基因的密码子。
编码C1-抑制剂Fc融合蛋白和/或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的核酸
在一些实施方案中,提供包含编码重组目标基因(在本文中被称为转基因)诸如本文各种实施方案中所述的C1-抑制剂Fc融合蛋白和/或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的核酸序列的核酸分子。在一些实施方案中,编码转基因的核酸可被修饰以提供所编码C1-抑制剂Fc融合蛋白和/或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的表达增加,此也被称为密码子优化。举例来说,可通过改变编码序列的开放阅读框来修饰编码转基因的核酸。如本文所用,术语“开放阅读框”与“ORF”同义,并且意指潜在能够编码蛋白质或蛋白质的一部分的任何核苷酸序列。开放阅读框通常以起始密码子(在标准密码的情况下表示为例如RNA分子的AUG和DNA分子的ATG)开始,并且以密码子三联体进行读取直至具有终止密码子(在标准密码的情况下表示为例如RNA分子的UAA、UGA或UAG和DNA分子的TAA、TGA或TAG)的框架末端。如本文所用,术语“密码子”意指核酸分子中的三核苷酸序列,其在蛋白质合成期间指定特定氨基酸;也称为三联体或密码子三联体。举例来说,在标准遗传密码的情况下的64个可能密码子之中,两个密码子GAA和GAG编码氨基酸谷氨酰胺,而密码子AAA和AAG指定氨基酸赖氨酸。在标准遗传密码的情况下,三个密码子是终止密码子,其不指定氨基酸。如本文所用,术语“同义密码子”意指编码单一氨基酸的任何和所有密码子。除甲硫氨酸和色氨酸之外,氨基酸由两至六个同义密码子编码。举例来说,在标准遗传密码的情况下,编码氨基酸丙氨酸的四个同义密码子是GCA、GCC、GCG和GCU,指定谷氨酰胺的两个同义密码子是GAA和GAG,并且编码赖氨酸的两个同义密码子是AAA和AAG。
在一些实施方案中,可使用标准密码子优化方法修饰编码C1-抑制剂Fc融合蛋白和/或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的开放阅读框的核酸。用于密码子优化的各种商业算法是可用的,并且可用于实施本发明。通常,密码子优化不改变编码的氨基酸序列。在一些实施方案中,密码子优化可导致氨基酸改变诸如取代、缺失或插入。通常,此类氨基酸改变不实质上改变蛋白质活性。
示例性核酸序列编码具有与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性或同源性的氨基酸序列的C1-抑制剂Fc融合蛋白和C1-抑制剂白蛋白融合蛋白。
在一些实施方案中,核苷酸变化可改变开放阅读框内的同义密码子以与见于被选择来表达C1-抑制剂Fc融合蛋白和/或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的特定异源性细胞中的内源性密码子使用一致。或者或另外,核苷酸变化可改变开放阅读框内的G+C含量以更好匹配见于异源性宿主细胞中存在的内源性核酸序列中的开放阅读框的平均G+C含量。核苷酸变化也可改变见于C1-抑制剂Fc融合蛋白或C1-抑制剂白蛋白融合物序列内的多聚单核苷酸区域或内部调控或结构位点。因此,设想多种经修饰或经优化的核苷酸序列,包括不限于提供C1-抑制剂Fc融合蛋白和/或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白在原核细胞;酵母细胞;昆虫细胞中;以及在哺乳动物细胞中的表达增加的核酸序列。
通常,经修饰的核酸编码具有或不具有氨基酸序列改变的C1-抑制剂Fc融合蛋白和/或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白。在存在氨基酸改变的情况下,此类改变通常不实质上降低C1-抑制剂Fc融合蛋白或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白活性。在一些实施方案中,此类改变增加和/或增强C1-抑制剂Fc融合蛋白或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白活性。活性可指以下非限制性参数清单:半衰期增加、由宿主细胞达成的蛋白质表达增加/升高、所表达蛋白质的稳定性增加、所表达蛋白质的溶解性增加、所表达蛋白质的聚集降低、所表达蛋白质的配制更简单、所表达蛋白质的纯化更简单、所表达蛋白质对pH变化的耐受性增加、蛋白质耐受高pH和低pH条件的能力增加、所表达蛋白质适于在高浓度下配制。
表达载体
可将编码如本申请中所述的C1-抑制剂Fc融合蛋白和/或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的核酸序列分子克隆(插入)至适合载体中以在宿主细胞中增殖或表达。广泛多种表达载体可用于实施本发明,包括不限于原核表达载体;酵母表达载体;昆虫表达载体和哺乳动物表达载体。适于本发明的示例性载体包括但不限于基于病毒的载体(例如基于AAV的载体、基于逆转录病毒的载体、基于质粒的载体)。在一些实施方案中,可将编码C1-抑制剂Fc融合蛋白的核酸序列插入合适的载体中。在一些实施方案中,可将编码C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的核酸序列插入合适的载体中。通常,使编码C1-抑制剂Fc融合蛋白或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的核酸可操作地连接于各种调控序列或元件。
调控序列或元件
可将各种调控序列或元件并入适于本发明的表达载体中。示例性调控序列或元件包括但不限于启动子、增强子、阻遏子或抑制子、5’未翻译(或非编码)序列、内含子、3’未翻译(或非编码)序列。
如本文所用,“启动子”或“启动子序列”是能够结合(例如直接或通过其它启动子结合的蛋白质或物质)细胞中的RNA聚合酶,并且启动编码序列的转录的DNA调控区。一般来说,启动子序列在它的3’末端由转录起始位点结合,并且在上游(5’方向)延伸以包括为在任何水平上启动转录所必需的最小数目的碱基或元件。可使启动子可操作地与以下各物缔合或可操作地连接于以下各物:表达控制序列(包括增强子和阻遏子序列)或待表达的核酸。在一些实施方案中,启动子可为诱导型启动子。在一些实施方案中,诱导型启动子可为单向或双向(bio-directional)启动子。在一些实施方案中,启动子可为组成型启动子。在一些实施方案中,启动子可为杂合启动子,其中含有转录调控区的序列从一个来源获得,并且含有转录起始区的序列从第二来源获得。用于使控制元件连接于转基因内的编码序列的系统在本领域中是熟知的(一般性分子生物和重组DNA技术描述于Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中,所述书籍以引用的方式并入本文)。适于插入转基因以在各种宿主细胞中在多种生长和诱导条件下表达的商业载体在本领域中也是熟知的。
在一些实施方案中,特异性启动子可用于控制转基因在哺乳动物宿主细胞中的表达,诸如但不限于SRα启动子(Takebe等,Molec.and Cell.Bio.8:466-472(1988))、人CMV立即早期启动子(Boshart等,Cell 41:521-530(1985);Foecking等,Gene 45:101-105(1986))、人CMV启动子、人CMV5启动子、鼠类CMV立即早期启动子、EF1-α-启动子、用于肝特异性表达的杂合CMV启动子(例如通过使CMV立即早期启动子与人α-1-抗胰蛋白酶(HAT)或白蛋白(HAL)启动子的转录启动子元件缀合来制备)、或用于肝细胞瘤特异性表达的启动子(例如其中使人白蛋白的转录启动子元件(HAL;约1000bp)或人α-1-抗胰蛋白酶的转录启动子元件(HAT,约2000bp)与人α-1-微球蛋白和尿抑胰酶素(bikunin)前体基因(AMBP)的145长度的增强子元件组合;HAL-AMBP和HAT-AMBP);SV40早期启动子区域(Benoist等,Nature290:304-310(1981))、黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)立即早期启动子、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441-1445(1981));或金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等,Nature 296:39-42(1982))。在一些实施方案中,哺乳动物启动子是组成型启动子,诸如但不限于次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPTR)启动子、腺苷脱氨酶启动子、丙酮酸激酶启动子、β-肌动蛋白启动子以及为本领域普通技术人员所知的其它组成型启动子。
在一些实施方案中,特异性启动子可用于控制转基因在原核宿主细胞中的表达,诸如但不限于β-内酰胺酶启动子(Villa-Komaroff等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727-3731(1978));tac启动子(DeBoer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25(1983));T7启动子、T3启动子、M13启动子或M16启动子;控制转基因在酵母宿主细胞中的表达,诸如但不限于GAL1、GAL4或GAL10启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶III(TDH3)启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶II(TDH2)启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶I(TDH1)启动子、丙酮酸激酶(PYK)启动子、烯醇酶(ENO)启动子或磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子。
在一些实施方案中,启动子可为病毒启动子,其中许多能够调控转基因在包括哺乳动物细胞的若干宿主细胞类型中的表达。已显示会驱动编码序列在真核细胞中组成型表达的病毒启动子包括例如猿猴病毒启动子、单纯疱疹病毒启动子、乳头状瘤病毒启动子、腺病毒启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、莫洛尼(Moloney)鼠类白血病病毒和其它逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)、单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子以及为本领域普通技术人员所知的其它病毒启动子。
在一些实施方案中,表达载体的基因控制元件也可包括分别涉及启动转录和翻译的5’非转录序列和5’非翻译序列,诸如TATA框、加帽序列、CAAT序列、Kozak序列等。增强子元件可任选用于增加待表达的多肽或蛋白质的表达水平。已显示会在哺乳动物细胞中起作用的增强子元件的实例包括如Dijkema等,EMBO J.(1985)4:761中所述的SV40早期基因增强子以及源于劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复序列(LTR)(如Gorman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)79:6777中所述)和人巨细胞病毒(如Boshart等,Cell(1985)41:521中所述)的增强子/启动子。表达载体的遗传控制元件也将包括涉及终止转录和翻译的3’非转录序列和3’非翻译序列。分别来说,诸如用于稳定化和加工从启动子转录的mRNA的3’末端的多聚腺苷酸化(polyA)信号。Poly A信号包括例如兔β球蛋白polyA信号、牛生长激素polyA信号、鸡β球蛋白终止子/polyA信号或SV40晚期polyA区域。
可选择标记
表达载体将优选但任选包括至少一种可选择标记。在一些实施方案中,可选择标记是编码可操作地连接于一种或多种遗传调控元件,以给予宿主细胞在细胞毒性化学物质和/或药物存在下生长时维持活力的能力的抗性基因的核酸序列。在一些实施方案中,可选择剂可用于维持表达载体保留在宿主细胞内。在一些实施方案中,可选择剂可用于防止表达载体内的转基因序列的修饰(即甲基化)和/或沉默。在一些实施方案中,可选择剂用于维持载体在宿主细胞内游离型表达。在一些实施方案中,可选择剂用于促进转基因序列稳定整合至宿主细胞基因组中。在一些实施方案中,试剂和/或抗性基因可包括但不限于用于真核宿主细胞的甲氨蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR,美国专利号4,399,216;4,634,665;4,656,134;4,956,288;5,149,636;5,179,017)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、博莱霉素(zeomycin)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS,美国专利号5,122,464;5,770,359;5,827,739);用于原核宿主细胞的四环素、氨苄青霉素、卡那霉素或氯霉素;和用于酵母宿主细胞的URA3、LEU2、HIS3、LYS2、HIS4、ADE8、CUP1或TRP1。
