CN107064359A - 度骨化醇注射液中含量的计算方法 - Google Patents

度骨化醇注射液中含量的计算方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种度骨化醇注射液中含量的计算方法：通过氢氧化钠水溶液对度骨化醇破坏生成度骨化醇前体和5,6‑反式度骨化醇，和既定色谱条件下度骨化醇和5,6‑反式度骨化醇响应因子,计算破坏前的度骨化醇标准品浓度，破坏后生成的5,6‑反式度骨化醇浓度、未破坏的度骨化醇浓度，可得破坏后度骨化醇前体浓度，根据破坏后度骨化醇前体峰面积，计算出前体响应因子，可得前体折算为度骨化醇的校正因子，在测试注射液含量时可直接将代入计算。该方法通过实践检验具有可操作性，且对度骨化醇转变为前体的程度没有要求，准确度高，简单方便，可实现对注射液中度骨化醇含量的有效控制。

Description

度骨化醇注射液中含量的计算方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别是一种度骨化醇注射液中含量的计算方法。
背景技术
度骨化醇注射液，商品名：HECTOROL，通用名：DOXERCALCIFEROL，分子式： C28H44O2，分子量：412.65，其结构式为：
度骨化醇注射液由美国GENZYME CORP(Sanofi)在2000年首次上市销售，适应症为“治疗继发性甲状旁腺功能亢进症”。目前，国内治疗慢性肾病导致继发性甲状旁腺功能亢进症的主流产品为阿法骨化醇和骨化三醇，已经上市有一段时间。近年来，很多临床研究发现度骨化醇在该适应症上更安全有效。度骨化醇在国外上市十几年，目前已被患者广泛接受。
度骨化醇目前国内还未上市，属于3.1类新药，没有公开的文献和质量标准可供参考。在配制度骨化醇注射液时，出现度骨化醇前体，在主峰前出峰，原料药中基本不存在，但是配成药液或原料药配成供试品检测时，此前体就会出现，并且随着放置时间延长而增大，待峰面积增大到25000左右，不再增长，后续基本维持在此水平不变。度骨化醇前体和度骨化醇的结构区别只是连接环己烷的2个双键的位置发生位移，度骨化醇属于维生素D衍生物，此类化合物一般都是主体和前体共存的状态。前体结构如下：
在计算度骨化醇注射液含量时，采用外标法，分别进样度骨化醇标准品和度骨化醇注射液供试品，通过两者的进样液浓度和峰面积，标准品的含量来计算出度骨化醇注射液的含量值，度骨化醇前体和度骨化醇进入人体后作用机制一致，且药效相当，因此应将度骨化醇前体定入注射液的含量中。但是基于度骨化醇标准品配成标准品溶液和度骨化醇注射液中均产生前体，且产生前体百分含量并不同步，因此不能用传统的外标法来计算注射液中的度骨化醇含量。但是度骨化醇注射液含量是必须控制的关键项目，直接决定药液质量的检测项，必须对其寻找出合适且合理的含量计算方法。
发明内容
提供了一种度骨化醇注射液中含量的计算方法。通过对度骨化醇原料药水溶液进行破坏，使其尽量转变为前体，在转变为前体的过程中，同时会有一部分原料转变为5,6-反式度骨化醇，通过5,6-反式度骨化醇标准品含量和峰面积计算出5,6-反式度骨化醇的响应因子，计算出破坏试验中度骨化醇转化为5,6-反式度骨化醇的量，因此可以算出度骨化醇转化为前体的量，结合前体的峰面积，得出前体的响应因子。根据现配现测的度骨化醇标准品溶液，WATERS液相该色谱条件下，度骨化醇峰面积一般在55～60万，这时前体含量非常低，峰面积在600以下基本可以忽略不计，计算出度骨化醇的响应因子，从而可以确定前体的响应因子，可知度骨化醇前体折算为度骨化醇的校正因子，这样在后续测试度骨化醇注射液含量时可以直接以此系数代入公式进行计算，最终得到度骨化醇注射液中的度骨化醇的有效浓度和度骨化醇注射液的有效含量。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种度骨化醇注射液中含量的计算方法，其包括如下步骤：
