CN107076765A

CN107076765A - 解蔽溶液中的内毒素

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Publication number: CN107076765A
Application number: CN201580043199.9A
Authority: CN
Inventors: J·赖西; H·格莱尔特
Original assignee: Profos AG
Current assignee: Profos AG; Hyglos Invest GmbH
Priority date: 2014-06-12
Filing date: 2015-06-12
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2035-06-12
Also published as: JP6566972B2; US11860158B2; ES2738379T5; PL3155422T3; AU2015273432A1; EP3848707B1; EP2955518B2; DK2955518T4; DK2955518T3; ES2736024T5; DK3155422T3; US20190353648A1; ES2736024T3; JP2017519208A; EP3155422B2; US10697958B2; CN110068692A; CN107076765B; PT3155422T; EP3155422B1

Abstract

本发明涉及解蔽组合物中的内毒素，以使先前存在的但无法检测的内毒素可检测。

Description

解蔽溶液中的内毒素

技术领域

本发明涉及解蔽组合物、优选药物组合物中的内毒素，以使得存在的但无法检测的内毒素可检测。具体地，本发明涉及一种解蔽组合物中内毒素的方法。本发明进一步涉及检测组合物中内毒素的方法。本发明还涉及一种用于解蔽组合物中内毒素的试剂盒。本发明还涉及一种能够解蔽内毒素(例如通过从所述内毒素和内毒素掩蔽物间的复合物中释放内毒素以解蔽组合物中内毒素)的调节剂的用途。

背景技术

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的一部分。不管这些微生物是否为致病的，内毒素总是与革兰氏阴性菌相关联。虽然术语“内毒素”偶尔用于指代任何与细胞相关的细菌毒素，但在细菌学中其专门用于指代与革兰氏阴性病原体(例如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、假单胞菌属、奈瑟氏菌属、流感嗜血杆菌、百日咳杆菌和霍乱弧菌)外膜相关的脂多糖(LPS)复合物。

水性组合物中存在内毒素是一个棘手的问题，其严重威胁和/或限制许多组合物的应用，特别是如果希望将所述组合物用于制药用途时。这对于包含蛋白产品的组合物(例如重组蛋白产品)更是如此。天然存在的内毒素，特别是属于一类被描述为脂多糖(LPS)化合物的内毒素，是由特定类型细菌(例如革兰氏阴性菌)产生的分子。通常，内毒素(例如LPS)包含扩展的多糖O-抗原、包括外部核心组分和内部核心组分的核心抗原多糖、和包含脂族酰胺及脂族酸酯的脂质A域。这样的内毒素存在于革兰氏阴性菌的外膜中，并于外膜通过庇护所述微生物免于化学攻击而有助于细菌结构的完整性。这样的内毒素使这些细菌细胞膜的负电荷增加，帮助稳定整体膜结构。这样的内毒素引起常规动物(例如人)免疫系统的强烈反应，这是因为常规血清含有脂低聚糖(LOS)受体，其通常引导免疫系统的细胞毒性作用以抵抗侵入具有这样的内毒素的细菌性病原体。

当内毒素以与其源细菌分离的形式存在于人血液中时，内毒素(例如LPS)可引起内毒素血症，在严重情况下可导致感染性休克。该反应的发生源于内毒素脂质A组分，其可引起哺乳动物免疫系统不受控的激活，在某些情况下产生对免疫系统细胞激活负责的炎症介质，例如toll样受体(TLR)4。

细菌，及其产生的内毒素也是普遍存在的。例如，已知在水供应系统(包括那些用于制备药物制剂的实验室和设施)的管和软管中存在内毒素污染物。容器(例如配制药物过程中使用的发酵罐和玻璃器皿)的表面通常也被污染。此外，由于人类携带细菌，因此他们身体上存在内毒素，所以这样的药物配制设施中的员工也代表了可能的内毒素污染物源。

当然，除上述以外，革兰氏阴性菌本身在生产i.a.重组治疗性蛋白中具有广泛应用，因此总是存在这样的危害：生产过程中使用的这样的细菌也可直接引起含有这样的治疗性蛋白的水性组合物(例如药物制剂)的内毒素污染。

为了防范内毒素污染物的潜在危险性掺入，不论它们的来源是怎样的，在这样的溶液被用于治疗目的施用前，通常必须采取措施以在这样的蛋白的生产过程的所有步骤和使用的产品中排除内毒素。实际上，排除和/或移除和检验不存在所有痕量的(可检测的)内毒素是向监管部门寻求批准任何新治疗药物，尤其是含有细菌产生的产物的那些，或其已在生产过程中的任意位置与细菌接触的那些药物时多少必须面对的要求(见，例如EMEA,Q6B,Specifications:Test Procedures and Acceptance Criteria forBiotechnological/Biological Products；2.1.4Purity,Impurities and Contaminants；Contaminants；4.1.3Purity and impurities；2)FDA,Q6B,Specifications:TestProcedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products；II.A.4.Purity,Impurities and Contaminants；IV.A.3.Purity and Impurities)。例如，所有盛放和/或转移意在最终给药的溶液的容器在与所述溶液接触前必须是不含内毒素的。除热原烘箱可用于该目的，其中需要超过200℃的温度以使内毒素分解。基于作为注射器或小瓶的初级包装材料，250℃的玻璃化温度和30分钟的保持时间通常实现内毒素水平减少1000倍系数。通常，液体不能通过加热除热原，因此使用了不同的方法，例如色谱(例如阴离子交换)、相萃取(例如Trition X-114)、过滤(例如超滤)。

一种用于检测内毒素活性的常用试验为使用鲎血的鲎变形细胞溶解物(LAL)试验。由于酶级联反应的有力放大，非常低水平的细胞内毒素就可引起鲎细胞溶解物凝聚。然而，由于鲎种群的减少，人们已在努力开发可替代物，例如重组物因子C试验，用于检测溶液中内毒素的存在。该类方法中最有前景的是酶联亲和吸附试验，其使用固相捕获内毒素，继而通过LAL试验中蛋白的重组版(因子C)检测。试剂盒就是一个这样的亲和吸附试验。

然而，即使最好的可用于检测致热原(例如内毒素，特别是LPS)存在的测试，也常常难于检测溶液中的LPS。这暗示了这样的危害：被合理地(不含任何可检测的内毒素)认为无内毒素的溶液，实际含有被轻易掩蔽而无法检测到的内毒素。这样的溶液，例如药物制剂，将不会被监管批准机构所禁止(至少不会因为含有内毒素而被禁止)，因为根据所有的诊断表象，这些溶液都是无内毒素的，因此满足、或至少看起来满足该监管要求。然而，很明显，向个体施用这样的表面上无内毒素的溶液冒着引发上述各类反应的风险。在这样的情况下，可能很晚地在个体已发生上述各类不良反应和潜在威胁生命的反应之后，才知道这样的溶液中存在掩蔽的内毒素。此外，从卫生角度，药品监管局对积极了解药物组合物中含有什么物质、不含有什么物质非常重视。这最终归结到可靠地检测给定组合物中所有组分的能力，以及相信参考存在或不存在所有检测物质所得的结果的能力。

应注意有关内毒素的术语“掩蔽”和“解蔽”在文献中以多种意义使用。一方面，文献中使用术语“内毒素解蔽”描述从特定溶液(例如蛋白溶液)中移除内毒素。在这种情况下，在使用常规方法移除内毒素(例如色谱方法)之前和之后，特定内毒素含量是可检测的。当可用技术难于完全从特定样品中移除内毒素时，无法被移除的内毒素被称为“掩蔽的”内毒素。可通过可用技术移除的任何内毒素都被称为“解蔽的”内毒素。根据该术语用法，“掩蔽的”内毒素从而表示无法被移除的内毒素，并意味着(可检测的)内毒素的不充分移除。

另一方面，文献也在不充分的内毒素检测情况下使用术语“内毒素掩蔽”。在这种情况下，即使存在内毒素，也仅有部分量可以被检测，或者在许多情况下没有任何内毒素可以被检测。根据该术语用法，“掩蔽的”内毒素从而表示无法检测的，或仅有很少可被检测的内毒素，并意味着不充分的内毒素检测。

多种组合物中都可发生内毒素的不充分检测。例如在蛋白质溶液中(Petsch等人,Analytical Biochemistry 259,42-47,1998)、药物产品中(J.Chen和K.Williams,Follow-Up on Low Endotoxin Recovery in Biologics PDA Letter,Oct.2013)，或甚至在药物产品的常规配方组分中(J.Reich等人,Poster:Low Endotoxin Recovery in CommonProtein Formulations,6th Workshop on Monoclonal Antibodies,Basel,Switzerland,2013；J.Reich等人.,Poster:Low Endotoxin Recovery in Biologics:Case Study–Comparison of Natural Occurring Endotoxin(NOE)and Commercially AvailableStandard Endotoxin,PDA年度会议,圣安东尼奥,美国,2014)。

EP308 239A2涉及一种在生物有用的大分子溶液中减少细菌内毒素污染的方法。该文件提及“解蔽”内毒素。文件公开内容的一个重要方面是内毒素甚至当“掩蔽”时，仍是可检测的。实验者从而知晓甚至掩蔽的内毒素的存在，因为所述内毒素是可检测的。这与本发明所使用的术语“掩蔽”具有不同的含义。根据本发明，如下文所解释的，“掩蔽的”内毒素是无法检测的。

类似地，US 2010/0028857 A1涉及一种检测内毒素，继而将其移除的方法。该文件没有解决如何使先前无法检测的内毒素能被检测。

Reich等人(墙报：Low Endotoxin Recovery in Common Protein Formulations,第6届单克隆抗体研讨会,巴塞尔,瑞士,2013)描述了对已知含有内毒素的溶液进行时间-依赖掩蔽效应的评估。但是当该文件提及“解蔽方法”时，没有公开用于解蔽内毒素的具体步骤。

类似地，Reich和Grallert(墙报:Low Endotoxin Recovery in Biologics:CaseStudy–Comparison of Natural Occurring Endotoxin(NOE)and CommerciallyAvailable Standard Endotoxin,PDA年度会议,圣安东尼奥,USA,2014)研究了已知含有内毒素的溶液中的内毒素掩蔽机制。但是当该墙报表明“解蔽是可能的”时，没有公开用于解蔽内毒素的措施。特别是，该文件提及用“添加剂”解蔽，然而未提及任何关于能解蔽内毒素的调节剂，或任何应用于解蔽内毒素的措施。

最后，Reich的陈述(“Reliability of endotoxin-detection:Mechanisticprinciples of endotoxin-masking and strategies for de-masking”,PDAPharmaceutical Microbiology,Berlin,Germany,2014)研究了在已知含有内毒素的溶液中内毒素掩蔽的机制。然而当该陈述在“解蔽”背景下提及“添加剂”时，其未提及任何有关能解蔽内毒素的调节剂，或任何应用于解蔽内毒素的步骤。

因此对提供以下方法存在强烈动机：组合物中存在的所有内毒素，包括因为被某种其他组合物组分所掩蔽的无法检测的内毒素，可以被解蔽，从而可检测。提供解蔽和/或检测组合物中迄今无法检测的内毒素的方法将极大地帮助提高患者的安全。这是本发明解决这样的需求的目的。

发明内容

因此，本发明的一方面涉及一种解蔽含有内毒素掩蔽物并疑似含有内毒素的组合物、优选药物组合物中的内毒素的方法，所述方法包括向所述组合物中加入能够，例如，若存在内毒素，通过从所述内毒素和所述内毒素掩蔽物的复合物中释放所述内毒素来解蔽所述内毒素的调节剂的步骤。在大多数情况下，所述药物组合物将是水性组合物。

在另一方面，本发明涉及检测含有内毒素掩蔽物并疑似含有内毒素的组合物、优选药物组合物中的内毒素的方法，所述方法包括向所述组合物中加入能够，例如，若存在内毒素，通过从所述内毒素和所述内毒素掩蔽物的复合物中释放所述内毒素来解蔽所述内毒素的调节剂；和通过检测方法检测所述内毒素的步骤。在大多数情况下，所述药物组合物将是水性组合物。

在某些实施方案中，以上解蔽和/或检测方法可进一步包括向所述组合物加入影响溶液中氢键稳定性的试剂的步骤。在某些实施方案中，优选在向所述溶液加入所述调节剂前加入所述影响溶液中氢键稳定性的试剂。

在另一方面，本发明涉及用于解蔽含有内毒素掩蔽物并疑似含有所述内毒素的组合物、优选药物组合物中的内毒素的试剂盒，所述试剂盒包括a)能够，例如通过从所述内毒素和所述内毒素掩蔽物的复合物中释放所述内毒素来解蔽所述内毒素的调节剂；及b)影响溶液中氢键稳定性的试剂；其中组分(a)和(b)处于相同或不同的包装中。

在另一方面，本发明涉及能够，例如通过从所述内毒素和所述内毒素掩蔽物的复合物中释放所述内毒素来解蔽内毒素的调节剂，解蔽疑似含有所述内毒素和内毒素掩蔽物的组合物、优选药物组合物中的内毒素的用途。

由以下公开的内容，本发明的其他实施方案将是显而易见的。

附图说明

图1说明了被认为是构成根据本发明实施方案所述内毒素解蔽基础的机理。在图1描绘的方案中，溶液中存在内毒素和(能作为内毒素掩蔽物的)清洁剂，所述清洁剂形成胶束，内毒素被包埋入其中，从而被掩蔽而无法检测。图1图解示出了加入破坏这些胶束、释放包埋的内毒素、同时其自身不形成新胶束的单组分调节剂的作用。在破坏所述清洁剂胶束后，所述单组分调节剂作为释放的内毒素的分子伴侣将其稳定于溶液中。单个和聚集的内毒素部分间存在平衡，内毒素聚集体的检测基于所述聚集形式进行(“Aggregates are thebiologically active units of endotoxins”.Mueller,M.,Lindner,B.,Kusomoto,S.,Fukase,K.,Schromm,A.B.和Seydel,U.(2004)The Journal of Biological Chemistry,第279卷,第25号,第26307-26313页)。组(a)中所示形式的内毒素不易于被检测，而组(c)所示形式的内毒素是可检测的。下文中进一步详细讨论了图1描绘的方案。

图2说明了被认为是构成根据本发明另一个实施方案所述内毒素解蔽基础的机理。在图2描绘的方案中，溶液中存在内毒素和(能作为内毒素掩蔽物的)清洁剂，所述清洁剂形成胶束，内毒素被包埋入其中，从而被掩蔽而无法检测。图2图解示出了加入包含蛋白和非蛋白组分的双组分调节剂的作用。该双组分调节剂被认为分解之前插入内毒素并将其掩蔽的清洁剂胶束。调节剂的非蛋白组分暂时将内毒素稳定于胶束外，而所述调节剂的蛋白组分通过结合i.a.清洁剂分子破坏清洁剂胶束的稳定性。下文中进一步详细讨论了图2描绘的方案。

图3说明了被认为是构成根据本发明另一个实施方案所述内毒素解蔽基础的机理。在图3描绘的方案中，溶液中存在内毒素和(能作为内毒素掩蔽物的)清洁剂，所述清洁剂形成胶束，内毒素被包埋入其中，从而被掩蔽而无法检测。图3图解示出了加入多组分调节剂以及影响氢键稳定性的试剂的作用。多组分调节剂和影响氢键稳定性的试剂一起破坏起初掩蔽内毒素的清洁剂胶束的稳定性，从而促进内毒素聚集而使其可检测。下文中进一步详细讨论了图3描绘的方案。

图4说明了被认为是构成根据本发明另一种实施方案所述内毒素解蔽基础的机理。在图4描绘的方案中，溶液中存在内毒素和蛋白。该蛋白包含结合槽，内毒素可稳定地结合至该槽，从而保持掩蔽而无法被检测。图4图解示出了加入多组分调节剂的作用，使先前掩蔽的内毒素聚集并可检测。下文中进一步详细讨论了图4描绘的方案。

图5说明了被认为是构成根据本发明另一种实施方案所述内毒素解蔽基础的机理。在图5描绘的方案中，溶液中存在内毒素和(能作为内毒素掩蔽物的)蛋白。所述蛋白包含结合槽，内毒素可稳定地结合至该槽，从而保持掩蔽而无法被检测。图5图解示出了加入影响氢键稳定性的试剂以及包含蛋白和非蛋白组分的多组分调节剂的作用。它们一起破坏和掩蔽蛋白形成的复合物中的内毒素稳定性，将内毒素暂时地稳定于和掩蔽蛋白形成的复合物的外侧，促进释放的内毒素的聚集，使其可检测。下文中进一步详细讨论了图5描绘的方案。

图6说明了被认为是构成根据本发明另一种实施方案所述内毒素解蔽基础的机理。在图6描绘的方案中，溶液中存在内毒素和(能作为内毒素掩蔽物的)蛋白以及清洁剂。所述蛋白包含结合槽，内毒素可稳定地结合至该槽，从而保持掩蔽而无法被检测。此外，所述清洁剂形成稳定的胶束，稳定插入其中的内毒素分子被掩蔽。图6图解示出了加入影响氢键稳定性的试剂以及包含蛋白和非蛋白组分的多组分调节剂的作用。它们一起破坏和掩蔽蛋白形成的复合物中的内毒素和/或掩蔽清洁剂胶束中的内毒素的稳定性，将内毒素暂时地稳定于和掩蔽蛋白形成的复合物外和/或掩蔽清洁剂胶束中，促进释放的内毒素的聚集，使其可检测。下文中进一步详细讨论了图6描绘的方案。

图7是示出了仅使用1-十二烷醇，以及和BSA一起使用1-十二烷醇时从清洁剂掩蔽物(聚山梨醇酯20/柠檬酸盐)中内毒素LPS的回收率百分比图。

图8是示出了使用多种强度的多种调节剂系统时从清洁剂掩蔽物Triton X-100中内毒素LPS的回收率百分比图。

图9是示出了使用多种调节剂系统时从多种清洁剂掩蔽系统中内毒素LPS的回收率百分比图。

图10是示出了取决于pH的从掩蔽清洁剂(聚山梨醇酯20)中内毒素LPS的回收率百分比图。

图11是示出了取决于pH的从掩蔽清洁剂(聚山梨醇酯80)中内毒素LPS的回收率百分比图。

图12是示出了用于确定和优化疑似含有掩蔽内毒素的待研究组合物的解蔽方法的一般性确证方案的流程图。

图13是示出了用于确定和优化疑似含有掩蔽内毒素的待研究组合物的解蔽方法的一般性评估方法的表格。

图14是根据本发明的方法掩蔽前和掩蔽后(分别为图左柱和中柱)或解蔽后(图右柱)从LPS回收率(即测量的LPS活性)水平角度所看到的本发明方法的一般性图示。图的左柱和中柱从而表示在药物制剂中通常占主导的环境条件，其中一种或多种内毒素掩蔽物使溶液中存在的内毒素无法被检测。该内毒素又成为可检测的，即通过本发明的方法，可从其掩蔽态中被“解救”，使能够检测之前被掩蔽的内毒素。