可将表达载体转染、转化或转导至宿主细胞中。如本文所用,术语“转染”、“转化”和“转导”全都是指将外源性核酸序列引入宿主细胞中。在一些实施方案中,将含有编码C1-抑制剂Fc融合蛋白和/或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的核酸序列的表达载体同时转染、转化或转导至宿主细胞中。在一些实施方案中,将含有编码C1-抑制剂Fc融合蛋白和/或C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的核酸序列的表达载体依序转染、转化或转导至宿主细胞中。举例来说,可首先将编码C1-抑制剂融合蛋白的载体转染、转化或转导至宿主细胞中,随后转染、转化或转导编码一种或多种优选通过增加唾液酸化来增强所表达C1-抑制剂融合蛋白的糖基化的蛋白质的载体,并且反之亦然。
本领域中熟知的转化、转染和转导方法的实例包括脂质体递送即Hawley-Nelson,Focus 15:73(1193)的lipofectamineTM(Gibco BRL)方法、电穿孔、Graham和van der Erb,Virology,52:456-457(1978)的CaPO4递送方法、DEAE-右旋糖苷介导的递送、显微注射、基因枪粒子递送、聚凝胺介导的递送、阳离子介导的脂质递送、转导和病毒性感染,诸如像逆转录病毒、慢病毒、腺病毒腺相关病毒和杆状病毒(昆虫细胞)。细胞宿主转化的一般性方面已在本领域中加以描述,诸如由Axel在美国专利号4,399,216中描述;Sambrook(上文),第1-4和16-18章;Ausubel(上文),第1、9、13、15和16章。对于用于转化哺乳动物细胞的各种技术,参见Keown等,Methods in Enzymology(1989),Keown等,Methods in Enzymology,185:527-537(1990),以及Mansour等,Nature,336:348-352(1988)。
一旦引入细胞内部,表达载体即可稳定整合在基因组中,或以染色体外构建体形式存在。载体也可被扩增,并且多个拷贝可存在或整合于基因组中。在一些实施方案中,本发明的细胞可含有编码C1-抑制剂融合蛋白的核酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个拷贝。在一些实施方案中,本发明的细胞可含有编码C1-抑制剂融合蛋白的核酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个拷贝。在一些实施方案中,本发明的细胞可含有编码C1-抑制剂Fc融合蛋白与一种或多种优选通过增加唾液酸化来增强所表达C1-抑制剂融合蛋白的糖基化的蛋白质两者的核酸的多个拷贝(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个)。也可通过本文所述的各种方法来操纵唾液酸化。在不希望受任何理论束缚下,发现唾液酸化降低与所公开构建体的肝素结合增加,由此阻止C1-INH结合位点结合靶标相关联。肝素结合也增加内化至溶酶体中,由此使清除率增加的可能性。
宿主细胞
如本文所用,术语“宿主细胞”是指可用于产生重组C1-抑制剂融合蛋白的细胞。具体而言,宿主细胞适于在大规模上产生重组C1-抑制剂融合蛋白。合适的宿主细胞可源于多种生物体,包括但不限于哺乳动物、植物、鸟(例如禽类系统)、昆虫、酵母和细菌。在一些实施方案中,宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中,合适的宿主细胞被工程改造以改进所表达重组C1-抑制剂融合蛋白的糖基化特征。在本发明的一些实施方案中,C1-INH多肽与天然血浆源性C1-INH的类似部分具有相同或类似糖基化特征。在一些实施方案中,C1-INH多肽与天然血浆源性C1-INH具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%等同聚糖。在一些实施方案中,C1-INH融合蛋白的糖基化特征具有人源化糖基化特征。在一些实施方案中,相较于天然血浆源性C1-INH,C1-INH融合蛋白具有增加的唾液酸化。
改进糖基化特征可指使唾液酸化增加和/或使糖基化特征人源化,例如在经工程改造细胞中表达包含C1-INH多肽的重组C1-抑制剂融合蛋白,由此产生相比于在非工程改造细胞中表达的C1-INH多肽,更类似于天然人C1-INH的糖基化特征。改进也可指相较于Ruconest,使C1-INH融合物的糖基化特征增加、增强和/或优化。
改变、控制、操纵、改进、增强和/或优化蛋白质的糖基化特征的各种方法在本领域中是已知的。可被优化的糖基化特征表征包括聚糖残基的数目、聚糖残基连接位置、聚糖连接方式(例如键的类型)、聚糖连接过程、和连接于蛋白质或多肽的聚糖残基的身份。本发明的融合蛋白的任何部分的糖基化特征都被预期作为适于糖基化优化的目标。本发明的融合蛋白的可针对糖基化加以优化的部分包括但不限于本文公开的C1-INH多肽、Fc结构域、白蛋白多肽和/或接头。涵盖控制糖基化特征的这些方法,以及熟练人士将鉴于本公开而理解为在优化本发明的融合蛋白的糖基化方面具有效用的尚有待于发现的其它方法。改变、控制、操纵、改进、增强和/或优化本发明的C1-INH蛋白和多肽的糖基化特征的方法包括体外、原位和体内方法。
在一些实施方案中,通过翻译后和/或化学修饰所表达蛋白质或多肽来改变所表达蛋白质或多肽的糖基化特征。
在一些实施方案中,相较于尚未经受翻译后和/或化学修饰,具有相同序列的C1-INH融合蛋白,已经受所述翻译后和/或化学修饰的C1-INH融合蛋白具有改变、改进、增强、人源化和/或优化的糖基化特征。在一些实施方案中,相较于尚未经受翻译后和/或化学修饰,具有相同序列的C1-INH融合蛋白,已经受所述翻译后和/或化学修饰的C1-INH融合蛋白具有改变、改进、增强、人源化和/或优化的唾液酸化特征。
在一些实施方案中,相较于由尚未被工程改造以增强糖基化的相同细胞系表达,具有相同序列的C1-INH融合蛋白,由被工程改造以增强糖基化的细胞系表达的C1-INH融合蛋白具有改变、改进、增强、人源化和/或优化的糖基化特征。在一些实施方案中,相较于由尚未被工程改造以增强唾液酸化的相同细胞系表达,具有相同序列的C1-INH融合蛋白,由被工程改造以增强唾液酸化的细胞系表达的C1-INH融合蛋白具有改变、改进、增强、人源化和/或优化的唾液酸化特征。
在一些实施方案中,相较于由在各种条件下培养以增强糖基化的细胞系表达,具有相同序列的C1-INH融合蛋白,由在各种条件下培养以增强糖基化的细胞系表达的C1-INH融合蛋白具有改变、改进、增强、人源化和/或优化的糖基化特征。在一些实施方案中,相较于由在各种条件下培养以增强唾液酸化的细胞系表达,具有相同序列的C1-INH融合蛋白,由在各种条件下培养以增强唾液酸化的细胞系表达的C1-INH融合蛋白具有改变、改进、增强、人源化和/或优化的唾液酸化特征。
在一些实施方案中,相较于Ruconest,C1-INH融合蛋白具有改变、改进、增强、人源化和/或优化的糖基化特征。在一些实施方案中,相较于人血浆源性C1-INH,C1-INH融合蛋白具有改变、改进、增强、人源化和/或优化的糖基化特征。
在一些实施方案中,操纵细胞培养条件以实现表达具有所需糖基化特征的蛋白质。这些细胞培养条件包括控制产生和培养过程(包括培养时长),向培养基中添加添加剂,共同表达用以通过增加糖基化来增强糖基化的基因,和/或工程改造细胞以剔除与聚糖降解相关的酶(例如唾液酸酶),阻止其表达,使其失活或对其进行破坏。适于操纵糖基化的方法包括但不限于例如美国专利号5,047,335;5,096,816;5,705,364;7,645,609;8,273,723;8,524,477;8,617,878;8,871,723;PCT公布号WO2006/106348;WO2007/095506;WO2008/025856;WO2010/007214;WO2010/099394;和WO2013/093760中所述的那些,所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
对宿主细胞和经转染宿主细胞的特定克隆进行选择也可用于增强糖基化。增强糖基化的其它方法包括开发用以富集具有所需糖基化特征的蛋白质或多肽的纯化方法。
操纵蛋白质的唾液酸化特征的各种方法在本领域中是已知的。本发明涵盖这些方法以及尚有待于发现的其它方法。操纵本发明的C1-INH蛋白和多肽的唾液酸化特征的方法包括体外、原位和体内方法。在一些实施方案中,通过表达后化学修饰所表达蛋白质或多肽来改变所表达蛋白质或多肽的唾液酸化特征。在一些实施方案中,操纵细胞培养条件以实现表达具有所需唾液酸化特征的蛋白质。这些细胞培养条件包括控制产生和培养过程(包括培养时长),向培养基中添加添加剂,和/或共同表达用以增强唾液酸化的基因。对宿主细胞和经转染宿主细胞的特定克隆进行选择也可用于增强唾液酸化。增强唾液酸化的其它方法包括开发用以富集具有所需唾液酸化特征的蛋白质或多肽的纯化方法。
也可通过本文所述的各种方法来操纵唾液酸化。在不希望受任何理论束缚下,发现唾液酸化降低与所公开构建体的肝素结合增加,由此阻止C1-INH结合位点结合靶标相关联。肝素结合也增加内化至溶酶体中,由此使清除率增加的可能性。
哺乳动物细胞系
易经受细胞培养以及多肽表达的任何哺乳动物细胞或细胞类型都可根据本发明用作宿主细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括人胚肾293细胞(HEK293)、HeLa细胞;BALB/c小鼠骨髓瘤株系(NSO/l,ECACC编号:85110503);人视网膜母细胞(PER.C6(CruCell,Leiden,The Netherlands));由SV40转化的猴肾CV1株系(COS-7,ATCCCRL 1651);人胚肾株系(被亚克隆以悬浮培养生长的293或293细胞,Graham等,J.GenVirol.,36:59(1977));幼小仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980));小鼠塞尔托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL 2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34);水牛大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人肺细胞(W138,ATCC CCL 75);人肝细胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68(1982));MRC 5细胞;FS4细胞;和人肝细胞瘤株系(Hep G2)。在一些实施方案中,合适的哺乳动物细胞不是内体酸化缺陷细胞。
另外,表达多肽或蛋白质的许多可商购和非可商购获得的杂交瘤细胞系可根据本发明加以利用。本领域技术人员将了解杂交瘤细胞系可能具有不同营养要求和/或可能要求不同培养条件以达成最优生长和多肽或蛋白质表达,并且将能够根据需要修改条件。
非哺乳动物细胞系
易经受细胞培养以及多肽表达的任何非哺乳动物源性细胞或细胞类型都可根据本发明用作宿主细胞。可根据本发明使用的非哺乳动物宿主细胞和细胞系的非限制性实例包括源于以下的细胞和细胞系:对于酵母来说的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosacccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica);对于昆虫来说的草地贪夜蛾(Sodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusis ni)、黑腹果蝇(Drosophila melangoster)和烟草天蛾(Manducasexta);以及对于细菌来说的大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenifonnis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(Clostridiaperfringens)、艰难梭菌(Clostridia difficile);和来自两栖动物的爪蟾(XenopusLaevis)。
适合于贴壁生长相对于悬浮生长