(A)取度骨化醇标准品和5,6-反式度骨化醇标准品，分别在溶剂中溶解成度骨化醇标准品溶液和5,6-反式度骨化醇标准品溶液并稀释后，采用高效液相色谱法分别测定度骨化醇峰面积和5,6-反式度骨化醇峰面积，并计算度骨化醇度骨化醇的响应因子(F度)和5,6-反式度骨化醇的响应因子(F反)；
(B)取度骨化醇标准品，在溶剂中溶解成度骨化醇标准品溶液后，加入氧氢化钠，于70～85℃下进行破坏反应，反应后将反应液稀释，采用高效液相色谱法分别测定反应液中度骨化醇、度骨化醇前体和5,6-反式度骨化醇峰面积，分别计算度骨化醇标准品溶液破坏前的度骨化醇浓度(C度前)、度骨化醇标准品溶液破坏后余留的度骨化醇浓度(C度后)、度骨化醇标准品溶液破坏后生成的5,6-反式度骨化醇浓度(C反后)，并计算度骨化醇前体的响应因子(F前)和度骨化醇前体折算为度骨化醇的校正因子(F校)；
(C)将度骨化醇注射液和稀释后的度骨化醇标准品溶液采用高效液相色谱法，分别测定度骨化醇标准品溶液中度骨化醇和度骨化醇前体的峰面积以及度骨化醇注射液中度骨化醇和度骨化醇前体的峰面积，由此计算度骨化醇注射液中的度骨化醇的有效浓度(C注效)和度骨化醇注射液的有效含量(％注含)。
5,6-反式度骨化醇的结构如下：
从度骨化醇、度骨化醇前体和5,6-反式度骨化醇的结构可见，1个度骨化醇分子可以转变为1个分子的度骨化醇前体或1个分子的5,6-反式度骨化醇，据此可知度骨化醇转变为度骨化醇和5,6-反式度骨化醇的浓度均为1.0。
本方法中步骤(A)、(B)或(C)中均采用高效液相色谱法，其色谱条件可采用现有的测定度骨化醇的条件。一种更优的灵敏度和准确度更好的液相色谱条件为：仪器：WATERS；色谱柱：Kinetex C18；检测波长：275nm；流速：1.2ml/min；柱温：30～35℃；运行时间：55min；流动相A：乙腈或甲醇，流动相B：水；洗脱梯度：0～10min：A(75％)： B(25％)；10～30min：A(85％)：B(15％)；30～45min：A(0％)：B(100％)；45～55min： A(75％)：B(25％)。
步骤(A)中，一种优选的方案为：取度骨化醇标准品和5,6-反式度骨化醇标准品分别于容量瓶中，加入溶液超声溶解，室温定容分别得到度骨化醇标准品溶液和5,6-反式度骨化醇标准品溶液；再分别稀释得到1.9～2.1ug/ml的溶液，取样采用高效液相色谱法分别测定度骨化醇峰面积和5,6-反式度骨化醇峰面积。
步骤(B)中，一种优选的方案为：取度骨化醇于容量瓶中，加入溶液超声溶解得到度骨化醇溶液，按每ml度骨化醇溶液0.01～0.016ml的加入量加入质量含量为0.05～0.20％氢氧化钠水溶液，室温后定容，于70～85℃下进行破坏反应2～4h；反应后将反应液取样稀释得到1.9～2.1ug/ml破坏后的度骨化醇溶液，取样采用高效液相色谱法分别测定反应液中度骨化醇、度骨化醇前体和5,6-反式度骨化醇峰面积；所述氢氧化钠水溶液的质量含量优选为0.10～0.15％；所述破坏反应的温度优选为75～80℃，时间优选为2.5～3h。
本发明中所采用的度骨化醇标准品或5,6-反式度骨化醇标准品为为法定标准品、商业标准品、工作标准品或杂质较少的原料。
度骨化醇标准品或5,6-反式度骨化醇标准品可以分别在0～5℃下用超声溶解。
本发明中溶解度骨化醇标准品、5,6-反式度骨化醇标准品的溶液选自甲醇、乙腈或两者混合溶剂，或者前述溶剂与水以任何比例混合的混合溶剂；所述度骨化醇标准品溶液为现测现配的溶液。
以下提供一种更具体的度骨化醇注射液中含量的计算方法，步骤如下：
(1)度骨化醇注射液含量采用WATERS液相通过外标法计算，色谱条件：KinetexC18；检测波长：275nm；流速：1.2ml/min；柱温：30～35℃；进样量：50μl；运行时间：55min。流动相A：乙腈或甲醇，流动相B：水；洗脱梯度：0～10min：A(75％)：B(25％)；10～30min： A(85％)：B(15％)；30～45min：A(0％)：B(100％)；45～55min：A(75％)：B(25％)。