图15示出了说明与本发明所述解蔽方法相关的动力学的通用图。示出了几种代表性内毒素从最左边活性的(即聚集的从而是可检测的)LPS向掩蔽的LPS(中间底部；非聚集的)转换。由于与“掩蔽的LPS”相关的能量低于与“活性LPS”相关的能量，因此LPS在这种掩蔽形式中保持稳定。本发明所述方法有效地破坏该掩蔽的LPS的稳定性，从而提升其能量至掩蔽的LPS以上的水平，从这里LPS还可落回至聚集形式的能量(图的最右端)。认为重组调节剂在介导该LPS从溶解的(掩蔽的)形式被解救为聚集的(解蔽的)形式中起到重要作用。

一般说明

应理解，前述一般说明以及以下详细描述仅是示例性的和说明性的，并不限于本发明要求的范围。在本申请中，除另有说明，使用单数时包括复数。在本申请中，除另有说明，使用“或者”时表示“和/或”。此外，使用术语“包括”以及其他语法形式，例如“包括了”和“已包括”，是非限制性的。同理，使用术语“包含”以及其他语法形式，例如“包含了”和“已包含”，是非限制性的。贯穿说明书的标题仅用于组织目的。它们尤其并非意在限制本文所述的各种实施方案，且应理解在一个子标题下描述的要素和实施方案可与另一个子标题下描述的要素和实施方案自由组合。

在前述、后续的说明书和权利要求中，任何实施方案的特征意在与任意其他实施方案中的那些是可组合的。任何一个实施方案中的一个或者多个特征和任意其他实施方案中的一个或多个特征的这样的组合属于提交的本申请的公开内容。

本申请中引用的所有包括但不限于专利、专利申请、文章、专著、书籍、协定和规章的文件或者部分文件，无论用于何种目的，在此清楚地以其全文并入本文。

具体实施方式

如上文所述，本发明的一方面涉及解蔽含有内毒素掩蔽物及疑似含有内毒素的组合物、优选药物组合物中的内毒素的方法，所述方法包括向所述组合物中加入能够解蔽所述内毒素的调节剂的步骤，例如，若存在内毒素，通过从所述内毒素和所述内毒素掩蔽物的复合物中释放所述内毒素。在大多数情况下，所述药物组合物将是水性组合物。

本发明的另一方面涉及检测含有内毒素掩蔽物及疑似含有内毒素的组合物、优选药物组合物中的内毒素的方法，所述方法包括向所述组合物中加入能够解蔽所述内毒素的调节剂的步骤，例如，若存在内毒素，通过从所述内毒素和所述内毒素掩蔽物的复合物中释放所述内毒素；和通过一种检测方法检测所述内毒素。在大多数情况下，所述药物组合物将是水性组合物。

内毒素

术语“内毒素”指细菌表面产生的、特别是革兰氏阴性菌表面产生的分子，该细菌是由于其夹心于细胞内膜和细菌外膜间的薄的肽聚糖层，使其在使用区分细菌的革兰氏染色法时无法保持结晶紫染色，从而避免被本发明检测为阳性的细菌。特别地，内毒素是存在于革兰氏阴性菌外膜中的生物活性物质。一类常规内毒素是脂多糖(LPS)。对于本发明的目的，术语“内毒素”和“LPS”可互换使用。然而如本文其他地方所讨论的，当然理解存在例如不同来源的不同类型的LPS，因此术语“内毒素”和“LPS”意在涵盖这些不同类型的LPS。内毒素位于细菌的表面，并和蛋白质及磷脂一起构成细菌外膜。通常，LPS由具有不同化学和物理性质的两部分组成；亲水的糖域(多糖)和疏水的脂域(脂质A)。可在多糖中识别两个不同的部分：核心寡糖和O-特异性多糖(M.A.Freudenberg,C.Galanos,BacterialLipopolysaccharides:Structure,Metabolism and Mechanisms of Action,Intern.Rev.Immunol.6,1990)。

脂质A是高度疏水的，并且是分子的内毒性活性部分。脂质A通常由携带两个磷酰基基团的β-D-GlcN-(1-6)-α-D-GlcN二糖组成。最多四个酰基链连结至该结构。而后这些链依次由其他的脂肪酸取代，所述脂肪酸可在它们的性质、数目、长度、次序和饱和度方面在物种间明显变化。共价结合至脂质A的是分子的核心部分，其可自身在形式上分为内核和外核。内核是脂质A的近端，含有不常见的糖，例如3-去氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)。外核从细菌表面进一步延伸，更可能由更常规的糖(例如己糖和己糖胺)组成。大多数情况下，在此上结合有重复糖类亚单元的聚合物(称为O-多糖)，其也通常由常规糖组成。然而该O-多糖不是普遍存在的，因为其被认为在许多革兰氏阴性菌株中是截短的或缺失。此外，某些菌株携带在其他保存良好的基因座中的突变，被称为术语“粗糙型突变体”以将它们与表达带有LPS的O-多糖的野生型“光滑”株区分(C.Erridge,E.Bennett-Guerrero,I.Poxton,Structure and function of lipopolysaccharides,Microbes and Infection,2002)。由Helmut Brade,Steven M.Opal,Stefanie N.Vogel和David C.Morrison编辑的，1999年由Marcel Dekker股份有限公司出版的(ISBN 0-8247-1944-1)书籍《健康与疾病中的内毒素》中可找到大量涉及内毒素(例如LPS)以及它们对健康影响的信息。

如上文所述，内毒素可源自不同的细菌源。内毒素的化学本质根据来源不同可稍微变化。例如，来自于不同细菌源的内毒素可在脂质A域的脂肪酰胺和脂肪酸酯中的脂肪链长度上稍微不同。然而，不考虑内毒素结构随来源的细微变化，如文本以上所述的相同的基础结构适用于大多数的(如果不是全部的话)内毒素，表明了不管细菌的来源种类，其具有相似的作用机制，及相应的相似的影响内毒素行为的机制。已知的内毒素的实例包括源自以下的那些：例如大肠杆菌，如大肠杆菌O55:B5(如可从Sigma以产品号L2637-5MG购买的)或大肠杆菌K12；马流产沙门菌(如可从Acila以产品号1220302购买)；肺炎克雷伯氏菌；摩氏摩根菌；小肠结肠炎耶尔森氏菌；粘质沙雷氏菌；奈瑟氏菌属，如脑膜炎奈瑟氏菌；鲍曼不动杆菌；阴沟肠杆菌，例如天然存在的内毒素(NOE)；假单胞细菌属，例如绿脓假单胞菌；沙门氏菌，例如肠道沙门氏菌；志贺氏菌属；流感嗜血杆菌；百日咳杆菌和霍乱弧菌。应理解该列举仅是示例性的，不以任何方式限制本发明所使用的术语“内毒素”。

内毒素掩蔽物

术语“内毒素掩蔽物”指在具有内毒素的溶液中，以可用的检测方法(例如通过鲎变形细胞溶解物(LAL)测试)使内毒素无法检测的物质。通常，当内毒素以聚集的形式存在于溶液中时，所述内毒素是可检测的，其中所述聚集的形式指多种或者至少两种内毒素部分是通过非共价相互作用(例如静电相互作用、疏水相互作用、范德华相互作用或其任意组合)结合，并在空间接近。然而，当内毒素的活性聚集态改变，使得内毒素变为溶解为单个内毒素分子时，通过常规检测系统检测内毒素的活性变得显著降低(无法检测的)，即，被掩蔽。可假设内毒素分离的分子实体，例如由于溶液中存在的清洁剂，是稳定的。假设这样的清洁剂通过形成使单个内毒素部分包埋于其中、不再能够与商业化内毒素试验中的因子C反应的去垢剂胶束，来稳定单个内毒素部分。某些蛋白也可影响或有助于无法检测的可溶型内毒素的稳定。例如，这样的蛋白可使内毒素带有结合槽，为单个内毒素分子提供合适的环境以稳定结合，从而破坏其他可检测的内毒素聚集体和/或防止内毒素分子与可用内毒素检测中的因子C相互作用。

假设至少两个内毒素分子，也就是至少两个LPS分子，必须形成聚集体以便能被商业可用的内毒素测试(例如从Hyglos GmbH可购的试剂盒)和基于LAL的测试检测。

实际上，多种出版物显示内毒素聚集体的生物活性显著强于解聚的内毒素(M.Mueller,B.Lindner,S.Kusumoto,K.Fukase,A,B.Schromm,U.Seydel,Aggregates arethe biologically acitve units of endotoxin,The Journal of biologicalChemistry,2004；A.Shnyra,K.Hultenby,A.Lindberg,Role of the physical state ofSalmonella Lipopolysaccharide in expression of biological and endotoxicproperties,Infection and Immunity,199)。此外，Tan等人所述的因子C的激活(N.S.Tan,M.L.P.NG,Y.H Yau,P.K.W.Chong,B Ho,J.L.Ding,Definition of endotoxin bindingsites in horseshoe crab Factor C recombinant sushi proteins andneutralization of endotoxin by sushi peptides,The FASEB Journal,2000)被表示为协同结合机制。在此如上文所述的，对于激活因子C需要至少两个LPS分子，其中所述因子C在基于鲎的检测方法(例如从Hyglos GmbH可购的试剂盒)中是关键因子。

是清洁剂的内毒素掩蔽物的实例包括阴离子清洁剂、阳离子清洁剂、非离子清洁剂和两亲性清洁剂及其任意组合。

可作为本发明清洁剂内毒素掩蔽物的阴离子清洁剂的实例包括烷基硫酸盐，例如月桂基硫酸铵或月桂基硫酸钠(SDS)；烷基醚硫酸盐，例如月桂醇聚醚硫酸钠或肉豆蔻醇聚醚硫酸钠；胆固醇硫酸盐；磺酸盐，例如十二烷基苯磺酸盐、月桂基磺基乙酸钠或二甲苯磺酸盐；烷基磺基琥珀酸盐，例如月桂基磺基琥珀酸二钠；亚砜，例如二癸基甲基亚砜；磷酸盐，例如三月桂醇聚醚-4磷酸盐；和羧酸盐，例如硬脂酸钠或月桂酰肌氨酸钠。

可作为本发明内毒素掩蔽物的阳离子清洁剂的实例包括伯胺、仲胺、叔胺和季铵阳离子，例如烷基三甲基铵盐(例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或十六烷基三甲基氯化铵(CTAC))；氯化十六烷基吡啶(CPC)；季铵清洁剂，例如三[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-十八烷基-磷酸铵(季铵盐52)和季铵化的羟乙基纤维素乙氧基化物(聚季铵盐-10)。

可作为本发明内毒素掩蔽物的非离子清洁剂的实例包括聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯(聚山梨醇酯)例如聚山梨醇酯(吐温20)、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80(吐温80)；聚氧乙二醇烷基醚；聚氧丙二醇烷基醚；葡萄糖苷烷基醚；聚氧乙二醇辛基苯酚醚；聚氧乙二醇烷基苯酚醚；丙三醇烷基酯；脱水山梨糖醇烷基酯；聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物；椰油酰胺MEA；固醇例如胆固醇；环糊精；泊洛沙姆例如普兰尼克嵌段聚合物(例如HO-(CH₂CH₂O)_n/2-(CH₂CH(CH₃)O)_m-(CH₂CH₂O)_n/2-H，其中对于F127，n＝200，m＝65；对于F61，n＝4.5，m＝31)和椰油酰胺DEA。

可作为本发明内毒素掩蔽物的两亲性清洁剂的实例包括CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)；磺基甜菜碱(sultaines)，例如椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱；甜菜碱，例如椰油酰胺丙基甜菜碱；胺氧化物例如棕榈胺氧化物、月桂胺氧化物和通式R³N⁺O^-的胺氧化物，其中R³是C₈-C₁₈烷基、C₈-C₁₈烯基或C₈-C₁₈炔基；和卵磷脂。特别地，上述通式R³N⁺O^-中的R³可以是任意的C₈烷基、C₉烷基、C₁₀烷基、C₁₁烷基、C₁₂烷基、C₁₃烷基、C₁₄烷基、C₁₅烷基、C₁₆烷基、C₁₇烷基或C₁₈烷基；或C₈烯基、C₉烯基、C₁₀烯基、C₁₁烯基、C₁₂烯基、C₁₃烯基、C₁₄烯基、C₁₅烯基、C₁₆烯基、C₁₇烯基或C₁₈烯基；或C₈炔基、C₉炔基、C₁₀炔基、C₁₁炔基、C₁₂炔基、C₁₃炔基、C₁₄炔基、C₁₅炔基、C₁₆炔基、C₁₇炔基或C₁₈炔基。

可替代地，或除上文所指出的(单独的或组合物的)任意内毒素掩蔽物以外，所述内毒素掩蔽剂也可以是活性药物成分(API)。该API可与上文所指出的清洁剂内毒素掩蔽剂一起或不含上文所指出的清洁剂内毒素掩蔽剂存在于溶液中。如果API与清洁剂内毒素掩蔽剂一起存在于溶液中，掩蔽效果可更显著，并如下文更详细的论述中，需要更有力的措施将掩蔽的内毒素从内毒素掩蔽物中释放。可特别产生或放大溶液中存在内毒素的掩蔽的API是蛋白API，例如抗体、抗体片段、激素、融合蛋白、蛋白质缀合物及其任意组合物。当蛋白API是抗体片段时，所述抗体片段可优选地选自由Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链抗体及其任意组合所组成的组。当蛋白API是抗体时，所述抗体可优选选自由以下组成的组：完全人抗体、抗个体基因型抗体、人源化抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、单克隆抗体、多克隆抗体及其任意组合物。可替代选择地或除上述之外，API还可以是有机小分子。本领域普通技术人员知晓术语“有机小分子”或“小分子”的意义。其是分子量不超过300g/mol、400g/mol、500g/mol、600g/mol、700g/mol、800g/mol、900g/mol或优选1000g/mol的分子。

通常，内毒素掩蔽剂，无论是清洁剂还是蛋白，都会具有以下特征：将溶解的和聚集的内毒素的平衡朝无法被可用的内毒素试验检测的溶解的内毒素方向移动。这种内毒素向不可检测形式的移动被称作本文的“掩蔽”。如上所述，内毒素是溶解的形式可例如包括内毒素a)被包埋至由清洁剂形成的胶束的脂层中；b)被结合至蛋白上或蛋白内，例如，结合至在活性药物制剂(例如蛋白)表面形成的合适的空间和静电环境中的适当的结合槽中；或者c)参与这两种可能的组合。不考虑内毒素是溶解的从而能量上不利于聚集形式的内毒素形式，净效果是可能会聚集的从而可检测的单个内毒素分子被独立地稳定，并以该独立的(溶解的)形式，变得并保持不可检测，即掩蔽。

即使无法检测，但当施用至个体时，溶液中这样的稳定内毒素分子仍然可引起和/或促进各种上文提出的热原和/或毒性反应。这种危险在药物制剂中是特别严重的，因为药物制剂常含有清洁剂以溶解API，例如蛋白API，当不含清洁剂时，API在药物制剂提供的浓度下会不溶解。通过加入清洁剂以使API(例如蛋白API)溶解，然后内毒素的聚集常在不知情下被破坏，而该聚集态是检测所述内毒素时所需要的。因此，当内毒素掩蔽物是清洁剂时，配制可接受形式和浓度的API(例如蛋白API)所采用的那种措施也有掩蔽溶液中内毒素的潜质。

如上文所述，内毒素掩蔽物也可以是蛋白，例如API本身。这种情况可在存在清洁剂内毒素掩蔽物的情况下或者在不存在清洁剂的情况下发生，也可在不存在清洁剂内毒素掩蔽物的情况下发生。在后面的情况中，API(尤其是蛋白API)可为内毒素提供稳定结合至这样的蛋白上或蛋白内的充分的环境，以使内毒素仅由API掩蔽，即不需要任何清洁剂来掩蔽内毒素，使其无法被检测。在所述内毒素掩蔽物是蛋白的情况下，该蛋白可以是API本身，或者可替代地或额外地可以是溶液中的与API不同的蛋白。通常，任何具有使内毒素单个分子稳定的合适空间和静电环境的蛋白(例如单个LPS分子)都可以潜在地影响或促使内毒素的掩蔽。

本发明的显著特征是当内毒素掩蔽物是蛋白时，不论是单独的或与额外的内毒素掩蔽物(例如清洁剂内毒素掩蔽物)一起，解蔽所述内毒素使得在解蔽后都不会使蛋白内毒素掩蔽物发生化学改变。尤其是，解蔽内毒素不切割或降解蛋白内毒素掩蔽物(例如蛋白API)。

在上文所讨论类型的情况下，可保持聚集从而是可检测的单个内毒素分子被稳定于所述蛋白上或蛋白内的一个或多个这样的表面位置。对于清洁剂胶束的情况，这样的稳定化使溶解的(不可检测的)内毒素和聚集的(可检测的)内毒素间存在的平衡向溶解的(不可检测的)内毒素的方向移动。如上文所述，可以设想这样的向溶解的(不可检测的)形式的移动在溶液同时包含清洁剂和一种或多种具有上述特征的蛋白质的情况下更为显著，因为在这样的情况下，由于内毒素掩蔽剂的使内毒素分子聚集形式之外的单个内毒素分子稳定，可同时保证胶束中稳定形式及蛋白表面上的稳定形式。在这样方案中，可能需要更严格的措施以将所述平衡向可检测的聚集的内毒素形式移动。下文对方案进一步的说明中更详细地讨论了这些内容(图1-6)。

调节剂

本文所使用的术语“调节剂”指一种或多种单独的或与其他配合物的化合物，其使掩蔽的内毒素对于内毒素试验检测(例如可由Hyglos GmbH提供的检测试验)更为敏感。本文使用的术语“调节剂”可以包括实现此目的的单一以及多种组分。在下文的一些实例中，涉及“调节剂系统”，虽然术语“调节剂”有时被用于表示意在一同工作的多种调节剂物质。这指的是包含多种一同作用以使掩蔽的内毒素在内毒素试验中是可检测的物质的多-组分调节剂。调节剂系统可包含不同组分用于不同目的，例如利用以不同方式影响内毒素和内毒素掩蔽物间复合物稳定性的调节剂物质的不同功能。为了便于参考，可以例如参考可单独或一起使用以解蔽内毒素的不同类型的调节剂。