在某些实施方案中,基于在选择用于培养细胞的特定条件下的某些优选属性或生长来选择用于产生细胞系的宿主细胞。本领域技术人员应了解,所述属性可基于确定株系(即可商购获得的经表征细胞系)的已知特征和/或性状或通过经验评估来确定。在一些实施方案中,细胞系可由于它能够在细胞滋养层上生长而被选择。在一些实施方案中,细胞系可由于它能够悬浮生长而被选择。在一些实施方案中,细胞系可由于它能够以贴壁细胞单层形式生长而被选择。在一些实施方案中,此类细胞可与任何组织培养容器或用合适的贴壁基质处理的任何容器一起使用。在一些实施方案中,合适的贴壁基质选自由以下组成的组:胶原蛋白(例如胶原蛋白I、II、II或IV)、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白(vitronectin)、纤维蛋白原、BD MatrigelTM、基底膜基质、硫酸皮肤素蛋白聚糖、聚D-赖氨酸和/或其组合。在一些实施方案中,可选择贴壁宿主细胞,并且在特定生长条件下加以改进以进行悬浮生长。改进贴壁细胞以进行悬浮生长的此类方法在本领域中是已知的。举例来说,可通过随时间从生长培养基逐渐移除动物血清来使细胞适应于悬浮培养生长。
细胞系选择和评估
根据本发明,被工程改造以表达重组C1-INH融合蛋白的细胞由于它能够在商业可行规模上产生重组C1-INH融合蛋白而被选择。具体而言,根据本发明的经工程改造细胞能够在高水平下和/或以高度酶活性产生重组C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,一旦在细胞培养条件(例如标准大规模悬浮或贴壁培养条件)下培育,所需细胞即可以是或大于约5皮克/细胞/天(例如大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100皮克/细胞/天)的量产生C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,一旦在细胞培养条件(例如标准大规模悬浮或贴壁培养条件)下培育,所需细胞即能够以在约5-100皮克/细胞/天(例如约5-90皮克/细胞/天、约5-80皮克/细胞/天、约5-70皮克/细胞/天、约5-60皮克/细胞/天、约5-50皮克/细胞/天、约5-40皮克/细胞/天、约5-30皮克/细胞/天、约10-90皮克/细胞/天、约10-80皮克/细胞/天、约10-70皮克/细胞/天、约10-60皮克/细胞/天、约10-50皮克/细胞/天、约10-40皮克/细胞/天、约10-30皮克/细胞/天、约20-90皮克/细胞/天、约20-80皮克/细胞/天、约20-70皮克/细胞/天、约20-60皮克/细胞/天、约20-50皮克/细胞/天、约20-40皮克/细胞/天、约20-30皮克/细胞/天)的范围内的量产生C1-INH融合蛋白。
C1-INH的半衰期可受糖基化特征影响。如上所讨论,本发明的细胞可被工程改造以改进所表达C1-INH融合蛋白的糖基化特征。举例来说,已显示(PharmingN.V.)作为一种唾液酸化程度较小和/或与血浆源性人C1-INH具有不同唾液酸化分布的重组C1-INH多肽,相比于血浆源性人C1-INH,具有较短半衰期。Davis,B.和Bernstein,J.A.,Conestat alfa for the treatment of angioedema attacks,Ther Clin Risk Manag.7:265–273(2011);Koles,K.等,Influence of lactation parameters on the N-glycosylation of recombinant human C1inhibitor isolated from the milk oftransgenic rabbits,Glycobiology,14(11):979-986(2004);Koles,K.等,N-and O-glycans of recombinant human C1inhibitor expressed in the milk of transgenicrabbits,Glycobiology,14(1):51-64(2004)。
细胞培养基和培养条件
各种细胞培养基和培养条件可用于使用根据本发明的经工程改造细胞产生重组C1-INH融合蛋白。举例来说,可在含血清或无血清培养基中产生重组C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,在无血清培养基中产生重组C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,在无动物物质培养基即缺乏动物源性组分的培养基中产生重组C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,在化学成分确定的培养基中产生重组C1-INH融合蛋白。如本文所用,术语“化学成分确定的营养培养基”是指其中基本上所有化学组分都是已知的培养基。在一些实施方案中,化学成分确定的营养培养基不含动物源性组分诸如血清、血清源性蛋白质(例如白蛋白或胎球蛋白)和其它组分。在一些情况下,化学成分确定的培养基包含一种或多种蛋白质(例如蛋白质生长因子或细胞因子。)在一些情况下,化学成分确定的营养培养基包含一种或多种蛋白质水解物。在其它情况下,化学成分确定的营养培养基是无蛋白质培养基,即不含有蛋白质、水解物或组成未知的组分的无血清培养基。
在一些实施方案中,化学成分确定的培养基可补充以一种或多种动物源性组分。此类动物源性组分包括但不限于胎牛血清、马血清、山羊血清、驴血清、人血清和血清源性蛋白质诸如白蛋白(例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。
各种细胞培养条件可用于在大规模上产生重组C1-INH融合蛋白,包括但不限于滚瓶培养、生物反应器分批培养、灌注培养和生物反应器补料-分批培养。在一些实施方案中,由悬浮培养的细胞产生重组C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,由贴壁细胞产生重组C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,灌注培养用于控制所表达蛋白质的糖基化。示例性灌注培养方法包括但不限于例如美国专利号6,528,286和PCT公布号WO1996/039488A1中所述的那些,所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
示例性细胞培养基和培养条件描述于实施例章节中。所述实施例不意图具有限制性。
纯化所表达的C1-INH融合蛋白
各种方法可用于纯化或分离根据本文所述的各种方法产生的C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,所表达C1-INH融合蛋白被分泌至培养基中,并且因此可如例如通过离心或过滤来移除细胞和其它固体,作为纯化过程中的第一步。或者或另外,所表达的C1-INH融合蛋白结合于宿主细胞的表面。在这个实施方案中,使表达多肽或蛋白质的宿主细胞溶解以进行纯化。溶解哺乳动物宿主细胞可通过为本领域普通技术人员所熟知的许多手段来实现,包括用玻璃珠物理破坏和暴露于高pH条件。
C1-INH融合蛋白可通过标准方法来分离和纯化,所述方法包括但不限于色谱法(例如离子交换、亲和、尺寸排阻和羟磷灰石色谱法)、凝胶过滤、离心、或溶解性差异、乙醇沉淀或通过用于纯化蛋白质的任何其它可用技术(参见例如Scopes,ProteinPurification Principles and Practice第2版,Springer-Verlag,New York,1987;Higgins,S.J.和Hames,B.D.(编),Protein Expression:A Practical Approach,OxfordUniv Press,1999;以及Deutscher,M.P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(编),Guide toProtein Purification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series,第182卷),Academic Press,1997,全都以引用的方式并入本文)。特别是对于免疫亲和色谱法,可通过使蛋白质结合亲和柱来对它进行分离,所述亲和柱包含针对该蛋白质所产生,并且固定于固定载体的抗体。或者,可通过标准重组技术来使亲和标签诸如流感衣壳序列、多聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶连接于蛋白质以允许通过穿过适当亲和柱来达成简易纯化。可在任何或所有阶段添加蛋白酶抑制剂诸如苯基甲基磺酰基氟(PMSF)、亮肽素、抑肽素或抑肽酶以降低或消除在纯化过程期间多肽或蛋白质的降解。当必须使细胞溶解以分离和纯化所表达多肽或蛋白质时,特别需要蛋白酶抑制剂。
IgG1LALA Fc全长C1-抑制剂的蛋白质A HP纯化显示于图3中。蛋白质A捕获融合蛋白在小规模上是成功的,但当按比例扩大时观察到聚集。在不希望受任何理论束缚下,为洗脱所必需的低pH似乎导致聚集以及使C1-INH失活。在一些实施方案中,纯化不涉及低pH步骤。在一些实施方案中,使融合蛋白突变以使蛋白质在低pH下稳定。在其它实施方案中,添加剂用于保护C1-INH融合蛋白免遭在低pH洗脱步骤期间聚集。在其它实施方案中,非蛋白质A树脂用于纯化蛋白质。
避免与蛋白质A纯化C1-INH Fc融合蛋白相关的问题的示例性纯化方法描述于以下实施例章节中。适于纯化的树脂包括但不限于阴离子交换树脂、白蛋白亲和树脂、C1抑制剂亲和树脂和蛋白质A树脂。在一些实施方案中,不要求pH下降的纯化方法是优选的。在一些实施方案中,不要求酸性pH用于洗脱的纯化方法是优选的。在其它实施方案中,利用防止聚集的稳定剂。在一些实施方案中,防止聚集的稳定剂用于要求pH下降的方法中。合适的稳定剂的非限制性实例包括EDTA。
适于纯化本发明的C1-INH融合蛋白的方法包括但不限于例如美国专利号5,276,141;US7384754;8,802,816;PCT公布号WO2012107572;和WO2013009526中所述的那些,所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
药物组合物
本发明进一步提供一种含有本文所述的重组C1-INH融合蛋白和生理上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。载体和重组C1-INH融合蛋白可为无菌的。制剂应适合施用模式。
合适的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液(例如NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶(gum arabic)、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(诸如乳糖、直链淀粉或淀粉)、糖(诸如甘露糖醇、蔗糖或其它糖)、右旋糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘稠石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等以及其组合。必要时,可使药物制剂与不有害地与活性化合物反应或干扰它们的活性的助剂(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳族物质等)混合。在一优选实施方案中,使用适于静脉内施用的水溶性载体。
必要时,合适的药物组合物或药剂也可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可为液体溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂。组合物也可用传统粘合剂和载体诸如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体,诸如药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
可根据常规程序将药物组合物或药剂配制成适合于向人类施用的药物组合物。举例来说,在一些实施方案中,用于静脉内施用的组合物通常是于无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时,组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位处的疼痛。通常,单独或以单位剂型混合在一起来将成分供应于诸如安瓿或药囊的指示活性剂的量的气密容器中,所述单位剂型例如呈干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当组合物待通过输注施用时,它可用含有无菌药用级水、盐水或右旋糖/水的输注瓶分配。当组合物通过注射施用时,可提供含无菌注射用水或盐水的安瓿以使成分可在施用之前加以混合。