(2)度骨化醇响应因子计算：称取一定量的度骨化醇标准品于棕色容量瓶中，加入80％体积的溶剂，冰水浴0℃超声10min，放至室温后再用溶液定容得到约100ug/ml度骨标准品储备液。再取该储备液2.0ml放于100ml棕色容量瓶中，再用溶液稀释定容至刻度，即得到约2ug/ml的度骨化醇标准品溶液，取此溶液50μl注入液相色谱仪中，测定度骨化醇标准品的峰面积：
F度＝C度/A度；
F度：度骨化醇的响应因子；
C度：度骨化醇的浓度；
A度：度骨化醇的峰面积。
(3)5,6-反式度骨化醇响应因子计算：称取一定量的5,6-反式度骨化醇标准品于棕色容量瓶中，加入80％体积的溶剂，冰水浴0℃超声10min，放至室温后再用溶液定容得到约100ug/ml 5,6-反式度骨标准品储备液。再取该储备液2.0ml于100ml棕色容量瓶中，再用溶液稀释定容至刻度，即得到约2ug/ml的5,6-反式度骨化醇标准品溶液，取此溶液50μl 注入液相色谱仪中，测定5,6-反式度骨化醇标准品的峰面积：
F反＝C反/A反；
F反：5,6-反式度骨化醇的响应因子；
C反：5,6-反式度骨化醇的浓度；
A反：5,6-反式度骨化醇的峰面积。
(4)破坏试验：取一定量的度骨化醇标准品于棕色容量瓶中，加入80％体积的溶剂，冰水浴约超声10min，加入0.05～0.20％氢氧化钠水溶液，加入量为每ml度骨化醇溶液加入0.01～0.016ml，放至室温后再用溶液定容，得到约100ug/ml标准品溶液，将此液体放在 70～85℃条件下破坏2～4h。再取该破坏溶液2.0ml放于100ml棕色容量瓶中，再用溶液稀释定容至刻度，即得到约2ug/ml破坏后的度骨化醇溶液，取此溶液50μl注入液相色谱仪中，测定度骨化醇、度骨化醇前体和5,6-反式度骨化醇的峰面积：
C度前＝M称*％标含/V；
C度后＝F度*A度后；
C反后＝F反*A反后；
F前＝(C度前-C度后-C反后)/A前；
F校＝F前/F度；
C度前：度骨化醇标准品溶液破坏前的度骨化醇浓度；
M称：度骨化醇标准品的称样量；
％标含：度骨化醇标准品的含量；
V：度骨化醇标准品的配液体积；
C度后：度骨化醇标准品溶液破坏后余留的度骨化醇浓度；
A度后：度骨化醇标准品溶液破坏后余留的度骨化醇峰面积；
C反后：度骨化醇标准品溶液破坏后生成的5,6-反式度骨化醇浓度；
A反后：度骨化醇标准品溶液破坏后生成的5,6-反式度骨化醇峰面积；
F前：度骨化醇前体的响应因子；
A前：度骨化醇标准品溶液破坏后生成的度骨化醇前体的峰面积；
F校：度骨化醇前体折算为度骨化醇的校正因子。
(5)度骨化醇注射液中含量的计算方法：取配制的度骨化醇标准品溶液50μl和按照处方配制的度骨化醇注射液50μl分别注入液相色谱仪中，测定标准品溶液中度骨化醇和度骨化醇前体的峰面积，注射液中度骨化醇和度骨化醇前体的峰面积，按照下面公式计算注射液中度骨化醇的含量：
C注效＝C标效*(A度注+F校*A前注)/(A度标+F校*A前标)；
％注含＝C注效/C样称*％样含；
C注效：度骨化醇注射液中的度骨化醇的有效浓度；
M标效：度骨化醇标准品溶液中度骨化醇的有效质量；
A度注：度骨化醇注射液中度骨化醇的峰面积；
A前注：度骨化醇注射液中度骨化醇前体的峰面积；
A度标：度骨化醇标准品溶液中度骨化醇的峰面积；
A前标：度骨化醇标准品溶液中度骨化醇前体的峰面积；
C样称：配制度骨化醇注射液时称取量折算的的度骨化醇浓度；
％样含：配制注射液的度骨化醇原料药含量；
％注含：度骨化醇注射液的含量。
在步骤(1)中，因现在没有相关的文件和资料可查询到度骨化醇的含量检测方法，通过大量的试验摸索出得出可行的用来测试度骨化醇含量的高效液相方法。后续的度骨化醇、度骨化醇前体和5,6-反式度骨化醇的响应因子均基于此色谱条件基础上计算出来。
