CN107091837A - 一种快速比较草地耐践踏能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速比较草地耐践踏能力的方法。本发明通过叶片的选择和采集、压力胁迫处理、缩合单宁提取、耐践踏能力比较等步骤，可以根据受压力胁迫处理后释放的缩合单宁含量增加百分比来评价豆科草地耐践踏能力。本发明的快速比较草地耐践踏能力的方法比较多年生花生和密子豆，能快速获知密子豆的耐践踏能力更强，结果与常规评价方法一致，说明本发明方法可信度高，快速简便，有利于加快草地种质资源的评价和利用；本发明方法在实验室即可完成，需要植物材料少，时间短，成本低，特别适合于从样本数量巨大的人工诱变突变体库中筛选耐践踏变异株系。

Description

一种快速比较草地耐践踏能力的方法
技术领域
本发明属于草地性能评价领域，更具体地，涉及一种快速比较草地耐践踏能力的方法。
背景技术
耐践踏能力是草地，特别是游憩草坪重要的评价指标之一，耐践踏能力由草坪的耐磨性和再生力决定，与叶片机的械组织、维管组织发达程度相关。践踏草地的直接伤害来自于对植物草叶片直接的物理损伤，如细胞原生质膜伤害，叶绿素加速降解，光合效率降低，从而导致草坪质量下降。
目前，对草地耐践踏能力的测定主要是在草地上直接进行践踏处理，然后测定处理后及一段时间的恢复期后草地的各项指标，包括草层高度、生物量、叶片长度，叶片的超氧化物歧化酶活性、可溶性总糖含量、脯氨酸含量、相对电导率和叶绿素含量等生理指标的变化特征。例如，草地被践踏处理15、30和60d，然后恢复生长30d时测定草坪的盖度、密度以及叶片的长度、重量、含水量等，这种测定一般需要持续2-3个月时间。因此，建立一种快速比较草地耐践踏能力的方法，有利于加快草地种质资源的评价和利用，可使耐践踏突变株系的筛选更为快捷简便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速比较草地耐践踏能力的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速比较草地耐践踏能力的方法，包括如下步骤：
(1)叶片的选择与采集：在待比较草地的健壮枝条上选取复叶，采集复叶中的对称小叶分为对照组和模拟践踏组，不同枝条选择的复叶在色泽、大小、幼嫩程度上要一致；
(2)模拟践踏处理：对模拟践踏组的小叶进行压迫处理，对照组的小叶不进行压迫处理；
(3)缩合单宁的提取：将对照组的小叶和模拟践踏处理后的小叶分别加入抽提液，黑暗条件下抽提，分别获得对照组和模拟践踏组的缩合单宁提取液；
(4)耐践踏能力比较：分别测定对照组和模拟践踏组的缩合单宁提取液中的缩合单宁含量，以缩合单宁含量增加百分率来表征草地耐践踏能力，缩合单宁含量增加百分率越小，耐践踏能力越强；缩合单宁含量增加百分率＝(模拟践踏组的缩合单宁含量-对照组的缩合单宁含量)/对照组的缩合单宁含量。
作为上述方法的优选，步骤(2)中，压迫处理的方法为：将模拟践踏组的小叶置于10000～30000帕强度下压迫处理10～30s。
作为上述方法的优选，步骤(3)中，抽提液为体积百分比为8％～12％的盐酸-甲醇溶液。
作为上述方法的优选，步骤(3)中，按每100mg小叶鲜重加入4～6mL抽提液。
作为上述方法的优选，步骤(3)中，抽提温度为28～32℃，抽提时长为2～4h。
作为上述方法的优选，步骤(4)中，缩合单宁含量的测定方法为：往缩合单宁提取液中加入2～3倍体积的显色液，摇匀，黑暗条件下，25～35℃反应25～35min，测定OD500nm，以OD500nm表征缩合单宁含量。