可将本文所述的重组C1-INH融合蛋白配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括以游离氨基形成的盐,诸如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等获得的那些;以及以游离羧基形成的盐,诸如由钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等获得的那些。
一优选制剂包含50mM NaPO4(pH 7.2)、50mM山梨糖醇和150mM甘氨酸。制剂可为液体,或可被冻干并且在施用之前复原。
施用途径
本文所述的重组C1-INH融合蛋白(或含有本文所述的重组C1-INH融合蛋白的组合物或药剂)通过任何适当途径来施用。在一些实施方案中,重组C1-INH融合蛋白或含有其的药物组合物被全身性施用。全身性施用可为静脉内、皮内、颅内、鞘内、吸入、经皮(局部)、眼内、肌肉内、皮下、肌肉内、口服和/或经粘膜施用。在一些实施方案中,重组C1-INH融合蛋白或含有其的药物组合物被皮下施用。如本文所用,术语“皮下组织”定义为紧靠在皮肤下的一层松散、不规则结缔组织。举例来说,皮下施用可通过向包括但不限于大腿区域、腹部区域、臀区域或肩胛区域的区域中注射组合物来进行。在一些实施方案中,重组C1-INH融合蛋白或含有其的药物组合物被静脉内施用。在一些实施方案中,重组C1-INH融合蛋白或含有其的药物组合物被口服施用。在一些实施方案中,重组C1-INH融合蛋白或含有其的药物组合物被颅内施用。在一些实施方案中,重组C1-INH融合蛋白或含有其的药物组合物被鞘内施用。必要时,可并行使用一种以上途径。
在一些实施方案中,通过鞘内施用来向受试者施用重组C1-INH融合蛋白或含有其的药物组合物。如本文所用,术语“鞘内施用”或“鞘内注射”是指向脊髓管(脊髓周围的鞘内间隙)中注射。可使用各种技术,包括不限于通过钻孔或脑池或腰椎穿刺等进行侧向脑室注射。在一些实施方案中,根据本发明的“鞘内施用”或“鞘内递送”是指通过腰部区或区域进行鞘内施用或递送,即腰部鞘内施用或递送。如本文所用,术语“腰部区域”或“腰部区”是指第三与第四腰部(下背部)脊椎之间的区域,并且更具包容性地来说,是指脊柱的L2-S1区域。
在一些实施方案中,通过皮下(即在皮肤下)施用来向受试者施用重组C1-INH融合蛋白或含有其的药物组合物。出于所述目的,可使用注射器注射制剂。然而,用于施用制剂的其它装置是可用的,诸如注射装置(例如Inject-easeTM和GenjectTM装置);注射笔(诸如GenPenTM);无针装置(例如MediJectorTM和BioJectorTM);和皮下贴片递送系统。
在一些实施方案中,鞘内施用可与其它施用途径(例如静脉内、皮下、肌肉内、胃肠外、经皮或经粘膜(例如口服或经鼻))联合使用。
本发明涵盖单次以及多次施用治疗有效量的本文所述的重组C1-INH融合蛋白或含有其的药物组合物。可视受试者的病状(例如溶酶体贮积病)的性质、严重性和程度而定,以定期间隔施用重组C1-INH融合蛋白或含有其的药物组合物。在一些实施方案中,可以定期间隔(例如每年一次、每六个月一次、每五个月一次、每三个月一次、每两月(每两个月一次)、每月(每个月一次)、每两周(每两周一次)、每周、每日或连续)定期施用治疗有效量的重组C1-INH融合蛋白或含有其的药物组合物。
在一些实施方案中,施用仅在个体中产生局部作用,而在其它实施方案中,施用遍及个体的多个部分产生作用,例如全身性作用。通常,施用导致向一个或多个靶标组织递送重组C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,向一个或多个靶标组织递送重组C1-INH融合蛋白,所述组织包括但不限于心脏、脑、皮肤、血液、脊髓、横纹肌(例如骨骼肌)、平滑肌、肾、肝、肺和/或脾。在一些实施方案中,向心脏递送重组C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,向中枢神经系统,特别是脑和/或脊髓递送重组C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,向三头肌、胫骨前肌、比目鱼肌、腓肠肌、二头肌、斜方肌、三角肌、四头肌和/或横隔膜递送重组C1-INH融合蛋白。
剂型和给药方案
在一些实施方案中,以治疗有效量和/或根据与特定所需结果相关联(例如与防治补体介导的慢性疾病诸如HAE相关联)的给药方案施用组合物。
待根据本发明施用的特定剂量或量可例如视以下而变化:所需结果的性质和/或程度、施用途径和/或时机选择的细节、和/或一种或多种特征(例如重量、年龄、个人史、遗传特征、生活方式参数、心脏缺陷的严重性和/或心脏缺陷的风险水平等或其组合)。所述剂量或量可由普通技术人员确定。在一些实施方案中,根据标准临床技术确定适当剂量或量。或者或另外,在一些实施方案中,通过使用一种或多种体外或体内测定以帮助确定待施用的合乎需要或最优剂量范围或量来确定适当剂量或量。
在各种实施方案中,以治疗有效量施用重组C1-INH融合蛋白。通常,治疗有效量足以实现对受试者有意义的益处(例如防治、治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜伏疾病或病状)。通常,向有此需要的受试者施用的治疗剂(例如重组C1-INH融合蛋白)的量将取决于所述受试者的特征。所述特征包括受试者的病状、疾病严重性、总体健康状况、年龄、性别和体重。本领域普通技术人员将易于能够确定视这些和其它相关因素而定的适当剂量。此外,客观测定与主观测定两者均可任选用于确定最优剂量范围。在一些特定实施方案中,待施用的适当剂量或量可根据由体外或动物模型测试系统获得的剂量-响应曲线外推。
在一些实施方案中,提供呈药物制剂形式的组合物。在一些实施方案中,药物制剂是或包含单位剂量以根据与实现HAE发作的发生率或风险降低相关联的给药方案来施用。
在一些实施方案中,以单次剂量形式施用包含本文所述的重组C1-INH融合蛋白的制剂。在一些实施方案中,以定期间隔施用包含本文所述的重组C1-INH融合蛋白的制剂。如本文所用,以某一“间隔”施用指示定期施用治疗有效量(不同于一次性给药)。可通过标准临床技术确定间隔。在一些实施方案中,每两月、每月、每月两次、每三周、每两周、每周、每周两次、每周三次、每日、每日两次或每六小时施用包含本文所述的重组C1-INH融合蛋白的制剂。视个体的需要而定,用于单一个体的施用间隔无需是固定间隔,而是可随时间改变。
通常以可包含多个单位剂量的给药方案施用治疗有效量。对于任何特定治疗性蛋白质,治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可例如视施用途径、与其它药物制剂的组合而变化。此外,用于任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于多种因素,包括所治疗病症和病症的严重性;所用具体药物制剂的活性;所用具体组合物;患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和膳食;施用时间、施用途径和/或所用具体融合蛋白的排泄或代谢速率;治疗的持续时间;以及如医学领域中所熟知的类似因素。
如本文所用,术语“每两月”意指每两个月施用一次(即每两个月一次);术语“每月”意指每个月施用一次;术语“每三周”意指每三周施用一次(即每三周一次);术语“每两周”意指每两周施用一次(即每两周一次);术语“每周”意指每周施用一次;并且术语“每天”意指每天施用一次。
在一些实施方案中,以定期间隔无限期地施用包含本文所述的重组C1-INH融合蛋白的制剂。在一些实施方案中,以定期间隔持续确定时期施用包含本文所述的重组C1-INH融合蛋白的制剂。
应进一步了解对于任何特定受试者,应根据个体需要和施用酶补充疗法或监督酶补充疗法的施用的人士的专业判断随时间调整具体剂量方案,并且本文阐述的剂量范围仅具有示例性而不意图限制要求保护的发明的范围或实施。
组合疗法
在一些实施方案中,与一种或多种当前用于治疗补体介导的疾病的已知治疗剂(例如皮质类固醇)组合施用重组C1-INH融合蛋白。在一些实施方案中,根据它的标准或核准给药方案和/或时程施用已知治疗剂。在一些实施方案中,根据相较于它的标准或核准给药方案和/或时程被改变的方案施用已知治疗剂。在一些实施方案中,这种改变的方案在以下方面不同于标准或核准给药方案:一个或多个单位剂量的量被改变(例如降低或增加),和/或给药的频率被改变(例如一个或多个在单位剂量之间的间隔被扩大,从而导致频率较低,或所述间隔被降低,从而导致频率较高)。
A.病症
优选实施方案是治疗慢性病症。
在一些实施方案中,由本发明提供的融合蛋白适于与补体介导的病症相关的急性发作,例如NMOSD AMR和HAE事件。这些发作可为长期的或短期的。在一些实施方案中,疾病或病症是慢性的。在一些实施方案中,以防治性方式使用本发明的组合物和方法。可使用本文公开的组合物和方法治疗的示例性补体介导的疾病包括但不限于遗传性血管性水肿、抗体介导的排斥、视神经脊髓炎谱系病症、创伤性脑损伤、脊髓损伤、缺血性脑损伤、灼烧损伤、中毒性表皮坏死溶解、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、中风、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变(CIDP)、重症肌无力、多灶性运动神经病变。
实施例
本发明的其它特征、目标和优势在随后实施例中是显而易知的。然而,应了解尽管指示本发明的实施方案,但实施例仅通过说明而非限制方式给出。在本发明的范围内的各种变化和修改将根据实施例而变得为本领域技术人员显而易知。
实施例1.Fc融合蛋白
这个实施例说明各种示例性融合蛋白构建体和此类融合蛋白构建体在哺乳动物细胞中的瞬时或按比例扩大表达。如以下所示,使野生型或突变Fc部分融合于全长(1-478个氨基酸)或截短(98-478个氨基酸)的人C1-抑制剂。
A.Fc-C1-抑制剂融合物表达构建体
根据上述方法制备全长C1-抑制剂与N末端IgG1 Fc的融合蛋白,其具有以下氨基酸序列(Fc部分加下划线):
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:11).
根据上述方法制备截短的C1-抑制剂与N末端IgG1 Fc的融合蛋白,其具有以下氨基酸序列(Fc部分加下划线):
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ IDNO:12).
由于C1-INH多肽的截短部分上的丝氨酸和苏氨酸残基被移除,所以具有N末端IgG1 Fc的截短的C1-抑制剂消除大量碳水化合物位点。这些氨基酸具有在翻译后加工时变成糖基化的OH部分。在不希望受任何理论束缚下,消除这个碳水化合物会降低通过去唾液酸糖蛋白受体来对分子的潜在清除,此可延长Fc-C1-抑制剂融合蛋白的半衰期。
在不希望受任何理论束缚下,去唾液酸糖蛋白不是唯一清除机理。也有基于存在其它聚糖的主动清除途径。Fc结构域不结合FcRN受体直至复合物已被内化在内体中。内体内的pH下降允许发生结合。在一些实施方案中,通过操纵C1-INH融合构建体的糖基化特征,主动清除过程得以减少、减缓和/或消除。这允许被动Fc再循环过程有效增加半衰期。在一些实施方案中,截短的C1-INH多肽是优选的。截短可移除与主动清除相关的糖基化部分。此外,截短形式在尺寸方面较小,此可增加吸收,特别是在皮下施用时。
IgG1 LALA突变消除可由于野生型IgG1 Fc序列而发生的补体活化和ADCC。制备全长C1-INH IgG1 Fc效应物失效构建体与截短的C1-INH IgG1 Fc效应物失效构建体两者。
根据上述方法制备具有N末端IgG1 LALA Fc的全长C1-抑制剂,其具有以下氨基酸序列(Fc部分加下划线,LALA突变用粗体表示):
DKTHTCPPCPAPE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGKNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:13).
根据上述方法制备具有N末端IgG1 LALA Fc的截短的C1-抑制剂,其具有以下氨基酸序列(Fc部分加下划线,LALA突变用粗体表示):
DKTHTCPPCPAPE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGKGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:14).
根据上述方法制备截短的C1-抑制剂与N末端IgG4 Fc的融合蛋白,其具有以下氨基酸序列(Fc部分加下划线):
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:32).
根据上述方法制备截短的C1-抑制剂与N末端IgG4 Fc的融合蛋白,其具有以下氨基酸序列(Fc部分加下划线):
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQID NO:33).