●“破裂调节剂”：“破裂调节剂”是完全或部分破坏内毒素掩蔽物和内毒素间复合物的调节剂。当所述内毒素掩蔽物是清洁剂时，所述内毒素被掩蔽为插入至掩蔽清洁剂胶束脂层间的溶解形式，而后使这样的清洁剂胶束破裂，以释放所述内毒素的调节剂被称为破裂调节剂。如在下文更详细的描述中所讨论的，1-十二烷醇是一种这样的破裂调节剂。在解蔽过程中，破裂调节剂，例如1-十二烷醇、1-癸酸或辛基硫酸钠(SOS)，可在0.01-100mM的浓度范围内，优选0.1-10mM的浓度范围内，优选10nM的浓度下有利使用。

●“吸附调节剂”：“吸附调节剂”是具有结合使内毒素处于溶解并因此非-检测形式的物质的能力的调节剂。举例而言，当内毒素掩蔽剂是(例如包含于一些药物组合物中的)清洁剂时，则结合清洁剂分子并以该方式促进稳定内毒素胶束分解的调节剂被称为吸附调节剂。如在下文更详细的描述中所讨论的，BSA是一种这样的吸附调节剂。在解蔽过程中，吸附调节剂，例如BSA，可在0.1-20mg/mL的浓度范围内，优选1-10mg/mL的浓度范围内，优选10mg/ml浓度下有利使用。

●“置换调节剂”：“置换调节剂”是具有完全或者部分置换内毒素掩蔽剂上或掩蔽剂中的稳定结合位置上的内毒素分子的能力的调节剂。例如，当内毒素掩蔽剂是蛋白时，所述内毒素结合至将所述内毒素稳定于不可检测形式的蛋白内或蛋白上，则例如通过疏水相互作用，具有置换蛋白内或蛋白上内毒素的能力的调节剂被称为置换调节剂。如在下文更详细的描述中所讨论的，SDS是一种这样的置换调节剂。在解蔽过程中，置换调节剂，例如SDS，可在0.01-1wt％的浓度范围内，优选0.05-0.5wt％的浓度范围内，优选0.02-0.2wt％的浓度范围内，优选0.1wt％浓度下有利使用。

●“重组调节剂”：“重组调节剂”是具有在内毒素从内毒素掩蔽物释放(例如通过如上所述的破裂调节剂或置换调节剂)之后暂时稳定内毒素、从而帮助释放的溶解的(不可检测的)内毒素采取聚集(可检测)形式的能力的调节剂。在重组调节剂的帮助下，溶解的内毒素开始重组为聚集的内毒素。如在下文更详细的描述中所讨论的，1-十二烷醇是一种这样的重组调节剂。在解蔽过程中，重组调节剂，例如1-十二烷醇、1-癸酸或辛基硫酸钠(SOS)，可在0.01-100mM的浓度范围内，优选0.1-10mM的浓度范围内有利使用。在某些情况中，所述重组调节剂也可同时起到上述破裂调节剂的作用。

如在下文将变得清楚的，以上类型的调节剂不是互斥的，也就是对于给定的物质可具有以上不同类调节剂的功能。一个实例是1-十二烷醇，其可被分类为破裂调节剂(破坏清洁剂胶束)以及重组调节剂(暂时稳定胶束-释放的内毒素，从而所述内毒素可聚集并变为可检测的)。相似地，SDS也可被分类为破裂调节剂(破坏存在的另一种非SDS清洁剂胶束)以及置换调节剂(从可存在的任意掩蔽蛋白内或掩蔽蛋白上的结合位点释放内毒素)。关于调节剂类型的分类取决于所讨论的物质在特定组合物中的功能。然而，由于假定为了使内毒素成为可检测的，将内毒素从溶解形式重组为聚集形式是普遍需要的，因此调节剂一般包括至少一种作为“重组调节剂”的组分。

作为另一个实例，当内毒素掩蔽物是蛋白时作为“置换调节剂”起作用的物质可在某些当内毒素掩蔽物是清洁剂的情况中作为“破裂调节剂”。SDS是这样物质的一个实例，其调节剂组分类型的分类取决于主导条件。例如，当内毒素掩蔽物是蛋白时，SDS通常将作为置换调节剂，因为其有助于置换结合于掩蔽蛋白内或蛋白上的内毒素。然而，当内毒素掩蔽物是清洁剂时，SDS单独地或和另一种调节剂组分一起可更多地作为破裂调节剂，因为在该情况下其通过使胶束破裂促进内毒素从清洁剂胶束的脂层释放。

调节剂可含有一种或多种上述分类中的物质。例如，单一组分调节剂可只包含破裂调节剂例如1-十二烷醇。双组分调节剂可包含破裂调节剂(例如1-十二烷醇(也可作为重组调节剂))和一种吸附调节剂(例如BSA)或置换调节剂(例如SDS)，这取决于内毒素和内毒素掩蔽物间掩蔽复合物的性质。多组分调节剂可包括破裂调节剂(例如1-十二烷醇(也可作为重组调节剂))以及吸附调节剂(例如BSA)或置换调节剂(例如SDS)各一种，这取决于内毒素和内毒素掩蔽物间掩蔽复合物的性质。如将在以下详细描述，所选调节系统的复杂性取决于内毒素和内毒素掩蔽物间复合物的性质以及帮助所述复合物稳定的环境溶剂的条件。从以上，显然待分析是否存在内毒素的每种新组合物会需要其自己个性化的调节剂组合物以使掩蔽的内毒素易于被检测到。但是，如将在下文进一步所示的，对于待检测的给定组合物或制剂的合适调节剂的确定可由常规实验完成。

如上文所述，在最普遍意义上，假设调节剂打破内毒素和内毒素掩蔽物间复合物的稳定，并促进内毒素从内毒素掩蔽物中释放。通过这种方法，调节剂或调节剂系统有效使平衡从溶解(不可检测)态向聚集(可检测)态移动。

本发明人惊奇地发现溶液中存在的但不可检测的内毒素维持无法检测，因为如假设的，内毒素稳定溶解在溶液中存在的清洁剂胶束中，和/或稳定结合至溶液中存在的蛋白结构的表面。单独地稳定于该形式，内毒素分子无法被检测到。然而，本发明的发明人已发现可操控溶液条件，以使溶解的内毒素能成为可被检测的形式。在某些实例中，可能需要多种溶液条件操控以实现该目的，且所采用的影响平衡向聚集态的期望移动的措施的严格度将根据如上所述的内毒素掩蔽剂将内毒素稳定于溶解形式的程度来变化。但通常而言，根据本发明所述进行的操控应在将内毒素平衡从溶解态移动至聚集态从而使内毒素能被检测这样的总体目标的背景下理解。

为了实现上述目的，“调节剂”将通常包括两亲性分子，其竞争结合内毒素的脂质组分和内毒素掩蔽物，从而弱化前者和后者间的相互作用。这样的竞争结合通常通过以下实现：提供至少一种调节剂系统组分，其形式为在结构上与内毒素的(两亲性)脂质组分类似，以使前者可替换与内毒素掩蔽物稳定相互作用的后者。

例如，在内毒素掩蔽物是清洁剂的情况下，适当的破裂调节剂通常将包括能够稳定插入，即插入两亲性清洁剂分子和内毒素相似的两亲性脂质部分间的两亲性化合物。当内毒素掩蔽物是清洁剂时，两亲性破裂调节剂将导致几种平行效应，其有益于平衡从内毒素的溶解形式整体移动至聚集形式。首先，提供包含至少一种两亲性破裂调节剂的调节剂系统破坏以清洁剂胶束为基础的亲脂相互作用，以使这些胶束分解。由于之前内毒素通过将其脂质组分插入至清洁剂胶束的脂质层而是溶解的(从而被掩蔽)，因此胶束的分解除去了这些稳定化力并导致之前被包埋的内毒素的释放。在内毒素掩蔽物是或包含清洁剂的情况下，破裂调节剂的作用从而是破坏清洁剂胶束。

此外，一旦内毒素从如上所述的其清洁剂胶束中释放，破裂调节剂的两亲性特征还可使其与内毒素的脂质组分相联系。这种两亲性破裂调节剂和内毒素脂质组分间的相互作用具有在水溶液中在内毒素从稳定化的清洁剂胶束中释放后护送内毒素的功效。在该情况下，破裂调节剂将具有作为重组调节剂的双重功效。当破裂调节剂在特征上是两亲性的时，不应排除其可能能够自身形成胶束。然而，当两亲性的破裂调节剂不以自身形成胶束(其可能简单地交换一个稳定的从而掩蔽另一个的内毒素态)时，解蔽效应通常将是最佳的。因此重组调节剂的关键作用是暂时稳定释放的内毒素(即使少于其先前与内毒素掩蔽物的复合物中的内毒素)，有效地将内毒素护送至聚集态，继而是可检测的状态。

因此，在溶液中暂时被护送，而后释放的内毒素自由地聚集为可检测形式，从而是“解蔽的”。，除了加入调节剂或调节剂体系，进行其它的溶液条件操控使得平衡向这种聚集的可检测的形式移动是否是必须的，通常将取决于溶液中主导的条件和与内毒素掩蔽物复合的内毒素的初步稳定性。

在另一个上文已考虑的方案中，内毒素掩蔽物不是、或不仅是清洁剂，其也可以是或包含在表面具有结合槽的蛋白，所述结合槽适于稳定地结合单个内毒素部分，以使其无法被检测。在该情况下，有关调节剂的相似的考虑按上文所述应用。例如，在以下情况下使用破裂(两亲性)调节剂和/或置换调节剂，所述情况为：所述内毒素是或包含蛋白，该蛋白具有的功效是调节剂破坏蛋白(内毒素掩蔽物)亲脂氨基酸侧链和内毒素脂质组分间存在的亲脂相互作用。由于破裂调节剂和/或置换调节剂在特征上倾向于两亲性，因此调节剂也可能破坏蛋白(内毒素掩蔽物)中的极性和/或离子性侧链与内毒素核的极性基团和/或O-抗原多糖区域间存在的静电相互作用。在这些稳定的相互作用被破坏的情况下，之前由蛋白内毒素掩蔽物掩蔽的内毒素因此从其和蛋白之前的复合物中被置换，通过与如上所述的重组调节剂的相互作用，其在溶液中被护送至聚集态。

如上所述的，对于内毒素掩蔽物是清洁剂且不存在蛋白内毒素掩蔽物的情况下，释放的和重组调节剂护送的内毒素而后自由地聚集为可检测的形式，从而是“解蔽的”。除了加入调节剂体系的组分，进行其它的溶液条件操控以使平衡向这种聚集的可检测的内毒素形式移动是否是必须的，通常将取决于溶液中主导的条件和与内毒素掩蔽物复合的内毒素的初步稳定性。

调节剂，例如破裂调节剂、置换调节剂和/或重组调节剂在某些实施方案中可包含第一杂原子取代的脂族化合物，其中所述第一杂原子-取代的脂族化合物的主链包括8-16个碳原子。如本文使用的，根据标准IUPAC命名法编号，术语“主链”指所述包含8-16个碳原子的第一杂原子取代的脂族化合物的最长链。具体地，所述第一杂原子取代的脂族化合物的主链可包含8、9、10、11、12、13、14、15或16个碳原子。如本文所使用的，术语“杂原子”指除碳外的任意原子，其与第一杂原子取代的脂族化合物中的碳原子共价结合。代表性的杂原子包括氧、氮和硫原子。在进一优选的实施方案中，所述氧取代的脂族化合物是脂肪醇，特别是1-十二烷醇，即由式HO-(CH₂)₁₁-CH₃表示的分子。如上文所述，1-十二烷醇在许多实例中特别适于作为破裂调节剂，以及如果不是全部实例也是大多数实例中，作为重组调节剂。

重组调节剂被认为在促进形成聚集的可检测形式的内毒素上，即使不是不可或缺的，也起到非常重要的作用。重组调节剂可以是杂原子取代的在其主链上含有8、9、10、11、12、13、14、15或16个碳原子的脂族化合物。术语“主链”指由标准IUPAC命名法计数的重组调节剂的最长链。如本文所使用的，术语“杂原子”指除碳外的任何原子，其与第一杂原子取代的脂族化合物上的碳原子共价键合。代表性的杂原子包括氧、氮和硫原子。当杂原子是氧是特别适合的。此外，重组调节剂可以是支链的或非支链的，其中支链变体包含沿如上所定义的“主链”的取代基。所述取代基可以是例如甲基、乙基、丙基和/或丁基。非支链是优选的。重组调节剂可以是不同程度的饱和的，可例如包含C₈烷基、C₉烷基、C₁₀烷基、C₁₁烷基、C₁₂烷基、C₁₃烷基、C₁₄烷基、C₁₅烷基或C₁₆烷基部分；或C₈烯基、C₉烯基、C₁₀烯基、C₁₁烯基、C₁₂烯基、C₁₃烯基、C₁₄烯基、C₁₅烯基或C₁₆烯基部分；或C₈炔基、C₉炔基、C₁₀炔基、C₁₁炔基、C₁₂炔基、C₁₃炔基、C₁₄炔基、C₁₅炔基或C₁₆炔基部分。此外，重组调节剂可包含碳碳单键、碳碳双键和碳碳三键的任意混合。特别合适的重组调节剂是饱和的，即包含C₈烷基、C₉烷基、C₁₀烷基、C₁₁烷基、C₁₂烷基、C₁₃烷基、C₁₄烷基、C₁₅或C₁₆烷基。特别合适的重组调节剂包括C₁₂烷基。此外，杂原子可以是各种氧化态的。例如，当杂原子是氧时，所述氧可以是醇、醛或羧酸形式的氧。特别合适作为重组调节剂的非支链烷醇分子，尤其是非支链1-烷醇。其中，特别合适的是C₁₂烷醇，特别是具有式HO-(CH₂)₁₁-CH₃的1-十二烷醇。

在进一步的实施方案中，调节剂系统可包括除所述包含8-16个原子的第一杂原子取代的脂族化合物之外的组分。例如，调节剂系统可额外地包含第二杂原子取代的脂族化合物，例如作为破裂调节剂、置换调节剂和/或重组调节剂，其中所述第二杂原子取代的脂族化合物的主链包含8-16个碳原子。第二杂原子取代的脂族化合物的“主链”如上文对第一杂原子取代的脂族化合物所定义。特别地，所述第二杂原子取代的脂族化合物的主链包含8、9、10、11、12、13、14、15或16个碳原子。所述包含8-16个碳原子的第一杂原子取代的脂族化合物与包含8-16个碳原子的第二杂原子取代的脂族化合物不同。在优选的实施方案中，可以是调节剂一部分的第二杂原子取代的脂族化合物是氧取代的脂族化合物。在某些优选的实施方案中，该氧取代的脂族化合物是脂族硫酸盐，其中特别优选的脂族硫酸盐是十二烷基硫酸钠(SDS)。因此，在本发明特别优选的实施方案中，调节剂系统包含是1-十二烷醇的第一杂原子取代的脂族化合物(例如作为破裂和/或重组调节剂)，和是SDS的第二杂原子取代的脂族化合物(作为进一步的破裂调节剂和/或置换调节剂)。

在进一步的实施方案中，如上所述的调节剂系统可进一步包含能结合清洁剂以破坏由所述清洁剂形成的胶束的蛋白。通常，清洁剂结合物将是内毒素掩蔽物(当所述内毒素掩蔽物是或包含清洁剂时)，能结合清洁剂的蛋白结合清洁剂的原理与上文所述原理相似，根据该原理作为内毒素掩蔽物的蛋白将部分内毒素分子螯合于其表面内或表面上。在本实施方案中，当作为部分调节剂使用时，能够结合清洁剂的蛋白也使溶液中存在的一部分或多部分清洁剂分子包含于该蛋白具有空间和静电亲和性的表面，其足以结合或螯合清洁剂分子，从而使它们不可用于胶束形成，从而破坏任何可包含内毒素的清洁剂胶束，或其可使平衡远离内毒素的聚集形式移动。

发明人已发现白蛋白分子对于结合清洁剂异常地好。因此，预期除仅有第一杂原子取代的脂族化合物外，或除第一杂原子取代的脂族化合物和第二杂原子取代的脂族化合物外，调节剂可额外地包含能结合清洁剂以破坏由所述清洁剂形成的胶束的蛋白(吸附调节剂)。在某些实施方案中，调节剂的蛋白组分可以是白蛋白，优选人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)或卵白蛋白(OVA)。

还预期的是，调节剂可含有一种或多种包含8-16个碳原子的第一杂原子取代的脂族化合物、所述包含8-16个碳原子的杂原子取代的脂族化合物和所述能结合清洁剂以破坏由所述清洁剂形成的胶束的蛋白。在本发明优选的实施方案中，调节剂仅包括1-十二烷醇。在本发明进一步优选的实施方案中，调节剂包括1-十二烷醇和SDS。在本发明进一步优选的实施方案中，调节剂包括1-十二烷醇、SDS和HSA。在本发明进一步优选的实施方案中，调节剂包含1-十二烷醇、SDS和BSA。

组合物

如本文所使用的，术语“组合物”指包含(至少一种)内毒素掩蔽物的混合物。内毒素，即使存在并掩蔽的，在组合物中仍是无法检测的。组合物优选是药物组合物，例如包含活性药物成分或API的组合物。术语“组合物”可以是例如提取物；疫苗；任何适用于肠胃外给药的组合物，即parentalia；任何适用于腹膜内、经皮、皮下或局部给药的组合物；血产品；细胞治疗溶液，例如完整的活细胞，例如能抗癌细胞的T细胞；基因治疗溶液，例如能将核酸聚合物递送至患者的细胞作为药物以治疗疾病的溶液；植入或医疗装置；或由清洗或擦拭物体的表面所产生的组合物，所述物体例如是医疗装置、植入机或装填机。

检测方法

如本发明所使用的，术语“检测方法”指适用于检测溶液中内毒素的方法。例如，基于此合适的方法是基于鲎的检测方法，或酶联免疫吸附试验(ELISA)。所述鲎方法通常可通过使用天然来源的细胞溶解物(J.Jorgensen,R.Smith,Perparation,Sensitivity,andSpecificity of Limulus Lysate for Endotoxin Assay,Applied Microbiology,1973)或重组制备的因子C(J.L.Ding,B.Ho,A new era in pyrogen testing,Trends inBiotechnology,2001)进行。这些方法中最好的是酶联亲和吸附试验，其使用固相捕获内毒素，继而通过LAL试验中的蛋白，因子C的重组版检测所述内毒素。试剂盒是一种这样的亲和吸附试验(H.Grallert,S.Leopoldseder,M.Schuett,P.Kurze,B.Buchberger,a novel and reliable method for endotoxin detection,NatureMethods,2011)。例如由Michael Rieth编写的书籍《Pharmazeutische Mikrobiologie-Monitoring,Betriebshygiene》(2012年10月，Wiley-VCH，Weinheim，ISBN 978-3-527-33087-4)中描述了检测系统。