作为上述方法的进一步优选，显色液为显色液A和显色液B的等体积混合液，使用前混合；显色液A为质量体积比为8％～12％的香草醛-甲醇溶液，显色液B为体积百分比为16％～24％的盐酸-甲醇溶液。
作为上述方法的优选，步骤(1)中，复叶为已完全展开和变绿的第一复叶。
作为上述方法的优选，步骤(1)中，采集小叶的方法为：将小叶片基部剪切下来，不要伤及小叶叶片，也不要留存小叶柄。
作为上述方法的优选，草地为豆科植物草地。
本发明的有益效果是：
豆科植物一般含有较高水平的缩合单宁，当叶片受到机械损伤时，其细胞内容物会外渗，缩合单宁也会更容易被酸甲醇溶液提取出来，压力胁迫处理对豆科植物叶片缩合单宁提取效率的提高幅度，可以用来衡量不同豆科植物叶片在压力胁迫下受到伤害的程度大小，采用对于缩合单宁具有特异性的“盐酸-香草醛”测定法，可以根据释放的缩合单宁含量来评价豆科草地耐践踏能力。
本发明的快速比较草地耐践踏能力的方法比较多年生花生和密子豆，能快速获知密子豆的耐践踏能力更强，结果与常规评价方法一致，说明本发明方法可信度高，快速简便，有利于加快草地种质资源的评价和利用；本发明方法在实验室即可完成，需要植物材料少，时间短，成本低，特别适合于从样本数量巨大的人工诱变突变体库中筛选耐践踏变异株系。
具体实施方式
一种快速比较草地耐践踏能力的方法，包括如下步骤：
(1)叶片的选择与采集：在待比较草地的健壮枝条上选取复叶，采集复叶中的对称小叶分为对照组和模拟践踏组，不同枝条选择的复叶在色泽、大小、幼嫩程度上要一致；优选的，复叶为已完全展开和变绿的第一复叶；采集小叶的方法为：将小叶片基部剪切下来，不要伤及小叶叶片，也不要留存小叶柄；待比较草地优选为豆科植物草地；
(2)模拟践踏处理：对模拟践踏组的小叶进行压迫处理，对照组的小叶不进行处理；压迫处理方法为：将模拟践踏组的小叶置于10000～30000帕强度下压迫处理10～30s；
(3)缩合单宁的提取：将对照组的小叶和模拟践踏处理后的小叶分别加入抽提液，黑暗条件下抽提，分别获得对照组和模拟践踏组的缩合单宁提取液；抽提液选用酸甲醇溶液，当叶片受到机械损伤时，其细胞内容物会外渗，缩合单宁也会更容易被酸甲醇溶液提取出来，压力胁迫处理对豆科植物叶片缩合单宁提取效率的提高幅度，可以用来衡量不同豆科植物叶片在压力胁迫下受到伤害的程度大小；优选的，抽提液为体积百分比为8％～12％的盐酸-甲醇溶液；优选的，按每100mg叶片鲜重加入4～6mL抽提液，抽提温度为28～32℃，抽提时长为2～4h；
(4)耐践踏能力比较：分别测定对照组和模拟践踏组的缩合单宁提取液中的缩合单宁含量，以缩合单宁含量增加百分率来表征草地耐践踏能力，缩合单宁含量增加百分率越小，耐践踏能力越强；缩合单宁含量增加百分率＝(模拟践踏组的缩合单宁含量-对照组的缩合单宁含量)/对照组的缩合单宁含量；优选的，缩合单宁含量的测定方法为：往缩合单宁提取液中加入2～3倍体积的显色液，摇匀，黑暗条件下，25～35℃反应25～35min，测定OD500nm，以OD500nm表征缩合单宁含量；显色液为显色液A和显色液B的等体积混合液，使用前混合；显色液A为质量体积比10％的香草醛-甲醇溶液，显色液B为体积百分比为16％～24％的盐酸-甲醇溶液，由于OD500nm与缩合单宁含量成正比，因此可以直接表征缩合单宁含量。
以下通过实施例进一步解释本发明。
实施例中未特别说明的试剂均为生化商店可购买，未特别说明的操作方法为本领域技术人员熟知的方法。
实验例1、快速比较多年生花生和糙毛假地豆的耐践踏能力的方法
快速比较多年生花生和糙毛假地豆的耐践踏能力的方法，包括如下步骤：
(1)叶片的选择与采集：