根据上述方法制备具有N末端IgG4S241P Fc的全长C1-抑制剂,其具有以下氨基酸序列(Fc部分加下划线,S241P突变用粗体表示):
ESKYGPPCP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGKNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:15).
根据上述方法制备具有N末端IgG4 S241P Fc的截短的C1-抑制剂,其具有以下氨基酸序列(Fc部分加下划线,S241P突变用粗体表示):
ESKYGPPCP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGKGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:16).
B.小规模瞬时表达Fc-C1-抑制剂融合蛋白
用各种C1-抑制剂融合质粒(N-hFc、N-hFcLALA和N hFcIgG4m)转染FreeStyleTM293-F细胞(悬浮人胚肾细胞,Invitrogen,目录号R790-07)、FreeStyleTM CHO-S细胞(悬浮中国仓鼠卵巢细胞,Invitrogen,目录号R800-07)和HT1080细胞,并且以不用DNA转染作为对照。
遵循Invitrogen的方案(InVitrogen方案公布号MAN0007818Rev.1.0,可在https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/FreeStyle_MAX_Reagent_man.pdf处获得),使用293-FreeStyleTMMAX试剂(I nvitrogen,目录号16447-500)进行293-F和CHO-S细胞转染。在转染之后,将293-F细胞接种至无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitr ogen,目录号12338-018)中,并且将CHO-S细胞接种至无血清Free StyleTMCHO表达培养基(Invitrogen,目录号12651-014)中,两者均具有30mL的最终培养体积。
类似地,使用标准转染方案(350V,960uF,12e6个细胞,35μg DNA)转染HT1080细胞。
在转染后4天和7天(在再次补料之后积累3天)收获来自转染的细胞培养物的条件培养基(CM)。通过SDS-PAGE(8-16%TG凝胶,150V,持续1.5小时)来评估融合蛋白表达,并且用考马斯蓝(Coomassie blue)加以显现。
为产生效应物失效构建体的稳定汇合物,在37℃下以1x106个细胞/毫升接种HT1080经瞬时转染细胞。在恢复2天之后,在适合的具有250μg/mL博莱霉素(zeocin)的化学成分确定(CD)的培养基中持续2周选择细胞直至细胞展现95%活力。通过SDS-PAGE来评估融合蛋白表达,并且用考马斯蓝加以显现。发现C1-INH Fc融合构建体的表达大于C1-INH白蛋白构建体的表达。
C.使用FreeStyleTM293-F细胞进行按比例扩大表达
用LALA-C1-抑制剂融合质粒(全长C1与截短的C1两者)以及IgG4m-C1-抑制剂融合质粒(全长C1和截短的C1)转染FreeStyleTM293-F细胞。如上所述使用293-FreeStyleTMMAX试剂进行转染。
在1L振荡烧瓶中,以320mL工作体积转染细胞。从上述转染的30mL转染体积按比例扩大DNA和FreeStyleTMMAX试剂量。在转染后4天收获来自转染细胞的CM,并且如上所述用SDS-PAGE评估表达。对细胞再次补料以进行第二次收获(转染后7天,3天分批收集)。
C.表达数据概述
相比于天然重组C1,Fc与全长C1-抑制剂的融合物始终以较高水平表达。Fc与截短的C1-抑制剂的融合物类似于天然重组C1-抑制剂进行表达。在关于任何测试构建体的任何宿主细胞培养物样品的情况下都未观察到重度蛋白质剪切。
相较于其它测试细胞类型,HEK293瞬时细胞表达尤其增加。相比于如果在C末端放置Fc序列,在N末端放置Fc序列导致表达尤其增加。
实施例2.表征Fc-C1-INH融合蛋白
为表征Fc-C1-抑制剂融合蛋白,首先使用涉及蛋白质A柱的方法纯化融合蛋白。示例性纯化结果显示于图3中。
样品中检测到的C1-抑制剂融合物组合物浓度和总蛋白量描绘于图4中。在单次亲和柱纯化之后获得高度纯化的物质。使用上述纯化方法实现极好的蛋白质产量。
样品中检测到的C1-抑制剂融合物组合物内毒素浓度描绘于图5中。低内毒素水平见于最终产物中,从而使得它们非常适于药物用途。
分析以上概述的纯化的Fc融合蛋白的蛋白质纯度、SEC、热稳定性、与FcRN的结合、与C1q的结合和与FcgR1的结合。
根据RP HPLC,用于PK分析的所有样品的纯度都高于97%。在以下示例性条件下进行C1-抑制剂融合蛋白的尺寸排阻色谱法:柱:Tosoh G3000swxl;流动相缓冲液:0.2M磷酸钠,pH 6.8;流速:0.5mL/min。
以40μL的体积注射样品。运行的样品是LALA C1-抑制剂全长(FL)R1;LALA C1-抑制剂截短(TR)R1;IgG4C1-抑制剂全长(FL)R1;IgG4C1-抑制剂截短(TR)R1;和20μL BSA对照注射液。
结果
SEC-MALS的示例性结果描绘于表1中。
样品名称 | g/mol |
LALA FL R1 | 195,600 |
LALA TR R1 | 峰1=385,000峰2=184,000 |
IgG4FL R1 | 峰1=984,200峰2=212,300 |
IgG4TR R1 | 峰1=360,300峰2=191,900 |
表1:SEC-MALS结果
通过差示扫描量热法(DSC)来评估C1-抑制剂融合蛋白构建体的热稳定性。
A.Fc融合蛋白与FcRN的结合和Fc效应功能
与Fc新生儿受体(FcRN)结合允许分子进行再循环,并且导致Fc融合蛋白的体内血清半衰期延长。当分子被被动带入细胞中,并且内体的pH较低时发生再循环。那导致分子的Fc部分结合FcRN。当FcRN再循环回细胞表面时,pH于是呈中性,并且蛋白质被释放回血清中。
使用Biacore系统,通过表面等离子体共振(SPR)测量与FcRN的细胞外结构域的结合。
通过在以下条件下使CM5芯片与FcRn进行胺偶联来实现用FcRn直接固定:
将FcRn(Sino Biological Inc或内部BD1)于pH 5.0乙酸盐缓冲液(目录号BR-1003-51)中稀释至10μg/mL。
流速:10μl/min
最终偶联信号354Ru
运行缓冲液:PBS-P+,调节pH至6.0
使用以下方案进行动力学结合研究。将样品于PBS-P+中稀释至100、50、25、12.5、6.25、3.125、0nM。如下设置参数:
在流速30μL/min下缔合300s以及解离600s
用25mM Tris、150mM NaCl(pH 8.0)再生
与FcRn的示例性动力学结合数据的概述描绘于表2中。
表2:与FcRn的动力学结合数据的概述
B.Fc融合蛋白与C1q的结合
野生型Fc分子具有不同量的效应功能,例如能够活化补体级联、ADCC活性和/或结合不为达成本发明的目的所需的特定Fc受体。需要本发明的C1-INH融合蛋白的患者罹患补体介导的疾病,因此本发明的一目标在于降低或消除与Fc结构域相关的效应功能。本文公开的C1-INH Fc融合构建体优选降低或消除效应功能。C1-INH Fc融合构建体优选降低或消除补体活化、ADCC和/或Fcγ受体。可通过与C1q的结合,也通过与Fcγ受体的结合来量度效应功能。
C1q结合ELISA
所用C1q结合ELISA方案是:
●在4℃下将蛋白质过夜涂布于maxisorp板上,并且所述蛋白质于50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中从100μg/mL至0μg/mL加以滴定
●用ELISA洗涤缓冲液(PBS/0.05%吐温-20(TWEEN-20))洗涤3次
●添加含2μg/mL C1q的测定缓冲液(PBS/0.05%吐温-20/0.1%鱼明胶),并且在室温下孵育2小时
●用ELISA洗涤缓冲液(PBS/0.05%吐温-20)洗涤3次
●以4μg/mL添加抗C1q-HRP抗体(Thermo PA1-84324),并且在室温下孵育1小时
●用ELISA洗涤缓冲液(PBS/0.05%吐温-20)洗涤3次
●TMB,在室温下持续15分钟
●读取OD450
hFc、hFcLALA和IgG4m与C1-INH和rhC1(血浆源性商业产品)抑制剂的融合物的示例性C1q结合ELISA结果描绘于图6中,所述图6相对于各样品中蛋白质的浓度来绘制OD450。样品是hFc IgG1-C1-INH、hFc LALA IgG1-C1-INH和hFc IgG4m-C1-INH融合物、重组人C1-INH(rhC1-INH)(在1080细胞中表达)、以及作为阳性对照的IgG1Fc-人卵泡抑素(hFc IgG1-hFst-XTEN)融合物和作为阴性对照的人卵泡抑素-Xten(hFst-XTEN)融合物。
Fc融合蛋白与FcγR1的结合
使用Biacore系统,通过表面等离子体共振(SPR)测量与FcγR1的细胞外结构域的结合。Biacore捕获方法描绘于图7中。测定设置如下:
HBS-P+用作运行缓冲液
使抗His(GE,抗His试剂盒)偶联于CM5上以获得16000Ru
捕获水平
对于FcγRI(5μg/mL,R&D system),捕获水平为约350Ru
样品制备
阳性对照:将N-hFc-C1-INH于HBS-P+缓冲液中稀释至12.5、6.25、3.175、1.59和0.79nM
将其它样品(N-hFcIgG4m-C1Inh、N-hFcIgG4m-C1-INH Tr、N-hFcLala-C1-INH和N-hFclala-C1-INH Tr)于HBS-P+缓冲液中稀释至100、50、25、12.5、6.25nM
结合动力学设置:
捕获:以10μl/mL注射12s
捕获稳定化:30s
缔合:以流速30μl/mL进行300s
解离:以流速30μl/mL进行600s
再生:以30μl/mL用10mM磷酸盐500mM NaCl(pH 2.5)进行40s
说明C1-INH构建体与FcγRI的结合的示例性数据的概述显示于表3中。N-hFcLala-C1-INH消除与FcγRI的结合。N-hFcIgG4m-C1-INH和N-hFcIgG4m-C1-INH Tr结合FcγRI,但弱于N-hFc-C1-INH。截短的C1-INH与hFcLala或hFcIgG4m融合物使与FcγRI的结合亲和力增加。
表3:C1-INH构建体FcγRI结合的概述
C1-抑制剂Fc融合蛋白的C1-抑制剂活性
C1-抑制剂能够抑制来自凝血、接触和补体途径的许多酶,并且因此适用于治疗诸如HAE、AMR、NMOSD和PNH的疾病。
C1-INH是一种自杀性抑制剂,这意味着它在抑制过程期间被失活。它与靶标蛋白酶形成1:1化学计量复合物,继之以整个复合物被清除。C1-INH接着不可再用于抑制其它酶。以下实验通过两种示例性方法来考查Fc-C1-抑制剂融合蛋白抑制C1s的能力。
采用两种示例性体外方法来考查C1-抑制剂对C1s活性的抑制活性:以基于ELISA的方法(功能性ELISA)测量C1S和C1-抑制剂的复合物-仅对效应物失效构建体使用,以及测量对C1s裂解比色底物的能力的抑制。两种测定产生一致数据。
测量C1S和C1-抑制剂的复合物的功能性ELISA
这个方法用于测试被制备来进行PK研究的效应物失效Fc构建体,图8。ELISA方案如下:
●60μL稀释的C1-INH+12μL生物素-C1s
○在室温下孵育30分钟
●将50μL复合物转移至链霉亲和素涂布的板中
○在室温下孵育10分钟,洗涤5次
●添加50μL抗C1-INH-HRP
○在室温下孵育60分钟,洗涤5次
●添加100μL TMB底物
○在室温下孵育15分钟
●添加100μL终止溶液(4%HCl)
●在OD450下进行读取
通过凝胶将血浆源性C1-INH分子量(MW)估计为约93,000Da。这个值用于计算SPR分析中使用的蛋白质的浓度。通过如使用质谱测定法测定的各构建体的重量来计算构建体的浓度。FL C1-INH hFc IgG1LALA和FL C1-INH hFc IgG4m具有约200,000Da的分子量。TrC1-INH hFc IgG1LALA和Tr C1-INH hFc IgG4m具有约160,000Da的分子量。
在多个测试中,融合蛋白显示对C1s的亲和力高于天然C1-抑制剂。截短的C1-INH融合蛋白类似地显示对C1s的亲和力高于天然C1-抑制剂。
对C1s裂解比色底物的能力的抑制
使用R&D systems C1-抑制剂活性测定测试效应物失效构建体抑制由C1s+/-Cl-INH对比色肽的C1s裂解的能力。测定方案可见于https://www.rndsystems.com/products/human-serpin-g1-c1-inhibitor-plas ma-protein-cf_2488-pi处。
每孔最终测定条件:
●rhC1s:0.010μg(1.33nM)
●人丝氨酸蛋白酶抑制剂G1曲线:100、50、25、5、2.5、1.25、0.625、0.2、0.04和0.01nM
●底物:100μM
●DTNB:100μM
活性测定设置
25μL C1-抑制剂+25μL C1s(2μg/mL)
在室温下孵育30分钟
用测定缓冲液将复合物稀释5倍
50μL稀释的C1-INH-C1s复合物+50μL底物(500uM)/反应物(200uM)
在室温下孵育15分钟
在OD405下进行读取
使用质谱或凝胶分子量估计值计算测定中测试的各效应物失效构建体的滴定曲线,如图9A和9B中所示。全长融合蛋白显示对C1s的亲和力高于天然C1-抑制剂。截短的C1-INH融合蛋白类似地显示对C1s的亲和力高于天然C1-抑制剂。
溶血测定
图10A和10B描绘替代性补体途径和经典补体途径的溶血测定的示意性概述。Seelen等,J.of Immun.Methods,296:187-198(2005)。图11A、11B和11C描绘由血浆源性C1-INH、IgG1LALA Fc截短的C1-抑制剂、IgG1LALA全长C1-抑制剂以及两种血浆源性C1-INH制剂展现的溶血活性(例如替代性补体途径的活化程度)的比较。融合蛋白的表现类似于血浆源性C1抑制剂。
C1-抑制剂Fc融合蛋白活性的概述
所有Fc-C1-抑制剂融合蛋白都能够抑制C1s活性。Fc融合蛋白,特别是全长C1-抑制剂融合蛋白抑制C1s的亲和力始终高于血浆源性C1-抑制剂。全长C1-抑制剂融合蛋白与截短的C1-抑制剂融合蛋白(例如以Fc IgG1LALA制备)两者均能够抑制体外红血细胞的溶解。
Fc融合蛋白的体内PK曲线
图12显示效应物失效融合构建体相较于血浆源性C1-抑制剂和重组C1-INH的兔PK研究的示例性结果。通过静脉内施用的血浆源性C1-INH展现单相血清浓度-时间曲线。通过静脉内施用的rhC1-INH-IgG构建体展现双相血清浓度-时间曲线。初始快速清除相(约2小时)指示受体介导的细胞摄取。构建体展现第二较缓慢清除相。
实施例3.白蛋白融合蛋白
A.白蛋白-C1-抑制剂融合物表达构建体
产生许多白蛋白蛋白构建体。这些构建体的示意图描绘于图13A-F中。制备包含白蛋白或白蛋白的D3结构域直接接合于全长C1-INH和截短的C1-INH的N末端的融合构建体表达载体。也制备包含白蛋白或白蛋白的D3结构域使用接头接合于全长C1-INH和截短的C1-INH的N末端的融合构建体表达载体。由这些构建体表达的融合蛋白的氨基酸序列包括以下序列:
白蛋白全长C1-INH直接融合物(白蛋白结构域加下划线):
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDN EETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFG ERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLL EKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYKTTLEKCC AAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCC KHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICT LSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGLNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:18).
白蛋白截短的C1-INH直接融合物(白蛋白结构域加下划线):
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDN EETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFG ERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLL EKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYKTTLEKCC AAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCC KHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICT LSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGLGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:19).
D3白蛋白全长C1-INH直接融合物(D3白蛋白结构域加下划线):
METPAQLLFLLLLWLPDTTGVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKC CKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGLNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:21).
D3白蛋白截短的C1-INH直接融合物(D3白蛋白结构域加下划线):
METPAQLLFLLLLWLPDTTGVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKC CKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGLGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ IDNO:22).
白蛋白全长C1-INH GGG接头融合物(白蛋白结构域加下划线,接头用粗体表示):
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDN EETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFG ERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLL EKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYKTTLEKCC AAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCC KHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICT LSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL NPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:23).
白蛋白截短的C1-INH GGG接头融合物(白蛋白结构域加下划线,接头用粗体表示):
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDN EETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFG ERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLL EKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYKTTLEKCC AAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCC KHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICT LSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL GSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQID NO:24).
D3白蛋白全长C1-INH GGG接头融合物(D3白蛋白结构域加下划线,接头用粗体表示):
METPAQLLFLLLLWLPDTTGVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKC CKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL NPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:25).
D3白蛋白截短的C1-INH GGG接头融合物(D3白蛋白结构域加下划线,接头用粗体表示):
METPAQLLFLLLLWLPDTTGVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKC CKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKOTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL GSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQID NO:26).
白蛋白全长C1-INH(GGGGS)2接头融合物(白蛋白结构域加下划线):
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDN EETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFG ERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLL EKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYKTTLEKCC AAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCC KHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICT LSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL NPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:28).
白蛋白截短的C1-INH(GGGGS)2接头融合物(白蛋白结构域加下划线,接头用粗体表示):
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDN EETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFG ERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLL EKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYKTTLEKCC AAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCC KHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICT LSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL GSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQID NO:29).
D3白蛋白全长C1-INH(GGGGS)2接头融合物(D3白蛋白结构域加下划线,接头用粗体表示):
METPAQLLFLLLLWLPDTTGVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKC CKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEOLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL NPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDF TCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:30).
D3白蛋白截短的C1-INH(GGGGS)2接头融合物(D3白蛋白结构域加下划线):
METPAQLLFLLLLWLPDTTGVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRN LGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAET FTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAAL GL GSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:31).
B.白蛋白融合蛋白的表达
如上所述用这些融合构建体表达载体转染FreeStyleTMCHO-S细胞。制备CHO-GS稳定汇合物,并且用于产生供收集和分析的CM。以2x106个细胞/毫升接种细胞,并且在33℃下孵育4天。在第3天补充谷氨酰胺。
在转染后4天收获来自转染的细胞培养物的条件培养基(CM),并且在考马斯凝胶上跑胶以评估表达。使用50kDa 20离心浓缩器(Vivaproducts,Inc.,目录号VS2031)浓缩第4天的分批收获物,并且使用Invitrogen的CaptureSelect白蛋白亲和基质(Invitrogen,目录号19129701L)加以纯化。洗脱缓冲液是20mM Tris pH 7.4+2M MgCl2)。在考马斯凝胶上相对于BSA使样品跑胶以评估表达。
基于这个纯化,HSA-C1-INH的产量是约3.6mg/L,并且D3-C1-INH的产量是约1.6mg/L。使用50kDa 将蛋白质浓缩至约2mg/mL,并且储存在-20℃下。将纯化的蛋白质过夜透析至C1-Inh配制缓冲液(50mM Tris(pH 7.2)、50mM山梨糖醇、150mM甘氨酸)中并浓缩。
检查蛋白质的C1s活性。数据显示于图14中,所述图14呈现用以测量一些示例性白蛋白C1-INH融合构建体抑制C1s裂解比色肽的能力的测定的结果,包括血浆源性C1-INH和HT1080表达的重组C1-INH以进行比较。
在SEC-MALS上运行蛋白质以检查聚集和测定尺寸。测定的示例性参数是:
柱:Tosoh G3000swxl
流动相缓冲液:0.2M磷酸钠,pH 6.8
流速:0.5mL/min
样品:
HSA D3C1-INH,注射30μg
HSA C1-INH,注射35μg
BSA对照,注射40μg
C1-INH IgG1LALA Fc,以35μg进行注射
使用对于293C1-INH样品开发的SEC方法,对HSA-C1-INH分子使用SEC-MALS测定。使用这种方法,未检测到HSA样品中的大分子量分子。
接着对C1-抑制剂白蛋白融合蛋白进行动态光散射(DLS)分析。HSA和C1-INH C46用作对照。所有样品和对照都于DPBS缓冲液中稀释成0.5mg/mL。C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的示例性DLS结果显示于表4中。
样品 | mg/mL |
HSA | 5 |
C46C1-INH | 2.5 |
HSA-GGG-C1-INH CHO-GNE | 3.5 |
D3-GGG-C1-INH CHO-GNE | 8 |
D3-GGGGS-C1-INH CHO-GNE | 3.4 |
表4:对C1-抑制剂白蛋白融合蛋白的DLS分析
使用Invitrogen CaptureSelect人白蛋白亲和基质从CHO-GS CM纯化HSA-C1-INH以及HSA_D3-C1-INH两者均适用。纯化的蛋白质与血浆源性C1-INH具有类似C1s活性。SEC-MALS显示仅有处于预期尺寸下的单一峰而不具有HMW物质。
产生表达白蛋白-C1-INH+/-接头构建体的稳定汇合物。通过遵循制造商方案进行电穿孔来转染CHO-GS GNE细胞。选择稳定汇合物,并且在33℃下进行7天分批收获物产生。通过考马斯凝胶来评估分批收获物的表达。考马斯结果显示相比于HSA_D3融合物,全长HSA-C1-INH融合蛋白显示较小程度表达。在添加接头序列的情况下未见显著差异。
等效案和范围
本领域技术人员将仅使用常规实验即会认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等效案。本发明的范围不意图限于以上描述,而是如以下权利要求中所阐述。
Claims (87)
1.一种融合蛋白,其包含:
人C1-抑制剂多肽;和
Fc结构域。
2.如权利要求1所述的融合蛋白,其中所述人C1-抑制剂多肽包含与具有SEQ ID NO:1的全长人C1-抑制剂具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的融合蛋白,其中所述人C1-抑制剂多肽包含SEQ ID NO:1。
4.如权利要求1所述的融合蛋白,其中相较于SEQ ID NO:1,所述人C1-抑制剂多肽被截短。
5.如权利要求4所述的融合蛋白,其中所述人C1-抑制剂多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求4所述的融合蛋白,其中所述人C1-抑制剂多肽包含氨基酸序列SEQ IDNO:2。
7.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域连接于所述人C1-抑制剂多肽的N末端。
8.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域是人IgG1Fc结构域。
9.如权利要求8所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
10.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含L234A和/或L235A突变。
11.如权利要求10所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。
12.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含一个或多个延长所述融合蛋白的半衰期的突变。
13.如权利要求12所述的融合蛋白,其中所述一个或多个突变选自一个或多个对应于人IgG1的Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433和/或Asn 434的位置。
14.如权利要求12所述的融合蛋白,其中所述一个或多个突变选自H433K和/或N434F。
15.如权利要求12-14中任一项所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含与SEQ ID NO:5-8中的任一个具有至少80%同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求14所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含SEQ ID NO:5-8中的任一个的氨基酸序列。
17.如权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域源于人IgG4Fc。
18.如权利要求17所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含与SEQ ID NO:9具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
19.如权利要求18所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含S241P突变。
20.如权利要求19所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:10。
21.如权利要求1所述的融合蛋白,其包含与SEQ ID NO:11具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
22.如权利要求1所述的融合蛋白,其包含与SEQ ID NO:12具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
23.如权利要求1所述的融合蛋白,其包含与SEQ ID NO:13具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
24.如权利要求1所述的融合蛋白,其包含与SEQ ID NO:14具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
25.如权利要求1所述的融合蛋白,其包含与SEQ ID NO:15具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
26.如权利要求1所述的融合蛋白,其包含与SEQ ID NO:16具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
27.如权利要求1所述的融合蛋白,其包含选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
28.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含降低或消除ADCC活性的突变。
29.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含降低或消除CDC活性的突变。
30.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含降低或消除FcγR结合的突变。
31.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述Fc结构域包含降低或消除FcγR效应功能的突变。
32.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述重组人C1-抑制剂Fc融合蛋白包含降低或消除C1q结合的突变。
33.如权利要求32所述的融合蛋白,其中降低或消除C1q结合的所述突变在所述Fc结构域中。
34.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其还包含在所述人C1-抑制剂多肽与所述Fc结构域之间的接头。
35.如权利要求34所述的融合蛋白,其中所述接头是包含3-100个氨基酸的肽。
36.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白抑制C1r和/或C1s蛋白酶活性和/或使C1r和/或C1s蛋白酶活性失活。
37.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白抑制体外红血细胞的溶解。
38.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中相比于血浆源性人C1-抑制剂,所述融合蛋白具有更长的半衰期。
39.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白具有至少4天的半衰期。
40.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白具有至少5天的半衰期。