影响溶液中氢键稳定性的试剂

根据本发明另一个实施方案，以上解蔽内毒素的方法和/或检测内毒素的方法可进一步包括向所述组合物加入影响溶液中氢键稳定性的试剂的步骤。通常，如本文所使用的，影响溶液中氢键稳定性的试剂改变溶液条件，以破坏复合物的稳定性，所述复合物中内毒素的单个分子或多个分子是溶解的，从而是掩蔽的。

不是所有的内毒素和内毒素掩蔽物间的复合物都是相同的。尤其是在某些掩蔽复合物中控制内毒素稳定性的最低能量不同于其他掩蔽复合物中控制内毒素稳定性的那些。其他条件一样时，控制给定的与内毒素掩蔽物的复合物中内毒素稳定性的能量越低，其越复杂，即调节剂必须更严苛以将内毒素从其溶解态释放。正如上文所述，这样的释放在将可能聚集的内毒素转化为可检测的，即解蔽形式的内毒素中是重要的步骤。因此，内毒素和内毒素掩蔽物间的复合物越稳定，最终解蔽所述内毒素的措施越严苛。

在内毒素和内毒素掩蔽物间复合物特别稳定的情况下，加入单一或甚至多组分调节剂有时不足以破坏掩蔽复合物稳定性和释放所述内毒素。在这样的情况下通过调节溶液条件以破坏内毒素-内毒素掩蔽物复合物的稳定性，可能有助于从所述含有内毒素掩蔽物的复合物中释放所述内毒素。

如上所述，影响溶液中氢键稳定性的试剂可有助于该目的的实现。即使不是大多数，也是与内毒素掩蔽物形成复合物的内毒素的稳定性中的一部分通常来源于内毒素部分和所述内毒素掩蔽物间的非共价相互作用。这些相互作用可以是内毒素分子区域和内毒素掩蔽物分子上的区域之间的例如疏水、离子、氢键和/或范德华相互作用形式。由于这些内毒素-内毒素掩蔽物相互作用的强度受溶液中所环绕氢键网络的影响，因此影响溶液中氢键稳定性将反向调节这些相互作用的强度。加入影响溶液中氢键稳定性的试剂从而能有助于弱化内毒素和内毒素掩蔽物间的非共价键相互作用，本质上提高复合物的自由能，从而使其更易于被调节剂破坏，以释放内毒素，使其可检测。

除上文所讨论的减稳作用外，影响溶液中氢键稳定性的试剂还可具有进一步促进内毒素解蔽的作用。通过调节溶液中氢键稳定性，一旦内毒素部分从其和内毒素掩蔽物的复合物中释放，所述试剂可促进该内毒素部分的聚集。通常在内毒素溶解和聚集形式间存在平衡。影响溶液中氢键稳定性的试剂可帮助将该平衡移动至聚集的方向，从而使所述内毒素可检测。合适的物质是倾向于降低围绕护送的内毒素部分的溶液中氢键稳定性的那些，和/或倾向于增加溶液离子强度从而驱使重组调节剂-护送的内毒素部分为亲脂性聚集体的化合物。

应注意，不总是必须加入影响溶液中氢键稳定性的试剂。是否加入这样的试剂将取决于，例如和内毒素掩蔽物形成的复合物中的内毒素稳定性和/或一旦从内毒素掩蔽物中释放出来，溶解的、护送的和聚集形式的内毒素部分间的平衡位置。例如，在含有更高浓度盐的溶液中，可想到的是通过只加入破裂调节剂，内毒素和内毒素掩蔽物的复合物可能已是不稳定的足以被破坏，且从内毒素掩蔽物中释放之后存在于溶液中的内毒素部分将是足够不稳定的使得不需要任何其他帮助而形成聚集体。在这样的情况下，实现解蔽可能不需要影响溶液中氢键稳定性的试剂。

另一方面，可存在这样的情况，例如含有低浓度盐的溶液中，其中内毒素-内毒素掩蔽物复合物可以具有足够的稳定性，只使用破裂调节剂无法将其破坏并释放内毒素，或即使仅通过破裂调节剂释放了内毒素，溶解和聚集内毒素的平衡倾向于溶解形式，从而使检测所需要的聚集不存在。在这样的情况下，加入影响溶液中氢键稳定性的试剂可有助于影响复合物和/或聚集物的能量，从而使内毒素处于可检测的形式。

总之，可以说内毒素和内毒素掩蔽物间复合物的不稳定程度将取决于溶液中盐的量，基于此该复合物被减稳至直接正比于溶液中存在的盐量的程度。虽然作为一般规则，但也可参考霍夫迈斯特序列，根据该序列，盐的离液序列越高，将内毒素和内毒素掩蔽物间的复合物减稳至给定程度所需的这样的盐量将越低。仅作为说明性的实例，为了达到用100mMCaCl₂对内毒素和内毒素掩蔽物间复合物减稳可实现的近乎相同的程度，需要使用500mM的NaCl。在该实例中，CaCl₂的离液序列高于NaCl，所以达到相同程度的减稳需要更少的CaCl₂。

在本发明的某些实施方案中中，影响溶液中氢离子稳定性的试剂可以是离液剂、阳离子或其组合。在某些实施方案中，所述离液剂可选自由以下组成的组：脲、氯化胍、丁醇、乙醇、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇(例如1-丙醇或2-丙醇即异丙醇)和硫脲。在某些实施方案中，所述阳离子是二价阳离子，例如Ca²⁺、Mg²⁺、Sr²⁺和/或Zn²⁺。特别优选的二价阳离子是Ca²⁺。

在解蔽过程中，影响溶液中氢键稳定性的试剂，例如二价阳离子盐，例如CaCl₂，可在1-400mM的浓度范围内，优选10-200mM的浓度范围内，优选50-100mM的浓度范围内有利地使用。

在解蔽过程中，影响溶液中氢键稳定性的试剂，例如离液剂，例如氯化胍，可在1mM-1M的浓度范围内，优选25-200mM的浓度范围内，优选10-100mM的浓度范围内有利地使用。

***

不希望被任何理论所限制，而仅用于说明本申请发明人所认为的基于观察到的溶液中解蔽内毒素有益效果、从而使之前掩蔽的无法检测的内毒可检测的原理和可能的机理，下文描述了含有至少一种内毒素掩蔽物的给定组合物中内毒素和其它组分相互作用的几种机理。为了说明这些机理，请参考图1-6。

以含有单一组分调节剂解蔽由清洁剂掩蔽物掩蔽的内毒素，其中所述单一组分同时起破裂调节剂和重组调节剂的作用

图1描述了内毒素和清洁剂一起存在于溶液中的方案，其中所述清洁剂将所述内毒素以独立形式稳定在清洁剂胶束中。图1中的组(a)显示了单一内毒素部分，其通过脂质尾部被插入至这样的清洁剂胶束的脂质层中。构成所述清洁剂胶束脂质层的清洁剂分子被简化为组(a)中的开环。因为该单一内毒素部分是以独立形式稳定插入于胶束的脂质层中的，而不是以多聚的聚合形式插入，因此其逃避了使用可用检测方法(例如，Hyglos GmbH的试验)时被检测到。如果图1组(a)中显示的溶液是额外含有API的药物制剂，即使溶液中存在内毒素，其将显示不含内毒素，从而安全给药的。因此向患者施用这样的表面上无内毒素的制剂将不知不觉冒着对上述内毒素发生危险免疫和毒性类型响应的风险。

在图1组(a)和(b)间的平衡箭头之上，可见加入能将内毒素从内毒素和内毒素掩蔽物间的复合物中释放的破裂和重组调节剂。在图1所述的方案中，该“复合物”是通过其脂质部分被包埋于清洁剂胶束脂质层中的内毒素。本文所示的破裂和重组调节剂(作为单一组分调节剂使用，同时具有破裂和重组调节剂的功效的两亲性分子)展现出双重性能：破坏清洁剂胶束以释放插入的内毒素分子，以及一旦内毒素从其和内毒素掩蔽物的复合物中释放后稳定所述内毒素。图1组(b)的上部图解描述了后一种性质，其显示通过破裂和重组调节剂稳定的内毒素分子，使得一旦胶束被调节剂破坏，这些内毒素分子可经护送形式存在于所述胶束外。组(b)的下部清楚地表明破裂调节剂存在平衡，该平衡与释放的内毒素部分，和在胶束被破裂(和重组)调节剂破坏之前先构成清洁剂胶束脂质层的清洁剂相关。

如上文所述，在本发明的一个实施方案中，所述破裂和/或重组调节剂可以是1-十二烷醇，其具有极性醇部分，随后为12个碳原子的饱和烃尾部。因此，1-十二烷醇的空间和静电构型均与内毒素的脂质部分相似，1-十二烷醇从而可有效地与已从清洁剂胶束中释放的内毒素相互作用，从而稳定所述内毒素。

1-十二烷醇特别适于用作破裂和/或重组调节剂的另一个原因是1-十二烷醇虽然是两亲性的，但其也不形成胶束。因此，一旦图1组(a)中描述的清洁剂胶束被1-十二烷醇破坏，不重新形成可能通过将平衡移动远离其聚集形式而重新掩蔽内毒素的调节剂胶束。如图1组(b)中所示，调节剂自身不形成胶束的特征从而有助于内毒素在调节剂的帮助下在溶液中稳定。图1中描述的方案中，假设的主导溶液条件是组(b)中所示的内毒素的护送部分和组(c)中示出的聚集内毒素间的平衡已处于组(c)的聚集方向。基于内毒素聚集形式是有利的，所述内毒素已处于或主要处于可由已知方法(例如Hyglos GmbH的检测试剂盒)检测到的聚集形式。

然后总的来说，图1显示了从稳定插入至清洁剂胶束从而被其掩蔽的单独内毒素部分(溶解的)向单独内毒素部分已聚集以变为可检测的方案转换。之前已在组(a)中掩蔽的内毒素已在组(c)中解蔽，从而使能够确定先前认为不含内毒素的溶液实际含有该污染物。

以包含破裂和重组调节剂和吸附调节剂(蛋白)的双组份调节剂解蔽由清洁剂掩蔽物掩蔽的内毒素

图2中描绘的最初方案与图1中描述的方案十分类似：单一内毒素分子被插入至清洁剂胶束(用代表独立清洁剂分子的开环表示)，从而稳定地独立化，继而掩蔽使其避免被检测到。在组(a)和(b)之间，观察到加入包含同时起破裂和重组调节剂功效的非蛋白组分以及起吸附调节剂作用的蛋白组分的双组分调节剂系统。所述破裂和重组调节剂可如上文对图1所述，例如1-十二烷醇，其有助于破坏清洁剂胶束，并稳定/重组释放的内毒素，而不以自身形成胶束。吸附调节剂可以例如作为部分调节剂加入，以促进破坏比图1中所述的那些更稳定的清洁剂胶束，这些胶束仅用破裂调节剂无法有效实现预期破裂。

如上文所说明的，吸附调节剂可以是例如牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)等。这样的蛋白具有作为“分子海绵”的能力，其将之前形成胶束的清洁剂吸附于其表面上。当然，在采用这样的吸附调节剂的情况下，溶液中其他类清洁剂分子(例如破裂和重组调节剂)间会存在某种平衡。预期这将会产生组(b)中所示的平衡，其中破裂和重组调节剂以以下形式存在：结合至释放的内毒素(组(b)右部)，结合至之前组成清洁剂胶束的清洁剂，以及结合至吸附调节剂的表面，伴随来自于清洁剂胶束(现在破裂的)额外的清洁剂。

如组(c)所示，在图2所述方案中占主导的溶液条件下，已从掩蔽清洁剂胶束中释放的内毒素组合为可检测的聚集体。事实上，图2中所示的吸附调节剂的使用可以促进这样的聚集形成。这被认为是由于吸附调节剂将破裂和重组调节剂的分子结合至其表面，从而从溶液中移除这些内毒素稳定剂种类，使平衡被驱向右移动至组(c)中的聚集体。

然后总的来说，图2显示了从被包埋入清洁剂胶束中，且由于它们在这些胶束中的独立性，保持掩蔽的独立内毒素部分，向独立内毒素部分已被迫使聚集以成为可检测的方案转换。也就是，之前在组(a)中掩蔽的内毒素已在组(c)中解蔽，从而使得能够确定先前认为(组(a)中)不含内毒素的溶液实际含有该污染物(组(c))。

以多组分调节剂系统和影响溶液氢键稳定性的试剂组合解蔽由清洁剂掩蔽物掩蔽的内毒素

在图1和2描绘的方案中，溶液条件是仅使用调节剂系统就足以破坏掩蔽清洁剂胶束。从另一个方面看，图1和2中所示的掩蔽内毒素胶束均不够稳定以抵抗仅使用破裂调节剂的破坏。此外，图1和2中的条件还是这样的：内毒素溶解和聚集形式间的平衡倾向于聚集形式，因此该聚集形式的检测在所示溶液条件下是可能的，而不需要采取任何额外的措施。

基于图3所示方案的条件是不同的。此处，内毒素独立的分子被插入至清洁剂胶束的脂质层(也通过用开环表示单个清洁剂分子表示)中，但是否由于溶液条件、掩蔽清洁剂和内毒素或这些物质的组合物的相互作用的性质，插入至组(a)清洁剂胶束中的内毒素更稳定，从而相比于图1和2中的初始状态，图3中的内毒素更不耐受破裂调节剂的破坏。为了破坏清洁剂-内毒素复合物的稳定性，需要采取额外的措施，以便一旦减稳，调节剂系统可破坏胶束，并释放插入的内毒素。

为了该目的，图3中所示方案必须使用影响溶液中氢键稳定性的试剂，其由组(a)和(b)间平衡箭头上加的小方块表示，并在组(b)的胶束-内毒素复合物和它们的相互作用中体现。如上文所述，一种作为影响溶液中氢键稳定性的物质是二价钙。

当清洁剂掩蔽物和掩蔽的内毒素间的复合物这样被减稳后，加入包含吸附调节剂和置换调节剂的调节剂系统(见组(b)和(c)间平衡箭头上方)，以将内毒素从已减稳的掩蔽清洁剂胶束中置换。如上文所述，置换调节剂可以是十二烷基硫酸钠(SDS)，其自身是清洁剂。所述调节剂系统含有其本身是清洁剂的组分，且该清洁剂可以自身形成新胶束的可能性通过虚线环示出于图3的组(c)中，所述内毒素被插入其中。然而，在图3主导的条件下，任何由置换调节剂形成的胶束都不如由组(a)中示出的掩蔽清洁剂形成的胶束那样稳定。这至少部分因为吸附调节剂，例如图3中示出的BSA，也将置换调节剂结合至其表面，在置换调节剂的蛋白-结合群和胶束-形成群间建立平衡，其有效破坏由置换调节剂形成的任何胶束的稳定性。

破裂和重组调节剂的存在，例如非-胶束-形成的两亲性物质，例如1-十二烷醇，示出于图3组(c)和(d)间平衡箭头之上。图3图解示出的剩余物与上文图1和2情况下已详细讨论的相类似。简要地说，图3组(c)和(d)间示出的破裂和重组调节剂释放和溶解暂时插入至由置换调节剂形成的胶束中的内毒素，同时在溶解(无法检测的)和聚集(可检测的)内毒素种类间建立平衡。该平衡可通过影响溶液中氢键稳定性的试剂(例如阳离子盐，优选二价阳离子和/或离液试剂)向右(向聚集形式)移动。

总之，图3示出了和清洁剂掩蔽物的胶束形成的稳定复合物中掩蔽的内毒素分子的释放。其使用影响溶液中氢键稳定性的试剂破坏该复合物稳定性，并使用一种多组分调节剂，所述多组分调节剂整体破坏该复合物，并护送释放的内毒素通过一系列最终聚集的并因此可检测内毒素复合物的方向的能量最低点。

以包含置换调节剂及破裂和重组调节剂的双组分调节剂解蔽由蛋白掩蔽物掩蔽的内毒素

图4是内毒素由溶液中蛋白掩蔽的方案的图解描述。其示出于图4的组(a)中。在图4描述的方案中，例如是药物组合物中API的蛋白，具有结合槽，其在空间上和静电上均适于稳定地结合内毒素。以此种方式，蛋白掩蔽物结合内毒素分子，使它们不可检测。由图4的组(a)和(b)间平衡箭头上的置换调节剂表示的调节剂组分的加入，将内毒素从其蛋白掩蔽物上的结合位点置换。该置换调节剂可以是例如如上所述的“包含8-16个碳原子的第二杂原子取代的脂族化合物”。在置换调节剂可能是例如十二烷基硫酸钠的情况下，该置换调节剂可结合至掩蔽蛋白的表面，将内毒素从其在所述蛋白结合槽内的稳定结合位点置换。这示出于图4组(b)的左边。此外，在组(b)右边由虚线环表示的置换调节剂组分还可以其自身形成暂时的胶束，本质上护送从以稳定插入所述胶束脂质层的蛋白掩蔽物中释放的内毒素。图4组(b)中示出的平衡的确切位置取决于置换调节剂结合至所述掩蔽蛋白表面的有效性(组(b)左边)，以及形成的胶束的稳定性(组(b)右边)。

不考虑该平衡的确切位置，重要的事情是图4组(a)和(b)间平衡箭头上描绘的置换调节剂倾向于将内毒素从其在掩蔽蛋白内或蛋白上的能量稳定位置释放。

一旦该内毒素从其在掩蔽蛋白内或蛋白上的掩蔽态释放，图4组(b)和(c)间平衡箭头上描绘的调节剂组分(破裂和重组调节剂)将移动溶液中占主导的能量关系，以使内毒素的最稳定态是游离的溶解形式，并在溶液中由破裂和重组调节剂护送。该破裂和重组调节剂可以是例如如上所述的“包含8-16个碳原子的第一杂原子取代的脂族化合物”，例如1-十二烷醇。如上文所讨论的，该破裂和重组调节剂通常将具有破坏存在的胶束(例如组(b)右边示出的，由置换调节剂形成的)，而自身不形成胶束的性质。在置换调节剂任何在先的胶束从而被破坏及破裂和重组调节剂无法以其自身形成相应胶束的情况下，内毒素能量最稳定的形式成为图4组(c)中示出的溶解的、由破裂和置换调节剂护送的形式。

图4剩余的部分如先前在图1和3中对最终平衡步骤所讨论的所述。简单而言，在单独的溶解的内毒素(组(c))和聚集的内毒素(组(d))间存在平衡。到聚集的内毒素的任何可观察群作为该平衡一部分存在的程度时，先前无法检测的稳定结合至掩蔽蛋白内或蛋白上的内毒素变得可检测。总之，先前通过蛋白掩蔽为单个形式的内毒素已通过调节溶液条件被解蔽并可检测，使内毒素可处于的最优能量态变为其可检测的聚集形式。而后，如上文对之前图片所讨论的，“解蔽”是调控溶液条件，以将平衡从内毒素处于稳定单个形式(掩蔽)的状态向内毒素为聚集的和可检测的(解蔽的)状态移动的结果。

使用包含吸附调节剂(蛋白)、置换调节剂和破裂/重组调节剂的多组分调节剂联合影响氢键稳定性的试剂解蔽由蛋白掩蔽的内毒素。

图5中所示的初始方案与图4中所示的对应：内毒素稳定结合至组合物中存在的蛋白内或蛋白上。该组合物中的蛋白(例如可为API)从而起到“内毒素掩蔽物”的作用。如已在图3所描绘方案中讨论，图5组(a)中，内毒素与内毒素掩蔽物如此稳定地复合，导致简单加入调节剂无法单独释放所述内毒素。在图3中，如上文所述，内毒素掩蔽物是形成胶束的清洁剂，内毒素的单个分子非常稳定地插入所述胶束中。现在在图5中，内毒素掩蔽物是具有可以稳定结合内毒素的结合位点的蛋白。但是原理仍然是相同的：无论插入至清洁剂胶束的脂质层(图3)还是稳定地处于蛋白内或蛋白上，内毒素都被稳定至简单加入调节剂是无法克服的，从而溶解的内毒素仍是不可检测的程度。

如上文对图3所说明的，该内毒素和内毒素掩蔽物间的稳定复合物可通过加入影响溶液中氢键稳定性的试剂(例如盐或离液剂，例如二价钙)减稳。图5中通过始于组(a)和(b)间平衡箭头的小方块，表示了该影响氢键稳定性的试剂。该试剂破坏被认为存在于内毒素和蛋白质稳定物间的氢键网络，从而提升所述复合物的自由能至以下程度：组(b)和组(c)间平衡箭头上所示的调节剂组分可破坏复合物，至使内毒素从掩蔽蛋白中被强行去除的程度。

之后，认为使用如图5所示的包含吸附调节剂(蛋白)和置换调节剂的调节剂系统产生组(c)中所示的平衡状态。在组(c)的左侧是掩蔽蛋白，现已被剥去先前结合的内毒素。影响溶液中氢键稳定性的试剂以及置换调节剂(例如SDS)的分子，显示结合至蛋白掩蔽物的表面，包括内毒素先前结合的结合位点。该描述意在表示以下事实：置换调节剂有效地将内毒素从其在掩蔽蛋白内或蛋白中的稳定位置置换。图5组(c)中部示出了可通过置换调节剂(例如SDS)形成的胶束，其中内毒素分子被暂时地插入至所述胶束的脂质层中。还显示影响溶液中氢键稳定性的试剂的分子结合至内毒素和胶束，并起到进一步破坏该胶束稳定性的作用，以确保所述胶束实际上维持暂时的状态，并不存在能量结合最低的内毒素，额外的破裂调节剂无法强行去除所述内毒素。最后，组(c)的右边显示了作为如上简述的“分子海绵”的吸附调节剂(蛋白)，其将影响溶液中氢键稳定性的试剂以及置换调节剂吸附至其表面。这有效除去溶液中的这些物质，将组(c)中部所述的暂时的胶束减稳至置换调节剂被去除的程度，同时将其稳定至所述影响溶液中氢键稳定性的试剂被去除的程度。然而通常地，影响溶液中氢键稳定性的试剂的量对于破坏掩蔽蛋白和内毒素间初始复合物的稳定性是足够高的，因为尽管移除了吸附调节剂，这些足够多的试剂仍将留存于溶液中，使得组(c)中所示的暂时的胶束将被如期去稳。

而后使用破裂和重组调节剂，例如图5组(c)和(d)间平衡箭头上示出的(如1-十二烷醇)，将破坏组(c)中示出的临时胶束，以释放插入的内毒素分子。如上文所讨论的，这样的溶解内毒素(组(d))而后将和如上所述的可被检测的重组的和聚集的形式的内毒素(组(e))产生平衡关系。

以包含吸附调节剂(蛋白)、置换调节剂和破裂/重组调节剂的多组分调节剂联合影响溶液中氢键稳定性的试剂解蔽通过蛋白和清洁掩蔽物掩蔽的内毒素

许多蛋白API，例如抗体、抗体片段、激素、酶、融合蛋白或蛋白缀合物，被以高浓度配制和销售，其中在溶液中必须包含清洁剂，以避免不希望的蛋白聚集。图6中所述的初始方案从而表示了药物制剂领域中最相关情况中的一种，这是因为存在清洁剂和蛋白(例如API蛋白)掩蔽物。显示内毒素分子被插入至清洁剂胶束的脂质层中(还是通过表示单个清洁剂分子的开环来表示)，以及结合至掩蔽蛋白内或掩蔽蛋白上。实际上，这两种物质似乎存在平衡，其中由各复合物的相对稳定性来决定该平衡的相对位置朝向内毒素胶束-还是蛋白-结合物质。所有其他条件一样时，更低自由能从而使更稳定的复合物通常将占主导。

图6的讨论与上文图5的相类似，区别仅在于图6组(b)示出了相互平衡的内毒素蛋白-和胶束-结合物质，其分别由影响溶液中氢键稳定性的试剂减稳。使用吸附调节剂和置换调节剂，产生图6组(c)中描绘的平衡情况。上文对于图5组(c)的讨论可相应地应用于此。使用能破坏组(c)的临时胶束而自身不形成胶束的额外的破裂和重组调节剂(示出于组(c)和(d)间的平衡箭头之上)使内毒素从其在置换调节剂胶束的临时结合态中游离出来(组(c)中间部分)，并使如上所述的内毒素的溶解(不可检测的)和聚集(可检测)形式间存在平衡关系。如对之前图所说明的，组(d)中示出的破裂和重组调节剂在结合至释放的内毒素的状态(组(d)的上部)和先前构成示出于组(a)中清洁剂胶束的清洁剂(组(d)的下部)间存在平衡。

***

应注意的是，上述方案意在说明本申请发明人所相信的基于本发明在不同情况下产生的有利解蔽效果的基础的原理。从说明性的图1-6中，将清楚的是所讨论的过程全部是平衡过程，因此调节剂系统的不同组分，或(如果使用的)影响溶液中氢键稳定性的试剂的加入顺序不存在前提条件。从而只要溶液中一同存在这些组分，所示的平衡将自动建立。上文讨论中表示的和图2-6中示出的这些组分的加入“顺序”从而仅用于说明本申请发明人认为是基于本发明有利技术效果的基础的机理。因此，解蔽之前掩蔽的内毒素可按图2-6在分开的时间点加入组分而完成，然而当一次性加入所有图2-6中所描绘的组分时，也可实现期望的解蔽效果。

在最普遍的情况下，上图1-6中描绘的方案和相应的讨论应说明以下一般原则，其意在作为本领域普通技术人员实施本发明时的一般性指导原则。许多通过常规方法检测内毒素为阴性的溶液试剂含有掩蔽形式的内毒素。常规方法检测处于其聚集形式的内毒素，所以实际上许多检测内毒素为阴性的存在的溶液，例如药物制剂，并不必然地表示这些溶液不含有内毒素，而是它们不含有可检测形式的内毒素。

以它们最常规的形式，本发明的方法使得能够解蔽内毒素，例如通过破坏内毒素和内毒素掩蔽物间的复合物的稳定性，以释放和最终聚集单个内毒素分子，从而使先前无法检测的内毒素可检测。直接使用破裂和重组调节剂破坏这样的掩蔽复合物，可确保内毒素从其和内毒素掩蔽物的掩蔽复合物中释放，或者对于特别稳定的复合物，它们可被减稳，然后被这样的调节剂或多组分调节剂系统破坏。然而结合的内毒素被释放，净效应是内毒素从稳定的结合形式向可继而形成聚集体的临时的溶解形式转化。而后最广义地说，本发明方法必须调节如上文所述的溶液条件，以引导先前掩蔽的内毒素通过一系列平衡，其中最终转化致使内毒素聚集为可检测的形式。

由于根据本发明所述的方法进行的内毒素的解蔽和/或检测取决于处于溶解(不可检测)形式的释放内毒素最终重组为聚集形式(可检测)，通常将需要重组调节剂。该重组调节剂(例如1-十二烷醇)通常将具有不以其自身形成胶束的特征，同时稳定单个内毒素分子，以使其处于和内毒素聚集形式的平衡。如从上文可清楚地知道，重组调节剂有时，但不是必需的，将起到破裂调节剂的作用，其能破坏内毒素和掩蔽清洁剂胶束间的初始复合物，和/或内毒素和置换调节剂的临时胶束间的复合物。

提供以下包括进行的实验和达到的结果的实施例，仅用于说明性目的，而并非解释为对本发明的限制。

实施例

简介

内毒素掩蔽是药物组合物、特别是生物药物产品中的常见现象。内毒素的掩蔽由多种因素驱动，最终导致药物产品中内毒素的不可检测性或至少下降的可检测性。

在一种方案中，掩蔽不是由活性药物成分(API)(例如蛋白)本身导致的，而是由制剂成分导致的。这样的成分是加入的以防止蛋白聚集的清洁剂和加入的以调节产品pH的缓冲物质例如柠檬酸盐、磷酸盐、三甲醇氨基甲烷(Tris)、乙酸盐、组氨酸和甘氨酸。

并不惊讶地，掩蔽的动力学受温度的影响，高温下掩蔽进行的快于低温。除非另有说明，以下描述的所有实验均在室温下进行。该温度是活性药物成分(API)的生产工艺步骤经常进行的温度，因此是用于评估本发明所述方法工业生产实用性的最相关温度。

实施例1：仅使用破裂和重组调节剂(1-十二烷醇)，以及和额外的吸附调节剂 (BSA)一起，从聚山梨醇酯20/柠檬酸盐掩蔽系统中解蔽内毒素

第一个实验中选择聚山梨醇酯20/柠檬酸盐掩蔽系统，因为生物药物制剂中常常含有柠檬酸盐和聚山梨醇酯20。这些实验意在确定通过加入如上文所述的破裂和重组调节剂，掩蔽的内毒素可否从其清洁剂掩蔽物的复合物中释放。

材料和方法

按如下进行内毒素掩蔽。在不含内毒素的玻璃试管中制备含有0.05％(w/v)聚山梨醇酯20的10mM柠檬酸盐(pH 7.5)的1ml等分水溶液。随后，加入10μl 10,000EU/ml的LPS储备液(LPS 055B5，Sigma L2637-5MG)，将所得溶液涡旋1min，在室温下放置至少24小时。作为含有非掩蔽LPS的阳性LPS对照，将10μl 10,000EU/ml的LPS储备液加入至1ml不含内毒素的水中，混合并同样地培养为掩蔽制剂，但不含聚山梨醇酯20。下文中更详细地描述了LPS-水阳性对照。

按如下进行内毒素解蔽。加入溶解于100％乙醇中的1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)和溶解于不含内毒素的水中的100mg/ml BSA(吸附调节剂)中每一种的100μl储备液。在此使用1-十二烷醇和BSA作为双组分调节剂系统的两个组分。除使用单组分调节剂外，使用与上文相同的方法进行独立的解蔽实验。该实验中的单一调节剂仅为1-十二烷醇，即不含BSA。1-十二烷醇储备液的浓度为400、200、100、50、25、12.5和6.25mM。对于解蔽，相继加入BSA和1-十二烷醇的解蔽储备液，并在每次加入后通过涡旋混合2min。混合后，将样品在室温下不混合培养30min。

根据试剂盒说明，使用(Hyglos GmbH)分析内毒素含量。将样品在无内毒素的水中稀释为1:10和1:100。

内毒素回收率计算为不含任何掩蔽组分、仅含有水和LPS的单独LPS-水对照的百分比。不存在任何内毒素掩蔽物时，该LPS-水对照中不应有任何LPS被掩蔽，即该LPS-水对照中存在的所有LPS都应该是可检测的。通过这种方式，LPS-水对照作为标准物用于定性和定量地确定所采用的检测试剂盒对于检测LPS(定性对照)是否正常工作，以及实际上是否检测到对照中所有已知存在的LPS(定量对照)。

结果

图7和表1(下文)的回收率数据显示通过加入浓度为20-2.5mM的BSA和/或1-十二烷醇，可以回收超过100％程度的掩蔽的内毒素。不存在BSA时，10-2.5mM范围内的1-十二烷醇无法实现100％回收率，但起码也超过50％，在5mM 1-十二烷醇时具有大约90％的最大回收率。

在该实施例和以下实施例中，超过100％的LPS回收率应根据以下观点解释：已发现LPS的活性取决于LPS形式(例如聚集的程度和方向)以及LPS的结构(该结构随不同的细菌种类轻微变化)。本发明所述的解蔽方法具有同时改变LPS聚集的形式和方向的潜力(实际上，正是由于由调节剂，特别是重组调节剂促进的这样的改变，LPS才可能被解蔽)。LPS-水对照(未解蔽)和解蔽的样品间LPS聚集形式和方向的改变在一些情况中可能导致解蔽后检测的活性超出阳性LPS-水对照中所测量到的。这并不意味着进行本发明所述的解蔽方法产生先前不存在的新LPS，而是在一些情况中，进行本发明所述的解蔽方法改变已存在的LPS的形式，从而使给定量的LPS的表观测量活性增大。

表1

1-十二烷醇(mM)	BSA(mg/ml)	％LPS回收率
			40	--	28
20	--	46
			10	--	60
5	--	89
			2.5	--	65
1.25	--	31
			0.625	--	7
40	10	70
			20	10	157
10	10	186
			5	10	170
2.5	10	134
			1.25	10	71
0.625	10	0

结果清楚地证明可通过仅加入调节剂1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)解蔽掩蔽的内毒素。所述结果进一步显示该解蔽作用可通过加入额外的吸附调节剂(BSA)增强。在后一种情况下，其中加入1-十二烷醇和BSA作为双组分调节剂，BSA有助于吸附清洁剂，从而破坏掩蔽内毒素的清洁剂胶束，调节剂1-十二烷醇能够破坏清洁剂胶束(其作为破裂调节剂时)，并重组释放的内毒素为聚集结构(其作为重组调节剂时)。在聚山梨醇酯20的情况下，不存在BSA时，接近定量的回收是可能的(5mM 1-十二烷醇时为89％)。这可能是由于1-十二烷醇和LPS-掩蔽清洁剂聚山梨醇酯20的烷基链长度相似。加入BSA增强了解蔽，这被假定为将LPS平衡从溶解形式向聚集形式移动(见，如图2)。

实施例2：使用具有不同烷基链长度的醇作为破裂和重组调节剂，从聚山梨醇酯 20/柠檬酸盐掩蔽系统中解蔽内毒素

该实验研究了作为破裂和重组调节剂的多种烷基醇的使用。该实施例中所述实验的一个目标在于研究醇中烷基链长度和解蔽效果间的关系。为了实现该目的，通过加入不同浓度的碳原子链长度为C8-C18的醇进行解蔽。

材料和方法

如实施例1中所述进行内毒素掩蔽。通过加入不同烷基链长度(C8、C10、C12、C14、C16、C18)的非支链1-醇储备液作为调节剂(破裂和重组调节剂)(如本发明实施例1中为(具有12-碳烷基链的)1-十二烷醇)进行掩蔽。将每种储备液溶解于100％乙醇中。相比于上文实施例1中所述的某些实验，本解蔽实验中未包括其它调节剂组分，例如BSA。使用试剂盒(Hyglos GmbH)进行内毒素浓度分析，随后内毒素回收率的计算被表示为LPS-水对照样品中LPS的百分比。上文实施例1中详细说明了LPS-水阳性对照。

结果

表2(下文)显示了依赖于醇浓度和醇中烷基链长度的解蔽的内毒素的百分比。

表2

nd＝无数据

使用1-十二烷醇和1-十四烷醇实现了超过40％的内毒素的回收，即解蔽内毒素。使用烷基链长度低于或高于C12和C14的醇的回收率低于10％。

上述结果表明作为破裂和重组调节剂使用的醇的烷基链长度理论上应尽可能地与内毒素中酰基链的烷基链长度匹配。在本情况中，LPS脂质A组分中酰基链的长度为C12和C14，正是使用具有那个范围内的烷基链长度的1-醇作为破裂和重组调节剂时，才最有效地解蔽内毒素。

实施例3：仅使用1-十二烷醇作为破裂和重组调节剂，以及和吸附调节剂BSA一起，从多种非离子表面活性剂掩蔽系统中解蔽内毒素

为了研究仅通过1-十二烷醇从聚山梨醇酯20中解蔽内毒素是通过相等或相似烷基链长度的掩蔽表面活性剂和1-十二烷醇促进的假说，使用不同链长度和不同结构的掩蔽清洁剂设计了多种实验，然后使用固定烷基链长度(具有C₁₂烷基链的1-十二烷醇)的破裂和重组调节剂解蔽。为了实现该目的，以聚山梨醇酯80和Triton X-100制备掩蔽的样品，而后以使用不同的1-十二烷醇浓度的1-十二烷醇或BSA/1-十二烷醇将所述样品解蔽。

材料和方法

按如下进行内毒素掩蔽：在不含内毒素的玻璃试管中制备含有0.05％聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或Triton X-100的10mM柠檬酸盐(pH 7.5)的1ml等分水溶液。随后，加入10μl 10,000EU/ml的LPS储备液(LPS 055B5，Sigma L2637-5MG)，将所得溶液涡旋1min，在室温下放置至少24小时。作为阳性LPS对照，将10μl 10,000EU/ml的LPS储备液加入至1ml不含内毒素的水中，混合并同样地培养为掩蔽制剂。上文实施例1中详细地讨论了阳性LPS-水对照。

通过加入如实施例1中所述的不同浓度的(作为破裂和重组调节剂的)1-十二烷醇储备液进行解蔽。将每种醇的储备液溶解于100％乙醇中。如实施例1中所述的，在不存在或存在10mg/ml BSA时进行解蔽。

用试剂盒(Hyglos GmbH)进行内毒素浓度分析，随后计算表示为LPS/水对照样品中内毒素百分比的内毒素回收率。

结果

表3(下文)显示了分别从不存在或存在BSA(吸附调节剂)的取决于1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)浓度的聚山梨醇酯20/柠檬酸盐、聚山梨醇酯80/柠檬酸盐和Triton X-100柠檬酸盐掩蔽系统中解蔽后的LPS回收率。

表3

nd＝无数据

在2.5nM的1-十二烷醇为最佳浓度下，以1-十二烷醇从聚山梨醇酯80/柠檬酸盐掩蔽系统中解蔽产生大约30％的回收率。存在BSA时，回收可高至90％。无论1-十二烷醇的浓度如何，从Triton X-100掩蔽系统中解蔽的方法均(即存在或不存在BSA)导致低于20％的回收率。

因此，仅使用(作为破裂和重组调节剂的)1-十二烷醇解蔽足以从掩蔽系统例如聚山梨醇酯20掩蔽系统中解蔽LPS。加入吸附掩蔽清洁剂的(作为吸附调节剂的)BSA提高聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80掩蔽系统中的解蔽回收率。甚至当和1-十二烷醇一起加入BSA时，从Triton X-100体系中解蔽也不高效。加入额外的调节剂组分例如(作为置换调节剂的)SDS可帮助改善LPS从Triton-X-100掩蔽制剂中的回收率。

实施例4：通过加入调节剂和影响氢键稳定性的离液剂增强解蔽功效

使用BSA(吸附调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的双调节剂系统从Triton X-100掩蔽系统中的差的LPS回收率可能源于由Triton X-100和LPS形成的复合物的高稳定性。该高稳定性可能阻碍期望的通过1-十二烷醇的破坏作用和通过BSA吸附清洁剂的对Triton X-100的内毒素-掩蔽胶束的破坏。

由于这个原因，本实验研究了通过加入离液盐和多组分调剂剂破坏掩蔽复合物稳定性的可能。希望的是通过破坏稳定清洁剂胶束的稳定性，从而使用(作为破裂和重组调节剂的)1-十二烷醇、(作为吸附调节剂的)BSA和(作为置换调节剂的)SDS的多组分调节剂系统破坏该胶束将成为可能。

材料和方法

按如下进行内毒素掩蔽：在不含内毒素的玻璃试管中制备含有0.05％Triton X-100的10mM柠檬酸盐(pH 7.5)的1ml等分水溶液。随后，加入10μl 10,000EU/ml的LPS储备液(LPS 055B5，Sigma L2637-5MG)，将所得溶液涡旋1min，在室温下放置至少24小时。作为阳性LPS对照，将10μl 10,000EU/ml的LPS储备液加入至1ml不含内毒素的水中，混合并以同样方式培养为掩蔽制剂。上文实施例1中详细地讨论了阳性LPS-水对照。

按如下进行内毒素解蔽：将100μl以下储备溶液作为单一组分或作为组合物加入至1ml掩蔽的样品中：1M CaCl₂(溶于水中)、100mg/ml BSA(溶于水中)、1％SDS(溶于水中)和50mM 1-十二烷醇(溶剂于100％乙醇中)。在加入组合物的情况下，依次加入所述试剂，每次加入间进行2分钟的涡旋步骤。然后不震荡下将样品在室温培养30分钟。

根据试剂盒说明，使用试剂盒(Hyglos GmbH)分析内毒素含量。将样品在无内毒素的水中稀释为1:10和1:100。内毒素回收率计算和表示为LPS-水对照的回收百分比。上文实施例1中详细地讨论了阳性LPS-水对照。

结果

图8示出了取决于加入CaCl₂(C)、BSA(B；吸附调节剂)、SDS(S；置换调节剂)和1-十二烷醇(D；破裂和重组调节剂)的组合的LPS回收百分比。1-十二烷醇作为唯一(破裂和重组)调节剂无法有效地将LPS从Triton X-100掩蔽复合物中解蔽。加入BSA(吸附调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)作为双组分调节剂系统产生大约20％的回收。进一步加入离液盐(例如CaCl₂)或额外的调节剂(例如SDS(置换调节剂))不产生超过20％的LPS回收。然而，加入CaCl₂、BSA(吸附调节剂)、SDS(置换调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)产生大于100％的LPS回收。

因此，除BSA(吸附调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)外，离液盐和额外的置换调节剂(例如清洁剂SDS)有助于破坏Triton X-100掩蔽复合物。以该种方式，这四种添加剂的组合似乎使掩蔽复合物分解，以形成可检测的LPS。

实施例5：来自多种掩蔽系统的不同解蔽方法的比较

由于观察到使用CaCl₂、BSA、SDS和1-十二烷醇的组合有效地从Triton X-100掩蔽系统解蔽，这个始于聚山梨醇酯掩蔽系统的方法的解蔽效率仍是问题。为了回答该问题，将内毒素在聚山梨醇酯20、80和Triton X-100/柠檬酸盐掩蔽系统中掩蔽，而后仅使用1-十二烷醇解蔽，组合使用BSA和1-十二烷醇或组合使用CaCl₂、BSA、SDS和1-十二烷醇解蔽。在这些试验中，使用1-十二烷醇作为破裂和重组调节剂，使用BSA作为吸附调节剂，使用SDS作为置换调节剂，使用CaCl₂作为影响溶液中氢键稳定性的试剂。

材料和方法

按如下进行内毒素掩蔽：在不含内毒素的玻璃试管中制备含有0.05％聚山梨醇酯20或0.05％聚山梨醇酯80或0.05％Triton X-100的10mM柠檬酸盐(pH 7.5)的1ml等分水溶液。随后，加入10μl 10,000EU/ml的LPS储备液(LPS 055B5，Sigma L2637-5MG)，将所得溶液涡旋1min，在室温下放置至少24小时。作为阳性LPS对照，将10μl 10,000EU/ml的LPS储备液加入至1ml不含内毒素的水中，混合并同样地培养为掩蔽制剂。上文实施例1中描述了阳性LPS-水对照的作用。

按如下进行内毒素解蔽：向含有掩蔽的LPS的溶液中加入100μl 50mM的1-十二烷醇储备液，或100μl 100mg/ml的BSA和100μl 500mM的1-十二烷醇储备液，或100μl 1MCaCl₂溶液、100ml 100mg/ml的BSA溶液、100μl 1％的SDS溶液和100μl 50mM的1-十二烷醇溶液。在加入组合物的情况下，按序加入试剂，并在每次加入间进行2分钟的涡旋步骤。然后不震荡下将样品在室温培养30分钟。

根据试剂盒说明，使用试剂盒(Hyglos GmbH)分析内毒素含量。将样品在无内毒素的水中稀释为1:10和1:100。内毒素回收率计算为LPS-水对照的回收百分比。

结果

表4(下文)和图9示出了为了从多种清洁剂掩蔽系统解蔽，仅使用1-十二烷醇，组合使用BSA和1-十二烷醇，或组合使用CaCl₂、BSA、SDS和1-十二烷醇(CBSD)的LPS回收百分比。

表4

通过1-十二烷醇、BSA/1-十二烷醇和CaCl₂/BSA/SDS/1-十二烷醇实现从聚山梨醇酯20掩蔽系统中的有效(～80％)解蔽。在聚山梨醇酯80掩蔽系统的情况中，存在BSA/1-十二烷醇和CaCl₂/BSA/SDS/1-十二烷醇时实现良好的解蔽功效。在Triton X-100掩蔽系统的情况下，加入CaCl₂/BSA/SDS/1-十二烷醇产生良好的LPS回收。

因此，取决于掩蔽复合物的稳定性，可使用不同的解蔽方法实现有效的内毒素回收。然而，不管使用怎样的掩蔽系统，涉及CaCl₂、BSA、SDS和1-十二烷醇的组合的解蔽方法可能是最普遍的方法，这是由于其实现有效解蔽的能力。如上文所述实验中清楚表明的，在任何给定制剂中用于解蔽LPS的最佳组合物可通过常规实验简单地获得。

实施例6：从不同内毒素源中解蔽内毒素

以可商购的高纯大肠杆菌O55:B5的LPS制剂进行实施例1-5中的内毒素解蔽实验。由于仅是LPS的保守的脂质A部分对毒性负有责任以及在基于因子C的检测方法中被检测到，因此可假设上文所述的解蔽方法对于使用除源自大肠杆菌O55:B5外其他细菌的LPS制剂也将同样有效。然而，文献也描述了LPS脂质A部分酰基链长度以及侧链修饰的差异。甚至LPS的O-糖侧链的长度也可潜在影响解蔽方法。此外，不能排除纯化的LPS和天然存在的内毒素(NOE)在它们的解蔽行为上会有差异。为了解决该问题并排除解蔽方法对所用的大肠杆菌O55:B5的LPS是特异性的可能性，在不同清洁剂掩蔽系统中掩蔽了源自不同细菌、核-和O-糖链的长度不同和不同纯度的LPS，而后仅使用1-十二烷醇，或BSA/1-十二烷醇，或CaCl₂/BSA/SDS/1-十二烷醇进行解蔽。

材料和方法

按如下进行内毒素掩蔽：将不同类型和不同来源的LPS样品(大约50EU/mL)加入至含有0.05％聚山梨醇酯20，或0.05％聚山梨醇酯80，或0.05％Triton X-100和10mM柠檬酸盐(pH 7.5)的1ml掩蔽样品中。LPS源、类型和供应商示出于表5(下文)中。在LB培养基中生长至稳定期后，通过无菌过滤，从细菌培养基上清液中制备NOE。加入0.05％叠氮化钠作为防腐剂。将冻干的LPS溶解于不含内毒素的水中。表5-7中供应商被标示为“LMU”的LPS溶液受赠于慕尼黑路德维希马克西米利安大学A.Wieser博士。使用试剂盒(HyglosGmbH)测定LPS储备溶液的内毒素含量，并制备无内毒素的水中大约5000EU/ml LPS的储备溶液。将10μl的这些溶液加入至1ml掩蔽样品中。而后，使样品在室温下将各LPS掩蔽7天。

通过加入100μl的100mM 1-十二烷醇储备液，或加入100μl的100mg/ml BSA和100μl的100mM 1-十二烷醇储备液或通过加入各100μl的1M CaCl₂、100mg/ml BSA、1％SDS和100mM 1-十二烷醇溶液进行内毒素解蔽。按实施例1-5中所述进行内毒素含量的解蔽和检测。

结果

表5-7(下文)中示出从不同清洁剂掩蔽系统中掩蔽和解蔽不同来源和类型的LPS的LPS回收百分比。特别是，表5示出了从吐温20/柠檬酸盐的掩蔽系统所得的结果，表6示出了从吐温80/柠檬酸的盐掩蔽系统所得的结果，表7示出了从Triton X-100/柠檬酸盐的掩蔽系统所得的结果。

表5

*为普通水污染物的菌株，因此更可能存在于药物组合物的生产过程中。

表6

表7

以上数据清楚地显示从各掩蔽系统中成功解蔽内毒素的能力独立于所用LPS的来源和类型。这些结果是重要的，因为它们显示本发明的解蔽方法代表了在各种掩蔽条件下可应用至各种来源的各种类型的内毒素的一般教导。

实施例7：从蛋白掩蔽系统中解蔽内毒素

先前实验已研究了从清洁剂掩蔽系统中解蔽LPS。然而，如上文所述，清洁剂不是能掩蔽内毒素以使其无法被检测的唯一物质。当蛋白(例如蛋白API)在其结构上或结构内含有内毒素能结合从而无法被检测的结合位点时，该蛋白也能够掩蔽内毒素使其无法被检测。因此本实验涉及使用蛋白而不是清洁剂掩蔽内毒素(LPS)。在这些实验中使用溶菌酶作为掩蔽蛋白，因为已知其具有结合内毒素的能力(见例如Ohno和Morrison(1999).J.Biol.Chemistry 264(8),4434-4441)。

材料和方法

按如下进行内毒素掩蔽：将50EU/ml的LPS(大肠杆菌O55:B5)于室温下在含有1mg/ml鸡蛋白溶菌酶(Sigma Aldrich)的10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 7.5)中培养七天。

按如下进行内毒素解蔽：通过加入各种组合的解蔽试剂(之前实施例中描述的调节剂和影响氢键稳定性的试剂)进行解蔽。特别地，将100μl的以下解蔽剂加入至1ml等份的掩蔽样品：1-十二烷醇、CaCl₂、BSA、SDS中。除将1-十二烷醇溶解于100％乙醇中外，将其它所有储备液溶解于水中。所加储备液的浓度分别为100mM 1-十二烷醇、1M CaCl₂、100mg/mlBSA和1％SDS。通过按序加入各组分，并在每次加入后进行2分钟的涡旋步骤进行解蔽。然后将样品在室温培养30分钟，而后在无内毒素的水中稀释为1:10和1:100，以便使用试剂盒(Hyglos GmbH)分析。

结论

表8(下文)显示了取决于加入组分的从蛋白掩蔽物(溶菌酶)中解蔽的功效

表8

CaCl₂	BSA	SDS	1-十二烷醇	％回收率LPS
					-	-	-	-	0
+	-	-	-	0
					+	+	-	-	4
+	+	+	-	33
					+	+	+	+	115
+	+	-	+	15
					+	-	+	+	0
+	-	+	-	4
					+	-	-	+	2
-	+	-	-	9
					-	+	+	-	0
-	+	+	+	1
					-	+	-	+	6
-	-	+	-	0
					-	-	+	+	0
-	-	-	+	1

在通过溶菌酶掩蔽的情况下，仅使用1-十二烷醇(重组调节剂)或与作为调节剂系统的额外组分的辅助性清洁剂(置换调节剂)一起使用无法有效解蔽。在此，溶菌酶-LPS掩蔽复合物似乎更稳定，这是由于负电荷LPS和正电荷溶菌酶间的静电相互作用。解蔽的改进可通过加入盐来实现，所述盐破坏静电相互作用，从而使溶菌酶-LPS复合物更不稳定，并增强其对调节剂破坏的易感性。为了该目的，可通过使用BSA(吸附调节剂)、SDS(置换调节剂)和1-十二烷醇(重组调节剂)以及CaCl₂的多组分调节剂系统降低初始溶菌酶-LPS复合物的稳定性来实现良好的结果。这些组分的组合能破坏掩蔽的复合物，并产生可检测的LPS结构。该模型可作为能用于解蔽由药物组合物中蛋白(例如蛋白API)全部或部分掩蔽的内毒素的措施的通用模型。

实施例8：用于解蔽的除1-烷基醇外作为调节剂的物质

如上文所述，已发现1-烷基醇(用作重组调节剂)促进形成可检测的LPS结构。因此期望研究除1-烷基醇外其他类型的物质是否也能具有促进形成相似可检测形式LPS的能力。该实例显示了除1-烷基-醇外，可能能够帮助形成可检测的LPS结构的物质的筛选结果。

材料和方法

室温下将LPS(大肠杆菌O55:B5，Sigma)100EU/ml在聚山梨醇酯20/柠檬酸盐中掩蔽24小时。通过将1份CaCl₂(1M)、BSA(100mg/mL)、SDS(1％)和物质X储备液按序加入至10份掩蔽的LPS溶液中开始解蔽，其中“物质X”表示了除1-烷基醇外的物质，其作为重组调节剂的能力待测试。将物质X滴定为不同浓度。解蔽后，在无内毒素的水中将样品稀释为1:10和1:100，并使用试剂盒(Hyglos GmbH)分析样品中可检测的内毒素。

结果

表9(下文)显示了取决于用作调节剂的物质的解蔽后的最大LPS回收率。此外，示出了用于解蔽的各种物质储备液的适宜浓度。

表9

如上可看出，1-烷基醇不是唯一一类能作为重组调节剂促进形成可检测形式LPS的化合物。其它含有更高氧化态氧的物质(例如在1-癸酸中)，以及含有除氧外的其它杂原子的物质(如，在辛基硫酸钠(SOS)中)也能产生中等至良好的解蔽。

结果表明，在结构上与1-烷基醇相似的物质也能在某种程度上帮助解蔽。似乎对于使LPS更易于被基于因子C的试验检测，烷烃的OH-衍生物，优选C₈-C₁₆烷烃，优选C₈-C₁₂烷烃，优选C₁₂，是最好的。

实施例9：使用不同来源的白蛋白和1-十二烷醇进行解蔽

作为通过在含有聚山梨醇酯80的掩蔽样品中加入牛血清白蛋白(BSA)改善解蔽的验证的一部分，测试了不同来源的白蛋白。

材料和方法

通过加入100μl不同浓度的白蛋白储备液(牛血清白蛋白(BSA)，非常少的内毒素，Serva GmbH；人血清白蛋白(HSA，于Pichia pastoris重组制造(Sigma Aldrich))；和卵白蛋白(Ova)，EndoGrade卵白蛋白，Hyglos GmbH，并随后加入100μl的100mM 1-十二烷醇储备液)，解蔽含有50EU/ml LPS(O55:B5)的聚山梨醇酯80/柠檬酸盐缓冲液中的掩蔽样品(1ml)。白蛋白储备液的浓度为100、33、10、3.3和1mg/ml。由于卵白蛋白在水中的低溶解度，未制备100mg/ml的卵白蛋白溶液。

使用试剂盒(Hyglos GmbH)检测可检测的LPS含量后，计算LPS回收率。为了测试，将解蔽的样品在无内毒素水中稀释为1:10和1:100，而后根据试剂盒说明测量。

结果

表10(下文)显示了取决于不同来源白蛋白的，从聚山梨醇酯80/柠檬酸盐掩蔽系统中解蔽的功效

表10

nd＝无数据

数据显示所有测试的白蛋白均能帮助从聚山梨醇酯80掩蔽系统中解蔽。解蔽的样品中合适的最终浓度对于BSA为10mg/ml，对于HSA为1mg/ml，对于卵白蛋白为3.3mg/ml。最优浓度间的差异可来源于白蛋白对掩蔽样品中清洁剂的不同亲和性。

实施例10：各种离液盐对掩蔽功效的影响

使用物质CaCl₂(影响氢键的试剂)、BSA(吸附调节剂)、SDS(置换调节剂)和1-十二烷醇(重组调节剂)的组合(该整体组合被称为“CBSD”)进行解蔽在上文已显示有效解蔽通过例如Triton X-100掩蔽的LPS。本实验研究了离液盐(影响氢键稳定性的试剂)的性质对解蔽功效的影响。为了该目的，以下实验采用增加离液序列性能的盐：Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺，各种情况下表现为相应的氯盐。

材料和方法

按如下进行内毒素掩蔽：室温下，通过使50EU/ml的大肠杆菌LPS O55:B5在含有0.05％Triton X-100的10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 7.5)中培养3天，将其掩蔽。在此，TritonX-100起清洁剂掩蔽物作用。

按如下进行内毒素解蔽：将300、100、30、10、3和1μl的5M氯化钠(NaCl)、1M氯化镁(MgCl₂)或1M氯化钙(CaCl₂)储备液加入1ml等份掩蔽的样品中并混合。随后，按实施例1-5中所述加入100μl的其他调节剂组分(BSA(吸附调节剂)、SDS(破裂和置换调节剂)和1-十二烷醇(重组调节剂))。

结果

表11(下文)示出了取决于每种离液盐的内毒素回收百分比，以及解蔽样品中每种盐最合适的最终浓度。

表11

数据显示所有检测的盐均能够与包含BSA(吸附调节剂)、SDS(在此，破裂调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的多组分调节剂系统联合，帮助从掩蔽清洁剂TritonX-100中有效地解蔽LPS。此外，如上文所述，随着增加离液序列性能，实现同等程度解蔽功效所需盐的量降低。这些结果可推导出几个一般性结论。首先，当使用盐破坏内毒素和内毒素掩蔽物间掩蔽的复合物的稳定性时，该盐的离液序列性能是实现有效解蔽的重要因素。第二，实现有效解蔽所需的盐的量通常反比于所采用的盐的离液序列强度。

实施例11：从含有清洁剂和磷酸盐缓冲液的样品中解蔽内毒素

大多数含有作为活性药物成分(API)的蛋白(例如抗体)的药物制剂含有在柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液中一起被缓冲的非离子清洁剂例如聚山梨醇酯20或80。在这样的制剂中，清洁剂浓度通常高于每种清洁剂的临界胶束浓度(CMC)。此外，常将这样的制剂中的pH值调节为确保API的最佳稳定性。

鉴于以上，本实施例中进行的实验意在研究pH值对解蔽功效的影响。为了尽可能地接近含有蛋白API的药物制剂中的主导条件，使用清洁剂聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80作为内毒素掩蔽物，且溶液以磷酸盐缓冲。考虑到上文所述结果，使用CaCl₂(作为影响氢键稳定性试剂的离液盐)、BSA(吸附调节剂)、SDS(在此作为破裂调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合进行解蔽。由于Ca²⁺和PO₄ ^3-形成不可溶的钙-磷酸盐复合物，通过加入超过两倍摩尔量的柠檬酸盐(pH7.5)稳定氯化钙溶液。

材料和方法

按如下进行内毒素掩蔽：向每种含有10mM各种pH值的磷酸盐缓冲剂和0.05％聚山梨醇酯20或山梨醇酯80的1ml样品中，加入100EU/ml的大肠杆菌LPS O55:B5。通过将这些溶液在室温培养7天进行掩蔽。与掩蔽样品平行制备、培养和测量缺少清洁剂的含有LPS的磷酸盐缓冲剂对照样品。

按如下进行内毒素解蔽：向之前实施例中所述的每个样品中加入CaCl₂、BSA、SDS和1-十二烷醇的组合。为了避免磷酸钙沉淀，以及调节样品的pH，在加入解蔽组分前，向每个样品中加入超过2倍摩尔量的柠檬酸缓冲剂(pH 7.5)。

在时间零点和7天后，使用Hyglos GmbH的试剂盒测定掩蔽样品的内毒素含量。使用Hyglos GmbH的试剂盒分析解蔽的样品的内毒素含量。参照时间零点的对照样品，计算掩蔽7天后和解蔽后的LPS回收百分比。

结果

表12(下文)和图10及11显示了取决于pH值的，掩蔽7天后的LPS回收百分比，以及将掩蔽的样品解蔽后的LPS回收百分比。

表12

数据显示在含有清洁剂的磷酸缓冲溶液中掩蔽是强烈pH依赖的。在pH值低于4时，将样品培养1周后未发生掩蔽。在pH值高于4时，观察到强的掩蔽效果，导致可检测的LPS回收率小于1％。

数据还结论性地显示实施的解蔽方法使在先掩蔽的、无法检测的LPS可检测。独立于pH值和掩蔽程度，可使100％或更多的LPS回收，即可检测。

实施例12：使用除SDS外的其他置换调节剂进行解蔽

如上述实施例中所示，CaCl₂/BSA/SDS/1-十二烷醇的组合有效地解蔽由TritonX-100清洁剂掩蔽的内毒素。上述几个实验表明在该方案中加入SDS以实现有效解蔽的重要性。本实施例中所述实验的目的在于研究调节剂组分SDS(在此为破裂调节剂)可否替换为另一种清洁剂，而不对解蔽作用产生使用SDS所观察到的负面影响。

材料和方法

按如下进行内毒素掩蔽：在不含内毒素的玻璃试管中制备含有0.05％Triton X-100的10mM柠檬酸盐(pH 7.5)的1ml等分液。而后，加入10μl的10,000EU/ml LPS储备液(LPS055B5，Sigma L2637-5MG)，涡旋1min，在室温下静置至少24小时。按如下制备水中阳性LPS对照：将10μl的10,000EU/ml LPS储备液加入至1ml不含内毒素的水中，混合并以与掩蔽制剂相同方法培养。实施例1中给出了关于阳性LPS-水对照的更多详细内容。

按如下进行内毒解蔽：向按上文所述制备的LPS的掩蔽溶液中加入如在先实施例中所述的CaCl₂、BSA、清洁剂X和1-十二烷醇，其中“清洁剂X”(破裂调节剂)在性质和浓度上变化。测试以下清洁剂：磺基琥珀酸钠二辛脂(AOT)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、聚乙二醇4-壬基苯基-3-磺丙基醚钾盐(PENS)和对二甲苯-2磺酸水合物(XSA)。按上文实施例中所述的进行解蔽，使用Hyglos GmbH的试剂盒测定内毒素含量，基于LPS-水阳性对照计算LPS回收百分比。上文实施例1描述了关于LPS-水阳性对照的更多详细内容。

结果

表13示出了在CaCl₂/BSA/[清洁剂X]/1-十二烷醇解蔽方法中，使用除SDS外的其他清洁剂解蔽后LPS的回收率百分比。

表13

数据显示除SDS外的其他清洁剂能在CaCl₂/BSA/[清洁剂X]/1-十二烷醇解蔽方法中作为破裂调节剂帮助解蔽。此外，不存在1-十二烷醇时，没有清洁剂能够从Triton X-100中解蔽LPS。如上文所提及的，这表明1-十二烷醇作为重组调节剂可起到(至少)重要作用，对介导内毒素从溶解(不可检测)态向聚集(可检测)态的转换可能非常重要。

实施例13：取决于掩蔽清洁剂的从缓冲的抗体组合物中解蔽

最常规使用的基于蛋白的药品的制剂含有磷酸缓冲剂和非离子清洁剂例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。此外，抗体构成了最常规配制的药物蛋白产品中的一员。基于此，我们试图确证以上用于清洁剂或蛋白掩蔽系统的解蔽方法是否适于在含有清洁剂和蛋白的系统中解蔽内毒素，其中所述蛋白为在磷酸盐中缓冲的抗体。在这些实验中，使用聚山梨醇酯20和80作为掩蔽清洁剂，因为这两种清洁剂是蛋白药物制剂中最常用的清洁剂。

材料和方法

按如下进行内毒素掩蔽：将50EU/ml的内毒素(大肠杆菌O55:B5；Sigma L2637-5MG)加入至溶解于10mM磷酸钠(pH 7.5)和50mM NaCl的含有10mg/ml牛多克隆IgG抗体制剂的抗体溶液的1ml等份液中。而后，加入聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80至0.05％的最终浓度，并将所述溶液在室温培养3天以产生掩蔽。此外，制备含有缓冲溶液而不含清洁剂或抗体的对照，以及含有抗体或分别的聚山梨醇酯的缓冲溶液的对照，并以掩蔽样品的方式处理所述对照。每种对照中都含有相同量的LPS。

按如下进行解蔽：通过加入1-十二烷醇或BSA/1-十二烷醇或CaCl₂/BSA/SDS/1-十二烷醇进行解蔽。将100μl以下各种储备液按序加入至1ml样品溶液中：CaCl₂(1M)、BSA(100mg/ml)、SDS(1％)和1-十二烷醇(100、10或1mM)。此外，在向样品中加入氯化钙之前，通过加入最终浓度为200mM的柠檬酸钠(pH 7.5)稳定所述样品以防止磷酸钙沉淀。次序加入所有的储备液，并在每次加入后进行2分钟的混合步骤。在加入和混合最后一个组分后，将样品在室温培养至少30分钟。之后，将样品在不含内毒素的水中稀释为1:10和1:100，并使用EndoLISA试剂盒(Hyglos GmbH)分析内毒素含量。基于缓冲对照中测定的内毒素含量计算LPS回收率百分比(在实施例1中更详细地讨论)。

结果

表14a(下文)示出了水对照、不含清洁剂的缓冲液、含有抗体或清洁剂的缓冲液和含有抗体及清洁剂的缓冲液在室温培养3天后的LPS回收率百分比。

表14a

表14b(下文)示出了从解蔽后的含有聚山梨醇酯20或80的抗体溶液中的LPS回收率百分比。此外，其示出了所加储备液的浓度。

表14b

数据显示不含聚山梨醇酯20或80的缓冲溶液无法掩蔽所加的LPS。含有抗体但不含聚山梨醇酯掩蔽物的缓冲溶液掩蔽～55％至70％的LPS，表明抗体蛋白自身有助于掩蔽功效。当未进行解蔽时，从含有聚山梨醇酯或聚山梨醇酯和抗体的缓冲溶液中的LPS回收率为10％以下。因此，不仅清洁剂，抗体对掩蔽LPS也有作用。

仅使用1-十二烷醇时，从含有LPS、清洁剂和抗体的掩蔽复合物中解蔽后的LPS回收率是低的(对聚山梨醇酯80和20分别为9％和17％)。使用BSA(吸附调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合，导致中等的LPS回收，对聚山梨醇酯80为11％，对聚山梨醇酯20为41％。使用CaCl₂、BSA(吸附调节剂)、SDS(置换调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合进行解蔽，对于聚山梨醇酯20和80，分别产生掩蔽的LPS67％和91％的回收。有趣的是，使用低至1mM的浓度的1-十二烷醇储备液实现解蔽。此外，与从不含蛋白的清洁剂系统解蔽不同，使用1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)或BSA(吸附调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)时解蔽功效不超过50％。如上文对溶菌酶所述，仅在CaCl₂、BSA、SDS和1-十二烷醇的存在下实现有效解蔽。

实施例14：取决于缓冲物质的从含有抗体和聚山梨醇酯20的组合物中的解蔽

上文实施例14中确定本发明所述的解蔽方法适用于解蔽含有清洁剂和缓冲蛋白(抗体)的组合物。基于此，从而期望研究缓冲剂对解蔽功效的影响。为了该目的，我们选择pH 7.5的10mM柠檬酸盐缓冲液或10mM磷酸盐缓冲剂，因为它们是蛋白药物制剂中最常用的缓冲剂。

材料和方法

按如下进行内毒素掩蔽：将50EU/ml的内毒素(大肠杆菌O55:B5；Sigma L2637-5MG)加入至含有10mg/ml牛多克隆IgG抗体制剂的抗体溶液的1ml等份液中，所述制剂溶解于含50mM氯化钠的10mM磷酸钠或含有150mM氯化钠的10mM柠檬酸钠(pH 7.5)中。而后，加入聚山梨醇酯20至0.05％的最终浓度，并将所述样品在室温掩蔽3天。此外，制备含有缓冲溶液而不含清洁剂或抗体的阳性对照，以及含有抗体或分别的聚山梨醇酯的缓冲溶液的对照，并以掩蔽样品的方式处理所述对照。每种阳性对照中都含有相同量的LPS。

按如下进行内毒素解蔽：通过加入1-十二烷醇，或BSA(吸附调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合，或CaCl₂、BSA(吸附调节剂)、SDS(置换调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合进行解蔽。将100μl以下各种储备液按序加入至1ml样品溶液中：CaCl₂(1M)、BSA(10mg/ml)、SDS(1％)和1-十二烷醇(100、10或1mM)。此外，在向含有磷酸盐缓冲剂的样品中加入氯化钙之前，通过加入最终浓度为200mM的柠檬酸钠(pH 7.5)稳定所述样品以防止磷酸钙沉淀。按序加入所有的储备液，并在每次加入后进行2分钟的混合步骤。在加入和混合最后一个组分后，将样品在室温培养至少30分钟。之后，将样品在不含内毒素的水中稀释为1:10和1:100，并使用EndoLISA试剂盒(Hyglos GmbH)分析内毒素含量。基于阳性对照中测定的内毒素含量计算LPS回收率百分比(在实施例1中更详细地讨论)。

结果

表15(下文)示出从含有柠檬酸盐或磷酸盐作为缓冲物质的抗体溶液掩蔽和解蔽后的LPS的回收率百分比。

表15

*“解蔽的”样品含有抗体。

数据显示含有抗体但不含聚山梨醇酯的缓冲溶液掩蔽60％至70％的LPS(基于对于柠檬酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液分别为40％和约30％的LPS回收率)。从含有聚山梨醇酯或聚山梨醇酯和抗体的缓冲溶液中的LPS回收率低于1％。在这些情况下，掩蔽不依赖于存在的缓冲剂。

仅使用1-十二烷醇，从含有LPS、清洁剂和抗体的组合物中解蔽后的LPS回收率低(对于磷酸盐和柠檬酸盐分别为17％和26％)；使用BSA(吸附调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合时，上述LPS回收率中等(对于磷酸盐和柠檬酸盐分别为41％和49％)。使用CaCl₂、BSA(吸附调节剂)、SDS(置换调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合解蔽对于磷酸盐和柠檬酸盐分别产生67％和87％的掩蔽LPS回收率。有趣地，有效解蔽所必须的1-十二烷醇储备液浓度基于所用的缓冲系统而强烈不同(对于抗体/清洁剂/柠檬酸盐为100mM，对于抗体/清洁剂/磷酸盐为1mM)。数据清楚地显示在包含蛋白(抗体)和清洁剂的组合物中解蔽内毒素可通过调节1-十二烷醇浓度实现。

实施例15：含有未知来源LPS的抗体溶液的掩蔽和解蔽

为了表明不仅可以从含有已知来源LPS的溶液中解蔽，我们测试了含有LPS污染物(其中LPS来源未知)的用于诊断的可商购小鼠单克隆抗体。此外，将该抗体溶解于与已知抗体药物利妥昔单抗制剂中相对应的缓冲液组合物中。

材料和方法

内毒素污染物的检测：将小鼠单克隆抗体(MAB 33，Roche Diagnostics)溶解于pH为6.5的含有柠檬酸盐和氯化钠的溶液中，并在4℃储存。柠檬酸盐、氯化钠和抗体的最终浓度分别为25mM、150mM和10mg/ml。溶解抗体后，直接使用和检测试剂盒(Hyglos GmbH)分析内毒素含量。测定的内毒素含量为11EU/mg的抗体。

通过加入最终浓度为0.07％的聚山梨醇酯80并将温度升高至环境条件(22℃)开始LPS掩蔽。而后，将1ml样品等分液在室温培养3天使存在的内毒素成为掩蔽的。

按如下进行解蔽：通过加入1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)，或BSA(吸附调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合，或CaCl₂、BSA(吸附调节剂)、SDS(置换调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合进行解蔽。向1ml样品溶液中按序加入100μl以下各种储备液：CaCl₂(1M)、BSA(10mg/ml)、SDS(1％)和1-十二烷醇(100、10或1mM)。所有储备液按序加入，并在每次加入后进行2分钟的混合步骤。加入和混合最后的组分后，将样品在室温下培养至少30分钟。

而后，将样品在不含内毒素的水中稀释为1:10和1:100，并使用(Hyglos GmbH)分析内毒素含量。基于时间零点测定的内毒素含量计算LPS回收率百分比。

结果

表16(下文)显示了存在或不存在聚山梨醇酯80时取决于掩蔽时间的从抗体/聚山梨醇酯80溶液中解蔽的内毒素回收率百分比。

表16

*“解蔽的”样品含有抗体。

数据显示含有抗体但不含聚山梨醇酯的缓冲溶液在室温培养3天内掩蔽了40％的LPS。然而，在含有聚山梨醇酯80或抗体和聚山梨醇酯80的缓冲液中培养，致使内毒素回收率小于4％。

使用1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)从抗体/清洁剂样品中解蔽产生45％的回收率，使用BSA(吸附调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合产生68％的回收率；使用CaCl₂、BSA(吸附调节剂)、SDS(置换调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合产生179％的回收率。在后面的情况中，使用1mM 1-十二烷醇储备液实现最好的回收率。

本实施例中描述的实验显示，当存在时，可通过合适的内毒素检测系统检测天然存在的内毒素(NOE)。此外，这些实验显示这样的NOE可以上文所述的方式被掩蔽，即掩蔽危险不仅作用至纯内毒素，也作用于NOE。本发明所述方法解蔽这样NOE的能力进一步论证了它们在NOE已被掩蔽的情况下的应用性，证明本发明方法解蔽掩蔽的NOE的有效性。这些发现与工业中占主导的条件相关，其中生产工艺通常从存在NOE的表达蛋白开始，所述NOE由混入清洁剂掩蔽以防止不期望蛋白聚集。而后，总的来说，本实施例中所述实验的结果证明本发明方法能够在与制药工业相关的条件下解蔽内毒素。

这些数据也清楚地显示解蔽独立于LPS的来源和纯度。

在所有于抗体溶液中掩蔽的三个情况(实施例13、14和15)中，可见掩蔽不仅归因于组合物中的清洁剂组分，也在某种程度上归因于抗体本身。最有效的解蔽方法是使用CaCl₂、BSA(吸附调节剂)、SDS(置换调节剂)和1-十二烷醇(破裂和重组调节剂)的组合解蔽内毒素。在此，在溶菌酶的情况下也可见类似现象(上文实施例7中所讨论的)，其中所述蛋白本身起到了内毒素掩蔽物的作用。有趣的是，在所有情况下，1-十二烷醇浓度应当被优化以用于有效解蔽。

实施例16：应用至所讨论的新组合物的解蔽方法的一般性评估

如以上实施例中所示，对解蔽组合物中疑似存在但被掩蔽的内毒素的方法的选择将取决于多种因素。例如，如上文实施例所示，有时可使用如本文所定义的同时作为破裂调节剂和重组调节剂的单一-组分调节剂实现有效解蔽。另一方面，在某些实例中，调节剂应是具有两种或更多种组分(例如置换调节剂和/或吸附调节剂)的调节剂系统，这取决于需要何种措施以充分破坏内毒素/内毒素掩蔽物复合物的稳定性并使其分解，以使内毒素释放，并被介导为可被检测的聚集形式。

为了说明为本发明基础的理念，上述实施例始于已知的受控的溶液条件。然而，在现实方案中，其中将本发明方法应用于所讨论的新组合物，在得到有意义的结果前，必须先评估本发明的方法。本实施例解决了这样的验证，提出通用的方案，通过该方案本发明的方法可被用于校准所讨论的新组合物。为了该目的，需要一种迭代的解蔽方法，其始于筛选最合适的解蔽方法，随后是调节最优解蔽组分浓度的后续改善步骤。

给定组合物评估方法的一般性描述

一般性地，图12示出了一个方案，其图解提出对于新的未知的组合物，评估本发明方法通常将采用的步骤。

从上文所述将清楚的是，最初掩蔽的内毒素的最终检测取决于将该内毒素从稳定的结合(掩蔽)形式转换为解蔽的从而是可检测的聚集形式的能力。对该最终转换负有责任的调节剂的组分是重组调节剂。图12的第一个步骤反映了上述内容，其中其详细说明了第一个步骤：测定重组调节剂(例如1-十二烷醇)最优浓度。而后如果包括吸附调节剂，步骤2最优化该调节剂的浓度。而后如果包括置换调节剂，步骤3最优化该调节剂的浓度。

应强调，并不总是需要所有三个步骤。如果已在步骤1后发现一个所讨论的组合物，例如药物组合物，含有显著量的内毒素，则该答案可能已足以推导出所述组合物不是不含内毒素的。

对给定组合物评估方法的具体描述

图13显示了用于选择和最优化解蔽方法的储备液的组合和浓度。所述解蔽方法被分为不同的可能性方案A、B和C，其取决于解蔽中使用的是哪种物质或物质的组合。解蔽方法A描述了仅使用1-十二烷醇作为调节剂的解蔽方法。解蔽方法B描述了调节剂系统由1-十二烷醇和BSA组成的解蔽方法。解蔽方法C描述了解蔽系统由1-十二烷醇、BSA和SDS组成，且在CaCl₂存在下进行的解蔽方法。

步骤

将100μl的解蔽组分储备液加入至1ml掩蔽样品中。加入1种组分后，通过涡旋2分钟充分混合样品。然后，加入下一个组分并混合。在加入所有组分并后续混合后，将样品在室温培养>30分钟。而后，使用适当的内毒素检测方法，例如Hyglos GmbH的试剂盒分析样品的内毒素含量。

实施例17：使用重组因子C检测测定解蔽的内毒素

该实验研究了使用包含CaCl₂、BSA、SDS和十二烷醇的多组分调节剂解蔽内毒素的功效。使用Hyglos GmbH的试剂盒检测掩蔽的和解蔽的内毒素含量。进行所述实验以表明可使用不同检测方法实现掩蔽的内毒素的检测。

材料和方法

将内毒素(大肠杆菌O55:B5，Sigma L2637-5MG)于室温下在含有1x PBS缓冲的0.05wt％的聚山梨醇酯80溶液中，或在含有1x PBS缓冲的0.05wt％的聚山梨醇酯20溶液中掩蔽三天。

按如下进行解蔽：通过柠檬酸钠、CaCl₂、BSA、SDS和1-十二烷醇的组合进行解蔽。将150μL柠檬酸钠和100μL以下各种储备液加入至1ml的样品溶液中：柠檬酸钠(1.375M pH7.5)、CaCl₂(1M)、BSA(10mg/ml)、SDS(1％)和1-十二烷醇(1mM)。将1-十二烷醇溶解于70％EtOH中。在独立的掩蔽对照中，未进行解蔽。

按序加入所有的储备液，并在每次加入后进行两分钟的混合步骤。加入和混合最后的组分后，将样品在室温下培养至少30分钟。

而后，将掩蔽(掩蔽对照)和解蔽的样品在除热原水中逐步稀释为1:10和1:5(最终稀释为1:50)。使用重组因子C检测测定内毒素。

结果

表17(下文)示出了使用重组因子C检测测量的从本实施例中说明的两种掩蔽系统中回收的内毒素的回收百分比。

表17

使用重组因子C检测解蔽的内毒素

在各样品中掩蔽对照组均未显示内毒素回收。在聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20中的内毒素解蔽分别产生基于阳性对照(除热原水中内毒素含量)65％和66％的内毒素回收。结果说明了由重组因子C检测系统检测的使用包含柠檬酸钠、CaCl₂、BSA、SDS和十二烷醇的多组分调节剂进行的内毒素有效解蔽。该实验证明，解蔽内毒素的检测不依赖于所使用的内毒素检测系统。因此，可使用在先实施例中所采用的内毒素检测系统检测解蔽的内毒素，但也可使用不同于在先实施例中所采用的内毒素检测系统进行检测。

实施例18：使用鲎变形细胞溶解物(LAL)检测测定解蔽的内毒素

该实验研究了使用不同于重组因子C检测的检测方法(即鲎变形细胞溶解物(LAL)检测)测定解蔽的内毒素。进行本实验以进一步证实内毒素解蔽的检测不依赖于检测方法。

材料和方法

将内毒素(大肠杆菌O55:B5，Sigma L2637-5MG)于室温下在含有1x PBS缓冲的0.05wt％聚山梨醇酯80溶液中，或在含有1x PBS缓冲的0.05wt％聚山梨醇酯20溶液中掩蔽三天。

按如下进行解蔽：通过柠檬酸钠、CaCl₂、BSA、SDS和1-十二烷醇的组合进行解蔽。将150μL柠檬酸钠和100μL以下各种储备液加入至1ml的样品溶液中：柠檬酸钠(1.375M pH7.5)、CaCl₂(1M)、BSA(10mg/ml)、SDS(1％)和1-十二烷醇(1mM)。将1-十二烷醇溶解于70％EtOH中。

按序加入所有的储备液，并在每次加入后进行两分钟的混合步骤。加入和混合最后的组分后，将样品在室温培养至少30分钟。

而后，将掩蔽(掩蔽对照)和解蔽的样品在除热原水中逐步稀释为1:10和1:5(最终稀释为1:50)。使用动态LAL-基显色试验(动态-Lonza)测定内毒素。掩蔽对照反映了未解蔽的可检测内毒素的含量。在独立的掩蔽对照中，未进行解蔽。

结果

表18(下文)示出了使用LAL试验(动态-Lonza)测量的从本实施例中说明的两种掩蔽系统中回收的内毒素的回收百分比。

表18

使用LAL试验解蔽

在两份样品中掩蔽对照组均未显示内毒素回收。在聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20中的内毒素解蔽分别产生基于阳性对照(除热原水中内毒素含量)96％和47％的内毒素回收。该数据清楚地证明可使用LAL检测试验检测解蔽的内毒素，所述内毒素解蔽检测不依赖于检测方法。

实施例19:作为用于使用多组分调节剂进行解蔽的调节剂的烷醇(脂肪醇)的变化

本实验研究了使用不同烷醇解蔽不同内毒素。进行本实验以研究在多组分调节剂中不同烷醇化合物的解蔽功效。

材料和方法

将来自于大肠杆菌O55:B5(Sigma L2637-5MG)、马流产沙门氏菌(Acila 1220302)和肺炎克雷伯氏菌(LMU)的内毒素于室温下在含有10mM柠檬酸钠和0.05wt％聚山梨醇酯20的溶液中掩蔽三天。

按如下进行解蔽：通过柠檬酸钠、CaCl₂、BSA、SDS和1-十二烷醇的组合进行解蔽。将150μL柠檬酸钠和100μL以下各种储备液加入至1ml样品溶液中：柠檬酸钠(1.375M pH7.5)、CaCl₂(1M)、BSA(10mg/ml)、SDS(1％)和一定浓度的1-十二烷醇。将在多组分调节剂系统中使用的烷醇和烷醇混合物溶解于EtOH中；浓度列于下表19a(下文)中。在独立的掩蔽对照中，未进行解蔽。

表19a

而后，将样品在不含内毒素的水中稀释至1:10和1:100，使用(HyglosGmbH)分析内毒素含量。基于在时间零点测定的内毒素含量计算LPS回收率百分比(总结于下表19b中)。

结果

表19b(下文)显示了使用试验(Hyglos)测定的掩蔽后(掩蔽对照)和通过各种采用上述表19a中所述的不同烷醇(脂肪醇)或烷醇混合物(脂肪醇混合物)的解蔽方法从上述掩蔽系统中解蔽后的回收率百分比。

表19b

通过试验检测的，使用Ca、BSA、SDS和各种烷醇的不同内毒素的解蔽。

*对于解蔽肺炎克雷伯氏菌，加入150μL的CaCl₂。

以上结果说明使用辛醇(75％回收率)、十二烷醇(147％)、十四烷醇(94％)和十六烷醇(99％)，以及不同烷醇的组合(见例如解蔽方法7和8)实现肺炎克雷伯氏菌的解蔽。然而，以癸醇进行解蔽效果欠佳(52％)。使用十四烷醇(108％)、十六烷醇(82％)、十二烷醇(62％)或不同烷醇的组合解蔽马流产沙门氏菌LPS是最有效的。使用十二烷醇(76％)和十四烷醇(71％)时观察到大肠杆菌O55:B5的有效解蔽。掩蔽对照未观察到内毒素回收。

这些结果表明使用十二烷醇或十四烷醇，或使用十二烷醇和十四烷醇以及其他烷醇(例如解蔽7中的癸醇)的组合实现最有效的解蔽(不依赖于内毒素性质)。这些结果还表明所有具有C₁₂、C₁₄和/或C₁₆的脂肪醇的多组分调节剂系统展现有效的内毒素解蔽。

用于有效解蔽的脂肪醇的烷基链长度范围似乎取决于内毒素来源。解蔽功效的差异可在某种程度上取决于内毒素脂质A部分中存在的β-羟基-脂肪酸酰基链长度的不一致性。在细菌种类间和种类中，这些酰基链的长度可在C10至C28间变化(健康和疾病中的内毒素，H.Brade编辑，(1999)，p98，以及下列等等：“Chemical structure of Lipid A:Recentadvances in structural analysis of biologically active molecules”；MarcelDekker Inc,New York)。然而，最常见的具有C14和C16链长度的β-羟基-脂肪酸是附加在脂质A的二葡糖胺上的。因此，存在烷基链长度为C12和C14之间的脂肪醇时，所有情况下的解蔽都是最有效的，即使在C8-C16范围的其他烷基链长度中也观察到了内毒素解蔽。

实施例20:作为用于使用单组分调节剂进行解蔽的调节剂的烷醇(脂肪醇)的变化

本实验研究了不存在额外的调节剂组分时各种烷醇(脂肪醇)对解蔽的影响。因此本实验研究了使用各种烷醇(脂肪醇)作为单一-组分调节剂的内毒素解蔽的功效。

材料和方法

将内毒素大肠杆菌O55:B5(Sigma L2637-5MG)于室温下在含有10mM柠檬酸钠和0.05wt％聚山梨醇酯20的溶液中掩蔽三天。

为了解蔽样品，将样品(1mL)与100μL的特定烷醇(即脂肪醇)混合。将在单一组分调节剂系统中使用的烷醇溶解于EtOH中。浓度示出于下表20a中。

表20a

烷醇的变化(脂肪醇)

解蔽方法	烷醇(大小)	浓度[mM]
			1	十二烷醇(C12)	50mM
2	十三烷醇(C13)	50mM
			3	十四烷醇(C14)	50mM

加入解蔽剂后，将样品培养30分钟，并在除热原的水中稀释至1:10和1:100。检测稀释液中的内毒素，所得回收率反应两种稀释液的平均回收率。掩蔽对照反映了掩蔽后的未处理样品，即溶液未解蔽。使用试验进行内毒素检测。

结果

表20b(下文)中示出了使用试验(Hyglos)测定的，通过多种解蔽方法从上述掩蔽系统回收的内毒素的回收百分比，所述多种解蔽方法在使用单一调节剂系统的不同解蔽方法中使用不同的烷醇(脂肪醇)(如上文表20a中所述)。

表20b

使用不同烷醇解蔽

结果表明由十二烷醇(解蔽方法1)构成的单一组分调节剂在解蔽大肠杆菌O55:B5中是最有效的(56％回收率)，而由十三烷醇(解蔽方法2)或十四烷醇(解蔽方法3)构成的单一组分调节剂产生更少的大肠杆菌O55:B5回收率(分别为41％和22.6％)。如所期望的，掩蔽对照未显示内毒素回收。总之，数据证明，当用作单一组分调节剂系统时，用于解蔽大肠杆菌O55:B5的最有效的烷醇(脂肪醇)是十二烷醇，随后是十三烷醇和十四烷醇。

Claims

1.一种解蔽组合物、优选药物组合物中内毒素的方法，所述组合物包含内毒素掩蔽物并疑似包含所述内毒素，所述方法包括向所述组合物中加入能够解蔽所述内毒素的调节剂的步骤。

2.一种检测组合物、优选药物组合物中内毒素的方法，所述组合物包含内毒素掩蔽物并疑似包含所述内毒素，所述方法包括步骤：

·向所述组合物中加入能够解蔽所述内毒素的调节剂；以及

·通过检测方法检测所述内毒素。

3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括向所述组合物中加入影响溶液中氢键稳定性的试剂的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其中在加入所述调节剂之前，向所述溶液中加入所述影响溶液中氢键稳定性的试剂。

5.一种用于解蔽组合物、优选药物组合物中内毒素的试剂盒，所述组合物包含内毒素掩蔽物并疑似包含所述内毒素，所述试剂盒包括：

a)能够解蔽所述内毒素的调节剂；以及

b)影响溶液中氢键稳定性的试剂；

其中组分(a)和(b)处于相同的或不同的包装中。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒额外地包括一种或多种以下的物质：用于解蔽组合物中内毒素的说明、用于检测组合物中内毒素的说明、用于检测所述内毒素的组分和用于检测所述内毒素的说明。

7.根据权利要求3-6任一项所述的方法或者试剂盒，其中所述影响溶液中氢键稳定性的试剂是离液剂、阳离子或其组合。

8.根据权利要求7所述的方法或者试剂盒，其中所述离液剂选自由以下组成的组：脲、氯化胍、丁醇、乙醇、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇和硫脲。

9.根据权利要求7或8所述的方法或者试剂盒，其中所述阳离子是二价阳离子。

10.根据权利要求9所述的方法或者试剂盒，其中所述二价阳离子选自Ca²⁺、Mg²⁺、Sr²⁺和Zn²⁺。

11.一种能够解蔽疑似含有内毒素和内毒素掩蔽物的组合物中的所述内毒素的调节剂的用途。

12.根据前述任一项权利要求所述的方法、试剂盒或者用途，其中所述调节剂包括第一杂原子取代的脂族化合物，其中所述第一杂原子取代的脂族化合物的主链包含8-16个碳原子。

13.根据权利要求12所述的方法、试剂盒或用途，其中所述第一杂原子取代的脂族化合物是氧取代的脂族化合物。

14.根据权利要求13所述的方法、试剂盒或用途，其中所述氧取代的脂族化合物是脂肪醇。

15.根据权利要求14所述的方法、试剂盒或用途，其中所述脂肪醇是1-十二烷醇。

16.根据权利要求12-15任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述调节剂进一步包含第二杂原子取代的脂族化合物，其中所述第二杂原子取代的脂族化合物的主链包含8-16个碳原子。

17.根据权利要求16所述的方法、试剂盒或用途，其中所述第二杂原子取代的脂族化合物是氧取代的脂族化合物。

18.根据权利要求17所述的方法、试剂盒或用途，其中所述氧取代的脂族化合物是脂族硫酸盐。

19.根据权利要求18所述的方法、试剂盒或用途，其中所述脂族硫酸盐是十二烷基硫酸钠(SDS)。

20.根据权利要求12-19任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述调节剂进一步包含能够结合清洁剂以破坏由所述清洁剂形成的胶束的蛋白。

21.根据权利要求20所述的方法、试剂盒或用途，其中所述蛋白是白蛋白。

22.根据权利要求21所述的方法、试剂盒或用途，其中所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白和/或卵白蛋白。

23.根据前述任一项权利要求所述的方法、试剂盒或者用途，其中所述内毒素掩蔽物是清洁剂和/或活性药物成分(API)。

24.根据权利要求23所述的方法、试剂盒或用途，其中所述清洁剂选自由以下组成的组：阴离子清洁剂、阳离子清洁剂、非离子清洁剂、两亲性清洁剂及其任意组合。

25.根据权利要求24所述的方法、试剂盒或用途，其中所述阴离子清洁剂选自由以下组成的组：烷基硫酸盐，优选月桂基硫酸铵或月桂基硫酸钠(SDS)；烷基醚硫酸盐，优选月桂醇聚醚硫酸钠或肉豆蔻醇聚醚硫酸钠；胆固醇硫酸盐；磺酸盐，优选十二烷基苯磺酸盐、月桂基磺基乙酸钠或二甲苯磺酸盐；烷基磺基琥珀酸盐，优选月桂基磺基琥珀酸二钠；亚砜，优选二癸基甲基亚砜；磷酸盐，优选三月桂醇聚醚-4磷酸盐；和羧酸盐，优选硬脂酸钠或月桂酰肌氨酸钠。

26.根据权利要求24所述的方法、试剂盒或用途，其中所述阳离子清洁剂选自由以下组成的组：伯胺、仲胺、叔胺和季铵阳离子例如烷基三甲基铵盐(优选十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或十六烷基三甲基氯化铵(CTAC))；氯化十六烷基吡啶(CPC)；季铵清洁剂，优选三[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-十八烷基-磷酸铵(季铵盐52)和季铵化的羟乙基纤维素乙氧基化物(聚季铵盐-10)。

27.根据权利要求24所述的方法、试剂盒或用途，其中所述非离子清洁剂选自由以下组成的组：聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯(聚山梨醇酯)，优选聚山梨醇酯20(吐温20)、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80(吐温80)；聚氧乙二醇烷基醚；聚氧丙二醇烷基醚；葡萄糖苷烷基醚；聚氧乙二醇辛基苯酚醚；聚氧乙二醇烷基苯酚醚；丙三醇烷基酯；脱水山梨糖醇烷基酯；聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物；椰油酰胺MEA；固醇，优选胆固醇；环糊精；泊洛沙姆，优选普兰尼克嵌段聚合物和椰油酰胺DEA。

28.根据权利要求24所述的方法、试剂盒或用途，其中所述两亲性清洁剂选自由以下组成的组：CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)；磺基甜菜碱，优选椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱；甜菜碱，优选椰油酰胺丙基甜菜碱；胺氧化物，优选棕榈胺氧化物、月桂胺氧化物和通式R³N⁺O^-的胺氧化物，其中R³是C₈-C₁₈烷基、C₈-C₁₈烯基或C₈-C₁₈炔基；和卵磷脂。

29.根据权利要求23所述的方法、试剂盒或用途，其中所述API是蛋白API。

30.根据权利要求29所述的方法、试剂盒或用途，其中所述蛋白选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、激素、酶、融合蛋白、蛋白缀合物及其任意组合。

31.根据权利要求30所述的方法、试剂盒或用途，其中所述抗体片段选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链抗体及其任意组合。

32.根据权利要求30所述的方法、试剂盒或用途，其中所述抗体选自由以下组成的组：完全人抗体、抗个体基因型抗体、人源化抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、单克隆抗体、多克隆抗体及其任意组合。