分别在多年生花生和糙毛假地豆的健壮枝条上选取已完全展开，并已完全变绿的第一复叶，用不锈钢剪刀从小叶片基部剪切下来，不要伤及小叶叶片，也不要留存小叶柄，每一复叶中的对称小叶分成对照组和模拟践踏组，将每组的小叶称重记录；不同枝条选择的复叶在色泽、大小、幼嫩程度上要一致。
(2)模拟践踏处理
模拟践踏组的小叶分别3000帕、15000帕和25000帕三个强度下压迫处理，维持10s，对照组的小叶不进行压迫处理，以上每个处理和相应的对照组均设置5个重复。
(3)缩合单宁的提取
模拟践踏处理后的小叶立即加入抽提液，按每100mg叶片鲜重添加5mL抽提液，30℃遮光抽提2h获得缩合单宁提取液；对照组的小叶也采取相同方法提取；所述抽提液为体积百分比为10％的盐酸-甲醇溶液。
(4)缩合单宁含量的测定
取对照组和模拟践踏组的缩合单宁提取液1mL，加入3mL显色液(使用前，显色A液与显色B液等体积混合获得显色液)，摇匀，置于30℃的黑暗培养箱中反应30min，在分光光度计上测定OD500nm；所述显色液A：质量体积比为10％的香草醛-甲醇溶液，显色液B：体积百分比为20％的盐酸-甲醇溶液。
(5)耐践踏能力比较
以缩合单宁含量增加百分率来表征草地耐践踏能力，增加百分率越小，耐践踏能力越强；
缩合单宁含量增加百分率＝(模拟践踏组的OD500nm-对照组的OD500nm)/对照组的OD500nm。
表1、不同压迫强度处理对草地耐践踏能力比较的影响
结果如表1所示，多年生花生的缩合单宁增加百分率更小，其耐践踏能力越强，其中压迫强度为15000帕时，缩合单宁增加百分率差异最明显，而压迫强度为3000帕时，强度过小，两种植物的叶片均未达到受伤害的程度，压迫强度为25000帕时，强度过大，两种植物的叶片均有很大程度的伤害，只有适宜的压迫强度才能更好的区分出不同植物的耐践踏能力。
实验例2、快速比较多年生花生和密子豆的耐践踏能力的方法
快速比较多年生花生和密子豆的耐践踏能力的方法，包括如下步骤：
(1)叶片的选择与采集：
分别在多年生花生和密子豆的健壮枝条上选取已完全展开，并已完全变绿的第一复叶，用不锈钢剪刀从小叶片基部剪切下来，不要伤及小叶叶片，也不要留存小叶柄，每一复叶中的对称小叶分成对照组和模拟践踏组，每组做5个重复，将每组的小叶称重记录；不同枝条选择的复叶在色泽、大小、幼嫩程度上要一致。
(2)模拟践踏处理
模拟践踏组的小叶在15000帕强度下压迫处理，维持15s，对照组的小叶不进行处理。(3)缩合单宁的提取
模拟践踏处理后的小叶立即加入抽提液，按每100mg叶片鲜重添加5mL抽提液，30℃遮光抽提4h，获得缩合单宁提取液；对照组的小叶也采取相同方法提取；所述抽提液为体积百分比为10％的盐酸-甲醇溶液。
(4)缩合单宁含量的测定
取对照组和模拟践踏组的缩合单宁提取液1mL，加入3mL显色液(使用前，显色A液与显色B液等体积混合获得显色液)，摇匀，置于30℃的黑暗培养箱中反应30min，在分光光度计上测定500nm波长的OD值；所述显色液A：质量体积比为10％的香草醛-甲醇溶液，显色液B：体积百分比为20％的盐酸-甲醇溶液。
(5)耐践踏能力比较
以缩合单宁含量增加百分率来表征草地耐践踏能力，增加百分率越小，耐践踏能力越强；
缩合单宁增加百分率＝(模拟践踏组的OD500nm-对照组的OD500nm)/对照组的OD500nm。
表2、多年生花生和密子豆的耐践踏能力比较
结果如表2所示，密子豆的缩合单宁增加百分率更小，其耐践踏能力越强。
对比例、采用常规的方法测定多年生花生和密子豆的耐践踏能力
本对比例采用常规的评价方法，以草地伤害程度和草地恢复能力作为综合评判指标，来评价草地的耐践踏能力。以叶片损伤的百分率作为衡量践踏对草地伤害程度的指标，叶片破损率(％)在践踏处理完成后的第2天进行测定，按0.3m2内叶片破裂数计算，叶片破损率越高，草地伤害程度越大。践踏处理后2周，以枝条顶端第一展开复叶叶片鲜重降低率来衡量践踏处理后草地恢复的指标。叶片鲜重降低率(％)＝(未践踏组的叶片鲜重-践踏后组的叶片鲜重)/未践踏组的叶片鲜重，叶片鲜重降低率越小，草地恢复能力越好；