41.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白具有至少6天的半衰期。
42.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白具有至少7天的半衰期。
43.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白是单价的。
44.如权利要求1-42中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白是二聚的。
45.一种融合蛋白,其包含:
人C1-抑制剂多肽;和
白蛋白多肽。
46.如权利要求45所述的融合蛋白,其中所述人C1-抑制剂多肽包含与具有SEQ ID NO:1的人全长C1-抑制剂具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
47.如权利要求46所述的融合蛋白,其中所述人C1-抑制剂多肽包含SEQ ID NO:1。
48.如权利要求45-47中任一项所述的融合蛋白,其中相较于SEQ ID NO:1,所述人C1-抑制剂多肽被截短。
49.如权利要求48所述的融合蛋白,其中所述人C1-抑制剂多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
50.如权利要求49所述的融合蛋白,其中所述人C1-抑制剂多肽包含氨基酸序列SEQ IDNO:2。
51.如权利要求45-50中任一项所述的融合蛋白,其中所述白蛋白连接于所述人C1-抑制剂多肽的N末端。
52.如权利要求45-51中任一项所述的融合蛋白,其中所述白蛋白多肽包含人血清白蛋白的一个或多个结构域。
53.如权利要求52所述的融合蛋白,其中所述白蛋白多肽包含人血清白蛋白的D3结构域。
54.如权利要求53所述的融合蛋白,其中所述白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:20具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
55.如权利要求54所述的融合蛋白,其中所述白蛋白多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:20。
56.如权利要求45-52中任一项所述的融合蛋白,其中所述白蛋白多肽包含与SEQ IDNO:17具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
57.如权利要求56所述的融合蛋白,其中所述白蛋白多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:17。
58.如权利要求45-57中任一项所述的融合蛋白,其包含与SEQ ID NO:18具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
59.如权利要求45-57中任一项所述的融合蛋白,其包含与SEQ ID NO:19具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
60.如权利要求45-57中任一项所述的融合蛋白,其包含与SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
61.如权利要求45-57中任一项所述的融合蛋白,其包含与SEQ ID NO:22具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
62.如权利要求44-56中任一项所述的融合蛋白,其包含与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22同一的氨基酸序列。
63.如权利要求45-62中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白结合FcRN。
64.如权利要求45-63中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白抑制C1酯酶活性。
65.如权利要求45-64中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白抑制体外红血细胞的溶解。
66.如权利要求45-65中任一项所述的融合蛋白,其还包含在所述人C1-抑制剂多肽与所述白蛋白多肽之间的接头。
67.如权利要求66所述的融合蛋白,其中所述接头是包含3-100个氨基酸的肽。
68.如权利要求67所述的融合蛋白,其中所述接头包含序列GGG。
69.如权利要求67所述的融合蛋白,其中所述接头包含序列SEQ ID NO:27。
70.如权利要求45-69中任一项所述的融合蛋白,其中所述白蛋白多肽不包含一个或多个选自由464His、510His、535His及其组合组成的组的突变。
71.如权利要求45-70中任一项所述的融合蛋白,其中相比于血浆源性人C1-抑制剂,所述融合蛋白具有更长的半衰期。
72.如权利要求45-71中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白具有至少4天的半衰期。
73.如权利要求45-71中任一项所述的重组人C1-抑制剂白蛋白融合蛋白,其中所述融合蛋白具有至少5天的半衰期。
74.如权利要求45-71中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白具有至少6天的半衰期。
75.如权利要求45-71中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白具有至少7天的半衰期。
76.一种核酸,其编码如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白。
77.一种细胞,其包含如权利要求76所述的核酸。
78.如权利要求77所述的细胞,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
79.如权利要求78所述的细胞,其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
80.如权利要求78所述的细胞,其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
81.如权利要求77-80中任一项所述的细胞,其中所述细胞被工程改造以修饰糖基化。
82.如权利要求81所述的细胞,其中所述细胞被工程改造以改进唾液酸化。
83.一种产生融合蛋白的方法,其包括培育如权利要求77-82中任一项所述的细胞的步骤。
84.如权利要求1-75中任一项所述的融合蛋白,其中所述融合蛋白由被工程改造以改进唾液酸化的细胞产生。
85.一种药物组合物,其包含如权利要求1-75和84中任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。
86.一种治疗补体介导的病症的方法,其包括向需要治疗的受试者施用如权利要求85所述的药物组合物。
87.如权利要求86所述的方法,其中所述补体介导的病症选自遗传性血管性水肿、抗体介导的排斥、视神经脊髓炎谱系病症、创伤性脑损伤、脊髓损伤、缺血性脑损伤、灼烧损伤、中毒性表皮坏死溶解、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、中风、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变(CIDP)、重症肌无力、多灶性运动神经病变。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110936129.3A CN113698495A (zh) | 2014-10-31 | 2015-10-31 | C1酯酶抑制剂融合蛋白及其用途 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462073657P | 2014-10-31 | 2014-10-31 | |
US62/073,657 | 2014-10-31 | ||
PCT/US2015/058521 WO2016070156A2 (en) | 2014-10-31 | 2015-10-31 | C1 esterase inhibitor fusion proteins and uses thereof |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110936129.3A Division CN113698495A (zh) | 2014-10-31 | 2015-10-31 | C1酯酶抑制剂融合蛋白及其用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107108753A true CN107108753A (zh) | 2017-08-29 |
Family
ID=54548264
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580067942.4A Pending CN107108753A (zh) | 2014-10-31 | 2015-10-31 | C1酯酶抑制剂融合蛋白及其用途 |
CN202110936129.3A Pending CN113698495A (zh) | 2014-10-31 | 2015-10-31 | C1酯酶抑制剂融合蛋白及其用途 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110936129.3A Pending CN113698495A (zh) | 2014-10-31 | 2015-10-31 | C1酯酶抑制剂融合蛋白及其用途 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20160130324A1 (zh) |
EP (2) | EP3769780A1 (zh) |
JP (3) | JP6740225B2 (zh) |
KR (2) | KR20170074244A (zh) |
CN (2) | CN107108753A (zh) |
AU (2) | AU2015338913B2 (zh) |
BR (1) | BR112017008962A2 (zh) |
CA (1) | CA2964132A1 (zh) |
HK (1) | HK1243443A1 (zh) |
MA (1) | MA53991A (zh) |
WO (1) | WO2016070156A2 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114207135A (zh) * | 2019-06-11 | 2022-03-18 | 夏尔人类遗传性治疗公司 | 用于治疗由失调的血浆激肽释放酶介导的疾病的抗体的腺相关病毒载体递送 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MA43270A (fr) * | 2015-11-19 | 2021-06-02 | Takeda Pharmaceuticals Co | Inhibiteur de la c1 estérase humaine recombinante et ses utilisations |
AU2017316513A1 (en) | 2016-08-23 | 2019-03-28 | Csl Behring Gmbh | Method of preventing acute attacks of hereditary angioedema associated with C1 esterase inhibitor deficiency |
CA3102086A1 (en) * | 2017-06-06 | 2018-12-13 | Relinia, Inc. | Single-chain tnf receptor 2 agonist fusion proteins |
CA3098491A1 (en) * | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Sichuan Baili Pharm Co. Ltd | Screening of fixed-point coupling sites of cysteine-modified antibody-toxin conjugate (tdc) |
US20210317168A1 (en) * | 2018-10-15 | 2021-10-14 | The Regents Of The University Of California | Complement Component 1s (C1s) Deficient Cells for Production of Vaccines and Biopharmaceutical Proteins |
CN111087475B (zh) * | 2019-12-25 | 2022-07-08 | 东莞市东阳光生物药研发有限公司 | Fgf21融合蛋白及抑制其降解的方法 |
CN113493519B (zh) * | 2020-03-19 | 2022-12-27 | 浙江道尔生物科技有限公司 | 一种半衰期显著延长的治疗眼部血管新生疾病的融合蛋白 |
EP4247416A1 (en) | 2020-11-20 | 2023-09-27 | CSL Behring GmbH | Method for treating antibody-mediated rejection |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011116291A1 (en) * | 2010-03-18 | 2011-09-22 | Thrombolytic Science International | Production of human c1 inhibitor in human cells |
CN103476795A (zh) * | 2011-03-29 | 2013-12-25 | 罗切格利卡特公司 | 抗体Fc 变体 |
CN104080474A (zh) * | 2011-12-22 | 2014-10-01 | 德国杰特贝林生物制品有限公司 | C1-抑制剂在治疗中枢神经系统继发性水肿中的应用 |
WO2014173873A1 (en) * | 2013-04-22 | 2014-10-30 | Csl Behring Gmbh | Complex |
Family Cites Families (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5179017A (en) | 1980-02-25 | 1993-01-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US4634665A (en) | 1980-02-25 | 1987-01-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US4656134A (en) | 1982-01-11 | 1987-04-07 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Gene amplification in eukaryotic cells |
US5149636A (en) | 1982-03-15 | 1992-09-22 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products |
GB8601597D0 (en) | 1986-01-23 | 1986-02-26 | Wilson R H | Nucleotide sequences |
US4956288A (en) | 1988-04-22 | 1990-09-11 | Biogen, Inc. | Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA |
US5047335A (en) | 1988-12-21 | 1991-09-10 | The Regents Of The University Of Calif. | Process for controlling intracellular glycosylation of proteins |
US5096816A (en) | 1990-06-05 | 1992-03-17 | Cetus Corporation | In vitro management of ammonia's effect on glycosylation of cell products through pH control |
FR2672895B1 (fr) | 1991-02-15 | 1995-05-12 | Transgene Sa | Procede de purification d'une proteine fortement glycosylee. |
WO1992022320A1 (en) * | 1991-06-14 | 1992-12-23 | Genentech, Inc. | C1 inhibitor variants and treating inflammatory response with c1 inhibitor |
US5705364A (en) | 1995-06-06 | 1998-01-06 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process |
US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
US6528286B1 (en) | 1998-05-29 | 2003-03-04 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process for producing glycoproteins |