在步骤(2)中通过测试度骨化醇的标准品配制溶液，需保证度骨化醇标准品溶液为现配现测，因为放置一段时间后标准品溶液中同样会出现度骨化醇前体，一旦出现度骨化醇前体，在没有确定前体的校正因子时，用这时的度骨化醇峰面积和配样的浓度计算出的度骨化醇峰响应因子将不准确，但是度骨化醇前体峰面积＜600，可以忽略不计，因为WATERS中2ug/ml度骨化醇溶液进样量50μl，主峰峰面积为55～60万，所以当前体的峰面积＜600，占0.1％，前体峰基本积分不起来，所以可不计，这时校正因子按照1.0来计算。度骨化醇的校正因子只能通过标注品来计算，因为其含量为已知数据。按照公式计算出度骨化醇在该液相色谱条件下的响应因子。
在步骤(2)、(3)和(4)中配制标准品储备液的溶剂为甲醇、乙腈或两者溶剂和水以任何比例混合的溶液。
在步骤(3)中通过测试5,6-反式度骨化醇标准品配制的溶液，5,6-反式度骨化醇在乙腈溶液中室温下较稳定，此时通过配制2ug/ml 5,6-反式度骨化醇，进样量50μl，因为是标准品，这时谱图中只有5,6-反式度骨化醇，没有度骨化醇和度骨化醇前体峰，通过测试出的5,6-反式度骨化醇峰面积、配液浓度和标准品的含量计算出5,6-反式度骨化醇在该色谱条件下的响应因子。
在步骤(4)中通过对度骨化醇标准品溶液进行破坏计算出度骨化醇前体相对于度骨化醇响应因子的校正系数。破坏试验：1mg/ml度骨化醇标准品溶液50ml液体中加入0.05％～0.20％氢氧化钠水溶液0.5～0.8mL，在70～85℃条件下破坏2～4h，约10～22％度骨化醇转化为度骨化醇前体和5,6-反式度骨化醇。其中氢氧化钠水溶液浓度为0.05％～0.20％，优选0.10～0.15％，破坏条件为70～85℃，2～4h；优选75～80℃，2.5～3h。
在步骤(4)中将破坏后的溶液同样配制成2ug/ml浓度，取50μl注入WATERS液相色谱仪中，此时破坏后的样品图谱中有度骨化醇峰，度骨化醇前体峰和5,6-反式度骨化醇峰，即在该条件下破坏度骨化醇只转变为度骨化醇前体峰和5,6-反式度骨化醇，结合步骤 (2)中得到的5,6-反式度骨化醇响应因子，计算出在该条件下度骨化醇转化为5,6-反式度骨化醇的量，根据度骨化醇降低的含量、转化为5,6-反式度骨化醇的量，计算出其中转化为度骨化醇前体的量，根据谱图中的度骨化醇前体峰面积，计算出度骨化醇前体的响应因子。
在步骤(4)中需要在规定的破坏条件下进行破坏，更温和的条件破坏出的度骨化醇前体和5,6-反式度骨化醇量较少，这样谱图中的峰面积较小，据此计算出的响应因子误差较大，条件更剧烈，度骨化醇不止会破坏出前体和5,6-反式度骨化醇，会出现其它杂质峰，这样其它杂质没有标准品无法定量，所以也就无法确定转变为度骨化醇前体的量。
在步骤(5)中按照度骨化醇注射液处方工艺配制度骨化醇注射液，此时度骨化醇原料药含量为已知数据，并且据此数据折算原料药量按照100％投料量来配制度骨化醇注射液，采用外标法通过液相分别测试度骨化醇标准品溶液和自行配制的度骨化醇注射液中度骨化醇和度骨化醇前体的峰面积。通过校正因子，将前体峰面积折算为度骨化醇峰面积，然后计算出注射液中度骨化醇的有效浓度，和投料浓度对比，得出注射液的含量，其中含量包括度骨化醇转变生成的前体的含量。
本发明针对实际中遇到的通过液相以外标法测试度骨化醇注射液含量时遇到的度骨化醇标准品溶液和注射液中度骨化醇会产生度骨化醇前体的问题，不能采用传统意义上的外标法简单的对比峰面积和称样量计算，通过使用0.05～0.20％氢氧化钠水溶液在70～85℃条件下对度骨化醇标准品(杂质尽可能少)进行破坏，使破坏的度骨化醇只生成度骨化醇前体和5,6-反式度骨化醇，通过计算得到度骨化醇前体和度骨化醇响应因子，从而可知度骨化醇前体折算为度骨化醇的校正因子，后续均可据此将标准品溶液和注射液中生产的度骨化醇前体峰面积折算为度骨化醇峰面积，然后可再通过外标法计算出度骨化醇注射液的含量。该方法通过实践检验具有可操作性，计算出的度骨化醇含量准确度高，重复性好，且对度骨化醇转变为前体的程度没有要求，得出校正因子后续直接代入计算即可，简单方便，从而可对注射液中度骨化醇含量的进行有效的控制。
具体实施方式
液相色谱条件为仪器：WATERS；色谱柱：Kinetex C18；检测波长：275nm；流速：1.2ml/min；柱温：30～35℃；运行时间：55min；流动相A：乙腈或甲醇，流动相B：水；洗脱梯度：0～10min：A(75％)：B(25％)；10～30min：A(85％)：B(15％)；30～45min： A(0％)：B(100％)；45～55min：A(75％)：B(25％)。
实施例1：
称取度骨化醇标准品(批号：DOS150224，含量99.9％)5.02mg于50ml棕色容量瓶中，加40ml乙腈，冰水浴超声10min，放至室温后再用乙腈定容得到度骨标准品储备液 (批号：NRD20150415)。取该储备液2.0ml于100ml棕色容量瓶中，乙腈稀释定容得到度骨化醇标准品溶液，取此溶液50μl注入液相色谱仪中，测出度骨化醇标准品的峰面积为586217，前体585，总计586802：
F度＝5.02mg*99.9％/50ml/50/586802＝0.342*10-5ug/ml。
称取5,6-反式度骨化醇标准品(批号：DTS150229，含量99.5％)5.10mg于50ml棕色容量瓶中，加40ml乙腈，冰水浴超声10min，放至室温后再用乙腈定容得到5,6-反式度骨标准品储备液。取该储备液2.0ml于100ml棕色容量瓶中，乙腈稀释定容得到5,6-反式度骨化醇标准品溶液，取此溶液50μl注入液相色谱仪中，测出5,6-反式度骨化醇标准品的峰面积为622564：
F反＝5.10mg*99.5％/50ml/50/622564＝0.325*10-5ug/ml。
取度骨化醇标准品(批号：DOS150224，含量99.9％)5.12mg于50ml棕色容量瓶中，加40ml乙腈，冰水浴超声10min，加入0.15％氢氧化钠水溶液0.6mL，放至室温后再用乙腈定容，将此液体放在74℃条件下破坏3.5h。再取该破坏溶液2.0ml于100ml棕色容量瓶中乙腈稀释定容得到破坏后的度骨化醇溶液，取此溶液50μl注入液相色谱仪中，测度骨化醇、度骨化醇前体和5,6-反式度骨化醇的峰面积分别为：507078、77493、12096：
C度前＝5.12mg*99.9％/50ml/50＝2.045ug/ml；
C度后＝0.342*10-5ug/ml*507078＝1.734ug/ml；
C反后＝0.325*10-5ug/ml*12096＝0.039ug/ml；
F前＝(2.045ug/ml-1.734ug/ml-0.039ug/ml)/77493＝0.351*10-5ug/ml；
F校＝(0.351*10-5ug/ml)/(0.342*10-5ug/ml)＝1.026。
称取10g聚山梨酯20、1.5g氯化钠、20mg二叔丁基对甲酚、14.4g七水磷酸氢二钠、1.8g一水磷酸二氢钠和1.1g乙二胺四乙酸二钠于1000ml容量瓶中，加入50ml 100％乙醇，再称取2.016mg度骨化醇原料药(批号：DOA140711，含量99.2％)然后加入注射用水溶解稀释定容得到度骨化醇注射液。取度骨标准品储备液(批号：NRD20150415)2.0ml于 100ml棕色容量瓶中，乙腈稀释定容得到度骨化醇标准品溶液，取度骨化醇注射液和标准品溶液各50μl分别注入液相色谱仪测试出度骨化醇注射液中度骨化醇和度骨化醇前体的峰面积分别为579693和21552；度骨化醇标准品溶液中度骨化醇和度骨化醇前体峰面积分别为：581075和17578：
C注效＝5.02mg*99.9％/50ml/50*(579693+1.026*21552)/(581075+1.026*17578)
＝1.997ug/ml
％注含＝(1.997ug/ml)/(2.016mg*99.2％)＝99.86％。
实施例2
取一批度骨化醇注射液，采用传统的外标法来计算注射液中的度骨化醇含量为93.5％，采用实施例1的方法计算总度骨化醇含量为96.7％。
计算过程：对照品溶液中度骨化醇浓度为1.991ug/ml，度骨化醇峰面积为306155，度骨化醇前体峰面积308；度骨化醇注射液中度骨化醇标示量为2ug/ml，度骨化醇峰面积为287658，度骨化醇前体峰面积10133。
采用传统的外标法来计算注射液中的度骨化醇含量：
％＝(287658*1.991ug/ml/306155)/2ug/ml＝93.5％
采用实施例1的方法计算总度骨化醇含量：
％＝[(287658+10133)*1.991ug/ml/(306155+308)]/2ug/ml＝96.7％
实施例3
采用传统的外标法来计算原研注射液(HECTOROL，批号：6R1002)近效期产品中的度骨化醇含量为91.8％，采用实施例1的方法计算总度骨化醇含量为95.2％。
计算过程：对照品溶液中度骨化醇浓度为1.991ug/ml，度骨化醇峰面积为306155，度骨化醇前体峰面积308；度骨化醇注射液中度骨化醇标示量为2ug/ml，度骨化醇峰面积为282386，度骨化醇前体峰面积10822。
采用传统的外标法来计算注射液中的度骨化醇含量：
％＝(282386*1.991ug/ml/306155)/2ug/ml＝91.8％
采用实施例1的方法计算总度骨化醇含量：
％＝[(282386+10822)*1.991ug/ml/(306155+308)]/2ug/ml＝95.2％
因为度骨化醇在溶液状态下会一定程度转化为度骨化醇前体，在采用对照品进行外标法计算注射液中度骨化醇含量时，由于对照品溶液是新鲜制备的，因此度骨化醇与前体之间的转化程度与注射液不一致，不可以按照传统的方式只以度骨化醇峰面积来计算，而应该以总度骨化醇(度骨化醇+度骨化醇前体)峰面积来计算注射液中总度骨化醇的含量。

Claims (10)

1.一种度骨化醇注射液中含量的计算方法，其特征在于包括如下步骤：
（A）取度骨化醇标准品和5,6-反式度骨化醇标准品，分别在溶剂中溶解成度骨化醇标准品溶液和5,6-反式度骨化醇标准品溶液并稀释后，采用高效液相色谱法分别测定度骨化醇峰面积和5,6-反式度骨化醇峰面积，并计算度骨化醇度骨化醇的响应因子和5,6-反式度骨化醇的响应因子；
（B）取度骨化醇标准品，在溶剂中溶解成度骨化醇标准品溶液后，加入氧氢化钠，于70~85℃下进行破坏反应，反应后将反应液稀释，采用高效液相色谱法分别测定反应液中度骨化醇、度骨化醇前体和5,6-反式度骨化醇峰面积，分别计算度骨化醇标准品溶液破坏前的度骨化醇浓度、度骨化醇标准品溶液破坏后余留的度骨化醇浓度、度骨化醇标准品溶液破坏后生成的5,6-反式度骨化醇浓度，并计算度骨化醇前体的响应因子和度骨化醇前体折算为度骨化醇的校正因子；
（C）将度骨化醇注射液和稀释后的度骨化醇标准品溶液采用高效液相色谱法，分别测定度骨化醇标准品溶液中度骨化醇和度骨化醇前体的峰面积以及度骨化醇注射液中度骨化醇和度骨化醇前体的峰面积，由此计算度骨化醇注射液中的度骨化醇的有效浓度和度骨化醇注射液的有效含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（A）中，度骨化醇度骨化醇的响应因子F度的计算方法为：
F度=C度/A度；
C度：度骨化醇的浓度；
A度：度骨化醇的峰面积。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（A）中，5,6-反式度骨化醇的响应因子F反的计算方法为：
F反=C反/A反；
C反：5,6-反式度骨化醇的浓度；
A反：5,6-反式度骨化醇的峰面积。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（B）中，度骨化醇标准品溶液破坏前的度骨化醇浓度C度前、度骨化醇标准品溶液破坏后余留的度骨化醇浓度C度后、度骨化醇标准品溶液破坏后生成的5,6-反式度骨化醇浓度C反后、度骨化醇前体的响应因子F前和度骨化醇前体折算为度骨化醇的校正因子F校的计算方法为：
C度前=M称*%标含/V；
C度后= F度* A度后；
C反后= F反* A反后；
F前=（C度前-C度后-C反后）/A前；
F校=F前/F度；
M称：度骨化醇标准品的称样量；
%标含：度骨化醇标准品的含量；
V：度骨化醇标准品的配液体积；
A度后：度骨化醇标准品溶液破坏后余留的度骨化醇峰面积；
A反后：度骨化醇标准品溶液破坏后生成的5,6-反式度骨化醇峰面积；
A前：度骨化醇标准品溶液破坏后生成的度骨化醇前体的峰面积。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（C）中，度骨化醇注射液中的度骨化醇的有效浓度C注效和度骨化醇注射液的有效含量%注含的计算方法为：
C注效= C标效*（A度注+F校*A前注）/（A度标+F校*A前标）；
%注含= C注效/ C样称*%样含；
M标效：度骨化醇标准品溶液中度骨化醇的有效质量；
A度注：度骨化醇注射液中度骨化醇的峰面积；
A前注：度骨化醇注射液中度骨化醇前体的峰面积；
A度标：度骨化醇标准品溶液中度骨化醇的峰面积；
A前标：度骨化醇标准品溶液中度骨化醇前体的峰面积；
C样称：配制度骨化醇注射液时称取量折算的的度骨化醇浓度；
%样含：配制注射液的度骨化醇原料药含量。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（A）、（B）或（C）中的液相色谱条件为：仪器：WATERS；色谱柱：Kinetex C18；检测波长：275nm；流速：1.2ml/min；柱温：30~35℃；运行时间：55min；流动相A：乙腈或甲醇，流动相B：水；洗脱梯度：0~10min：A（75%）：B（25%）；10~30min：A（85%）：B（15%）；30~45min：A（0%）：B（100%）；45~55min：A（75%）：B（25%）。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（A）中，取度骨化醇标准品和5,6-反式度骨化醇标准品分别于容量瓶中，加入溶液超声溶解，室温定容分别得到度骨化醇标准品溶液和5,6-反式度骨化醇标准品溶液；再分别稀释得到1.9～2.1ug/ml的溶液，取样采用高效液相色谱法分别测定度骨化醇峰面积和5,6-反式度骨化醇峰面积。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（B）中，取度骨化醇于容量瓶中，加入溶液超声溶解得到度骨化醇溶液，按每ml度骨化醇溶液0.01~0.016ml的加入量加入质量含量为0.05~0.20%氢氧化钠水溶液，室温后定容，于70~85℃下进行破坏反应2~4h；反应后将反应液取样稀释得到1.9～2.1ug/ml破坏后的度骨化醇溶液，取样采用高效液相色谱法分别测定反应液中度骨化醇、度骨化醇前体和5,6-反式度骨化醇峰面积；所述氢氧化钠水溶液的质量含量优选为0.10~0.15%；所述破坏反应的温度优选为75~80℃，时间优选为2.5~3h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述度骨化醇标准品或5,6-反式度骨化醇标准品为为法定标准品、商业标准品、工作标准品或杂质较少的原料；度骨化醇标准品或5,6-反式度骨化醇标准品分别在0~5℃下用超声溶解。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于溶解度骨化醇标准品、5,6-反式度骨化醇标准品的溶液选自甲醇、乙腈或两者混合溶剂，或者前述溶剂与水以任何比例混合的混合溶剂；所述度骨化醇标准品溶液为现测现配的溶液。
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