践踏处理方法为：每次践踏处理让一个体重为60kg的人在草地上来回走动，每天处理1次，每次处理保证小区内每处均被践踏10次，践踏强度设两个水平，轻度践踏为连续2天，中度践踏为连续踏处理5天，以不践踏的作为对照组。
表3、采用常规方法进行多年生花生和密子豆的耐践踏能力比较
结果如表3所示，无论是轻度践踏和中度践踏，密子豆的叶片破损率及叶片鲜重降低率均显著低于多年生花生草地，说明密子豆的耐践踏能力强于多年生花生，这与实施例2得到的结果一致。
以上信息均表明：本发明的快速比较耐践踏能力的方法可信度高，与常规方法相比，能得到同样的结果，但操作相对快捷简便，仅需几个小时便可快速完成，有利于加快草地种质资源的评价和利用，加快耐践踏突变株系的筛选。

Claims (10)

1.一种快速比较草地耐践踏能力的方法，包括如下步骤：
(1)叶片的选择与采集：在待比较草地的健壮枝条上选取复叶，采集复叶中的对称小叶分为对照组和模拟践踏组，不同枝条选择的复叶在色泽、大小、幼嫩程度上要一致；
(2)模拟践踏处理：对模拟践踏组的小叶进行压迫处理，对照组的小叶不进行压迫处理；
(3)缩合单宁的提取：将对照组的小叶和模拟践踏处理后的小叶分别加入抽提液，黑暗条件下抽提，分别获得对照组和模拟践踏组的缩合单宁提取液；
(4)耐践踏能力比较：分别测定对照组和模拟践踏组的缩合单宁提取液中的缩合单宁含量，以缩合单宁含量增加百分率来表征草地耐践踏能力，缩合单宁含量增加百分率越小，耐践踏能力越强；缩合单宁含量增加百分率＝(模拟践踏组的缩合单宁含量-对照组的缩合单宁含量)/对照组的缩合单宁含量。
2.根据权利要求1所述的一种快速比较草地耐践踏能力的方法，其特征在于：步骤(2)中，压迫处理的方法为：将模拟践踏组的小叶置于10000～30000帕强度下压迫处理10～30s。
3.根据权利要求1所述的一种快速比较草地耐践踏能力的方法，其特征在于：步骤(3)中，抽提液为体积百分比为8％～12％的盐酸-甲醇溶液。
4.根据权利要求1所述的一种快速比较草地耐践踏能力的方法，其特征在于：步骤(3)中，按每100mg小叶鲜重加入4～6mL抽提液。
5.根据权利要求1所述的一种快速比较草地耐践踏能力的方法，其特征在于：步骤(3)中，抽提温度为28～32℃，抽提时长为2～4h。
6.根据权利要求1所述的一种快速比较草地耐践踏能力的方法，其特征在于：步骤(4)中，缩合单宁含量的测定方法为：往缩合单宁提取液中加入2～3倍体积的显色液，摇匀，黑暗条件下，25～35℃反应25～35min，测定OD500nm，以OD500nm表征缩合单宁含量。
7.根据权利要求6所述的一种快速比较草地耐践踏能力的方法，其特征在于：显色液为显色液A和显色液B的等体积混合液，使用前混合；显色液A为质量体积比为8％～12％的香草醛-甲醇溶液，显色液B为体积百分比为16％～24％的盐酸-甲醇溶液。
8.根据权利要求1所述的一种快速比较草地耐践踏能力的方法，其特征在于：步骤(1)中，复叶为已完全展开和变绿的第一复叶。
9.根据权利要求1所述的一种快速比较草地耐践踏能力的方法，其特征在于：步骤(1)中，采集小叶的方法为：将小叶片基部剪切下来，不要伤及小叶叶片，也不要留存小叶柄。
10.根据权利要求1所述的一种快速比较草地耐践踏能力的方法，其特征在于：草地为豆科植物草地。
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