EP1252192B1 (en) * | 2000-02-11 | 2006-08-16 | MERCK PATENT GmbH | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
CA2405709A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
ES2649037T3 (es) * | 2000-12-12 | 2018-01-09 | Medimmune, Llc | Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas |
AU2003249055B2 (en) | 2002-07-15 | 2008-06-26 | Immunex Corporation | Methods and media for controlling sialylation of proteins produced by mammalian cells |
US8524477B2 (en) | 2002-10-29 | 2013-09-03 | Crucell Holland B.V. | Methods to obtain recombinant proteins with increased sialylation from cells that express adenovirus E1A protein, and proteins obtained thereby |
US7384754B2 (en) | 2003-10-31 | 2008-06-10 | Agilent Technologies, Inc. | Enrichment and tagging of glycosylated proteins |
EP1814599A4 (en) * | 2004-08-03 | 2008-12-17 | Biorexis Pharmaceutical Corp | COMBINATION THERAPY WITH TRANSFERRIN FUSION PROTEINS WITH GLP-1 |
GB0507123D0 (en) | 2005-04-08 | 2005-05-11 | Isis Innovation | Method |
EP1896503B1 (en) | 2005-05-31 | 2014-10-29 | Board of Regents, The University of Texas System | IgG1 ANTIBODIES WITH MUTATED Fc PORTION FOR INCREASED BINDING TO FcRn RECEPTOR AND USES TEHEREOF |
CA2630811C (en) | 2005-12-08 | 2016-05-31 | Amgen Inc. | Improved production of glycoproteins using manganese |
WO2008029281A2 (en) | 2006-02-10 | 2008-03-13 | Invitrogen Corporation | Labeling and detection of post translationally modified proteins |
ES2531934T3 (es) | 2006-09-01 | 2015-03-20 | Novo Nordisk Health Care Ag | Glicoproteínas modificadas |
IL182956A0 (en) | 2007-05-03 | 2008-01-20 | Yeda Res & Dev | Glycan modified soluble receptors and binding proteins and their use |
CN101896616B (zh) | 2007-10-12 | 2014-06-04 | 西格马-奥利奇股份有限公司 | 提高糖蛋白唾液酸化作用的组合物与方法 |
MX2010009033A (es) | 2008-02-19 | 2010-12-21 | Biocon Ltd | Un metodo para obtener insulinas heterologas purificadas expresadas en levadura. |
EP2166085A1 (en) | 2008-07-16 | 2010-03-24 | Suomen Punainen Risti Veripalvelu | Divalent modified cells |
BRPI1008486A2 (pt) | 2009-02-26 | 2018-01-16 | Battelle Energy Alliance Llc | alteração e modulação de atividade de proteína por variação de modificação pós-traducional |
JP2013511281A (ja) | 2009-11-23 | 2013-04-04 | アムジェン インコーポレイテッド | 単量体抗体Fc |
JP5889181B2 (ja) * | 2010-03-04 | 2016-03-22 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
US20120010013A1 (en) * | 2010-06-19 | 2012-01-12 | Fellows Edwin E | Swing assistant device |
WO2012020096A1 (en) | 2010-08-13 | 2012-02-16 | Medimmune Limited | Monomeric polypeptides comprising variant fc regions and methods of use |
WO2012083370A1 (en) * | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Cephalon Australia Pty Ltd | Modified antibody with improved half-life |
US10151759B2 (en) | 2011-02-10 | 2018-12-11 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the purification of a glycan and/or a glycoconjugate by chromatography using a stationary phase comprising cotton |
US8580922B2 (en) | 2011-03-04 | 2013-11-12 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same |
CN110551223A (zh) * | 2011-06-28 | 2019-12-10 | 英伊布里克斯有限合伙公司 | 丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合多肽及其使用方法 |
DK2729482T3 (en) | 2011-07-08 | 2018-05-07 | Merck Sharp & Dohme | PROCEDURE FOR CLEANING FC-FUSION PROTEIN |
CN102890790B (zh) * | 2011-07-22 | 2014-04-30 | 鸿富锦精密工业(深圳)有限公司 | 扩展卡 |
AU2012340501A1 (en) | 2011-12-19 | 2013-07-11 | Grifols, S.A. | Compositions, methods, and kits for preparing sialylated recombinant proteins |
EP2623110A1 (en) * | 2012-01-31 | 2013-08-07 | CSL Behring GmbH | Factor XII inhibitors for the treatment of neurological inflammatory disorders |
US9676857B2 (en) | 2012-03-16 | 2017-06-13 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Soluble engineered monomeric Fc |
CA2892756C (en) | 2012-12-07 | 2020-04-14 | Pfizer Inc. | Engineered monomeric antibody fragments |
JP6636334B2 (ja) * | 2013-03-08 | 2020-01-29 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 遠隔虚血再灌流傷害の治療および予防 |
WO2014152940A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders |
-
2015
- 2015-10-30 US US14/929,251 patent/US20160130324A1/en not_active Abandoned
- 2015-10-31 CN CN201580067942.4A patent/CN107108753A/zh active Pending
- 2015-10-31 EP EP20176552.6A patent/EP3769780A1/en active Pending
- 2015-10-31 JP JP2017523423A patent/JP6740225B2/ja active Active
- 2015-10-31 BR BR112017008962-9A patent/BR112017008962A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-10-31 CA CA2964132A patent/CA2964132A1/en active Pending
- 2015-10-31 KR KR1020177014659A patent/KR20170074244A/ko active Application Filing
- 2015-10-31 MA MA053991A patent/MA53991A/fr unknown
- 2015-10-31 CN CN202110936129.3A patent/CN113698495A/zh active Pending
- 2015-10-31 AU AU2015338913A patent/AU2015338913B2/en active Active
- 2015-10-31 EP EP15795274.8A patent/EP3212663B1/en active Active
- 2015-10-31 KR KR1020247007656A patent/KR20240035643A/ko active Search and Examination
- 2015-10-31 WO PCT/US2015/058521 patent/WO2016070156A2/en active Application Filing
-
2018
- 2018-03-02 HK HK18103036.0A patent/HK1243443A1/zh unknown
-
2020
- 2020-07-22 JP JP2020125041A patent/JP2020202841A/ja not_active Withdrawn
-
2021
- 2021-02-15 AU AU2021200977A patent/AU2021200977A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-12-15 JP JP2022200230A patent/JP2023027290A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011116291A1 (en) * | 2010-03-18 | 2011-09-22 | Thrombolytic Science International | Production of human c1 inhibitor in human cells |
CN103476795A (zh) * | 2011-03-29 | 2013-12-25 | 罗切格利卡特公司 | 抗体Fc 变体 |
CN104080474A (zh) * | 2011-12-22 | 2014-10-01 | 德国杰特贝林生物制品有限公司 | C1-抑制剂在治疗中枢神经系统继发性水肿中的应用 |
WO2014173873A1 (en) * | 2013-04-22 | 2014-10-30 | Csl Behring Gmbh | Complex |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
MARIA COUTINHO等: "Functional Analysis of the Serpin Domain of C1 Inhibitor", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 * |
TIMO RATH等: "Fc-fusion proteins and FcRn: structural insights for longer-lasting and more effective therapeutics", 《CRITICAL REVIEWS IN BIOTECHNOLOGY》 * |
何玉池等: "《细胞生物学》", 31 August 2014 * |
吕世静等: "《临床免疫学检验》", 31 August 2015 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114207135A (zh) * | 2019-06-11 | 2022-03-18 | 夏尔人类遗传性治疗公司 | 用于治疗由失调的血浆激肽释放酶介导的疾病的抗体的腺相关病毒载体递送 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2015338913A1 (en) | 2017-05-04 |
KR20240035643A (ko) | 2024-03-15 |
MA53991A (fr) | 2021-09-15 |
AU2015338913B2 (en) | 2020-11-19 |
EP3769780A1 (en) | 2021-01-27 |
KR20170074244A (ko) | 2017-06-29 |
AU2021200977A1 (en) | 2021-03-11 |
WO2016070156A2 (en) | 2016-05-06 |
BR112017008962A2 (pt) | 2018-01-16 |
EP3212663B1 (en) | 2020-05-27 |
JP2018503355A (ja) | 2018-02-08 |
US20160130324A1 (en) | 2016-05-12 |
EP3212663A2 (en) | 2017-09-06 |
WO2016070156A3 (en) | 2016-06-23 |
CN113698495A (zh) | 2021-11-26 |
CA2964132A1 (en) | 2016-05-06 |
HK1243443A1 (zh) | 2018-07-13 |
JP2023027290A (ja) | 2023-03-01 |
JP2020202841A (ja) | 2020-12-24 |
JP6740225B2 (ja) | 2020-08-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107108753A (zh) | C1酯酶抑制剂融合蛋白及其用途 | |
JP7227951B2 (ja) | 制御性t細胞の増殖のためのインターロイキン-2ムテイン | |
US9932377B2 (en) | Mitochondrial targeting and therapeutic use thereof | |
TW201617364A (zh) | 用於治療代謝異常之組成物及方法 | |
JP7189767B2 (ja) | 組換えヒトc1エステラーゼインヒビター及びその使用 | |
CN102875683A (zh) | 长效重组人生长激素的Fc融合蛋白 | |
CN102516393A (zh) | 胰岛素模拟肽融合蛋白和突变体及其应用 | |
JP2022544236A (ja) | 制御性t細胞の増殖のためのインターロイキン-2変異タンパク質 | |
US11634468B2 (en) | Parathyroid hormone variants | |
US20210355187A1 (en) | Glp-2 fusion polypeptides and uses for treating and preventing gastrointestinal conditions |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20210716 Address after: Osaka, Japan Applicant after: TAKEDA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: Massachusetts, USA Applicant before: SHIRE HUMAN GENETIC THERAPIES, Inc. |
|
TA01 | Transfer of patent application right | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170829 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |