CN107022027B - Hiv-1广谱中和抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及HIV‑1广谱中和抗体，所述抗体特异性结合HIV‑1gp120。本发明还涉及所述抗体的制备方法和用途。
Description
技术领域
本发明涉及HIV-1广谱中和抗体，所述抗体特异性结合HIV-1gp120。本发明还涉及所述抗体的制备方法和用途。
背景技术
HIV-1中和抗体能够有效阻止HIV-1进入人的CD4+T细胞。因此，作为对HIV-1感染者的一种治疗手段，艾滋病研究领域一直在致力于开发强效的HIV-1广谱中和抗体。
最早通过噬菌体展示文库技术得到了单克隆抗体b12，但是仅能中约40％的已知HIV-1病毒[1]。从2010年开始，得益于单个B细胞分选和深度测序等技术的发展进步，已经从HIV-1感染者中分离出多种具有抗HIV-1广谱中和活性的人源单克隆抗体，如针对CD4结合位点的VRC01 [2]，针对可变区V1/V2和V3的PG9/PG16和PGT121[3,4]，针对近膜区(MPER，membrane proximal external region)的10E8抗体[5]和针对gp120-gp41交界处的35O22[6]等。
鉴于HIV-1存在多种进化枝且在世界范围内不同地区存在不同的主要流行株，组合应用两种或更多种广谱中和抗体显然是一种更具潜力的治疗策略。因此，艾滋病研究领域仍需要开发出新的强效广谱反应性HIV-1中和抗体。
发明内容
本发明提供特异性结合HIV-1gp120的人单克隆抗体及其功能性片段，所述抗体能够阻断HIV-1进入靶细胞。本发明还提供编码上述抗体或抗体片段的核酸分子以及包含至少一种上述核酸分子的表达载体。本发明还提供经至少一种上述核酸分子或表达载体转化的宿主细胞。本发 明还提供使用至少一种上述核酸分子或表达载体或宿主细胞来生产抗体的方法。本发明还提供包含至少一种上述抗体或抗体片段的药物组合物。在一些实施方式中，本发明的抗体的重链可变区包含分别相应于SEQ ID NO:2的氨基酸31-35、50-66和99-109的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。在一些实施方式中，本发明的抗体的轻链可变区包含分别相应于SEQ ID NO:4的氨基酸24-34、50-56和89-93的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在另一些实施方式中，本发明的抗体的轻链可变区包含分别相应于SEQ ID NO:6的氨基酸22-32、48-54和87-91的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在其他一些实施方式中，本发明的抗体的轻链可变区包含分别相应于SEQ ID NO:8的氨基酸24-34、50-56和89-93的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。本发明的抗体是特异性结合HIV-1gp120的广谱中和抗体。
本发明还提供检测人类对象的HIV-1感染的方法，包括使来自所述对象的生物学样品与本发明的抗体或抗体片段相接触，并确定所述样品中是否存在由所述抗体或所述抗体片段形成的免疫复合物，其中存在所述免疫复合物表明所述对象有HIV-1感染。在一些实施方式中，在进行所述接触之前将所述样品固定化于固相基材。在另一些实施方式中，在进行所述接触之前将所述抗体或抗体片段固定化于固相基材。在一些实施方式中，所述抗体或抗体片段标记了荧光标记、酶标记或放射性标记。在一些实施方式中，使用特异性结合所述抗体或抗体片段的第二抗体检测免疫复合物。在另一些实施方式中，使用特异性结合HIV-1的抗原的第二抗体检测免疫复合物。本发明还提供用于检测人类对象的HIV-1感染的试剂盒，其包含本发明的抗体或抗体片段。
本发明进一步提供预防或治疗人类对象的HIV-1感染的方法，包括给所述对象施用有效量的至少一种本发明的抗体或抗体片段或本发明的药物组合物。在一些实施方式中，所述对象患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。在一些实施方式中，还包括给所述对象施用至少一种抗HIV-1的抗病毒药物。
本发明也涉及本发明的抗体或抗体片段在制备用于检测人类对象的 HIV-1感染的试剂盒或用于预防或治疗人类对象的HIV-1感染的药物组合物中的用途。
附图说明
图1所示为本发明的单克隆抗体的结合能力，(A)为抗体DRVIA7结合gp140的能力，(B)为抗体DRVIA7结合gp120的能力，(C)为抗体DRVIA7H+gDRVI01-L57结合gp140的能力，和(D)为抗体DRVIA7H+gDRVI01-L40结合gp140的能力。
图2是抗体DRVIA7与gp120结合的示意图。
图3所示为DRVIA7+gp120复合物氨基酸残基依赖性能量评估。
图4是抗体DRVIA7轻链N端和CDRL1区与gp120的结合示意图。
图5所示为DRVIA7和VRC01的重链和轻链与相应的家系基因序列比对分析结果。
图6显示了抗体DRVIA7与VRC01-like抗体的晶体结构比较。
图7显示了对感染者体内抗体轻链基因库的相似性/差异度二维分析结果。
序列说明
SEQ ID NO:1是抗体DRVIA7重链可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是抗体DRVIA7重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是抗体DRVIA7轻链可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是抗体DRVIA7轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是轻链可变区gDRVI01-L57的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是轻链可变区gDRVI01-L57的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是轻链可变区gDRVI01-L40的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是轻链可变区gDRVI01-L40的氨基酸序列。
保藏信息
携带包含抗体DRVIA7的重链基因的表达载体的大肠杆菌(E.coli)于 2015年12月14日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.11879。
携带包含抗体DRVIA7的轻链基因的表达载体的大肠杆菌(E.coli)于2015年12月14日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.11880。
携带包含编码轻链可变区gDRVI01-L57的抗体轻链基因的表达载体的大肠杆菌(E.coli)于2015年12月14日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.11881。
携带包含编码轻链可变区gDRVI01-L40的抗体轻链基因的表达载体的大肠杆菌(E.coli)于2015年12月14日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.11882。
发明详述
本发明人从一名HIV-1中国流行株感染者体内分离得到了一种单克隆抗体，并发现其对多种HIV-1具有广谱中和活性，该抗体命名为DRVIA7。进一步地，本发明人基于抗体DRVIA7的重链，通过抗体轻链基因改造和抗体轻链基因库筛选技术，获得了更加强效的HIV-1广谱中和抗体。本发明的抗体能够阻断多种HIV-1进入靶细胞。
在一方面，本发明提供分离的人单克隆抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别相应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中所含的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，其中所述抗体是特异性结合HIV-1gp120的中和抗体。
在一些实施方式中，所述重链可变区包含分别相应于SEQ ID NO:2的氨基酸31-35、50-66和99-109的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。
在本文中，当涉及本发明的抗体时，“重链可变区包含相应于所述SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中所含的VHCDR1的VHCDR1”这一表述是指该抗体重链可变区中的VHCDR1与所述SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中所含的VHCDR1具有相同的氨基酸序列。例如，依据Kabat命名法，抗体DRVIA7的VHCDR1由如SEQ ID NO:2所示重链可变区的第31-35位氨基酸(SSFIH)组成，则上述表述指的是本发明的抗体的重链可变区的 VHCDR1由SSFIH组成。
在本文中，VHCDR、HCDR和CDRH具有同样的含义，指的是抗体重链可变区的互补决定簇，可互换使用。
在一些实施方式中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或与SEQID NO:2具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列，或者所述重链可变区由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，所述重链可变区包含与SEQID NO:2具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列相同性的氨基酸序列。在一些优选的实施方式中，所述重链可变区包含表1中所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。
在一些实施方式中，所述轻链可变区包含：
(i)分别相应于SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中所含的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；
(ii)分别相应于SEQ ID NO:6所示氨基酸序列中所含的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；或
(iii)分别相应于SEQ ID NO:8所示氨基酸序列中所含的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
在一些实施方式中，所述轻链可变区包含：
(i)分别相应于SEQ ID NO:4的氨基酸24-34、50-56和89-93的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；
(ii)分别相应于SEQ ID NO:6的氨基酸22-32、48-54和87-91的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；或
(iii)分别相应于SEQ ID NO:8的氨基酸24-34、50-56和89-93的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
在本文中，当涉及本发明的抗体时，“轻链可变区包含相应于所述SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中所含的VLCDR1的VLCDR1”这一表述是指该抗体轻链可变区中的VLCDR1与所述SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中所含的VLCDR1具有相同的氨基酸序列。例如，依据Kabat命名法，抗体DRVIA7的VLCDR1由如SEQ ID NO:4所示轻链可变区的第22-32位氨基酸(RASQRIDNWVA)组成，则上述表述指的是本发明的抗体的轻链可变区的VLCDR1由RASQRIDNWVA组成。
在本文中，VLCDR、LCDR和CDRL具有同样的含义，指的是抗体轻链可变区的互补决定簇，可互换使用。
在另一些实施方式中，所述轻链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：(i)SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列；和(iii)SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少85％、至少90％、 至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:4、SEQID NO:6或SEQ ID NO:8具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列相同性的氨基酸序列。在一些优选的实施方式中，所述轻链可变区包含表1中所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
本发明还提供分离的抗体，其中所述抗体特异性结合HIV-1gp120上由前述本发明的抗体所识别的表位。
本发明还提供分离的抗体，其中所述抗体与前述本发明的抗体竞争结合HIV-1gp120上的表位。
在一些实施方式中，本发明的抗体是IgG。在另一些实施方式中，本发明的抗体是IgM。在其他一些实施方式中，本发明的抗体是IgA。
本发明进一步提供分离的抗体片段，其是前述本发明的抗体的功能性片段，其能够特异性结合HIV-1gp120。在一些实施方式中，本发明的抗体片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、单链Fv蛋白(scFv)和二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)。优选地，本发明的抗体片段对多种HIV-1具有广谱中和活性。
本发明还提供分离的多肽，所述多肽是免疫球蛋白重链可变区或轻链可变区，其可用于构建特异性结合HIV-1gp120并对HIV-1具有广谱中和活性的抗体。在一些实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白重链可变区，其包含分别相应于SEQ ID NO:2的氨基酸31-35、50-66和99-109的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。在另一些实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白重链可变区，其包含与SEQ ID NO:2具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白轻链可变区，其包含分别相应于SEQ ID NO:4的氨基酸24-34、50-56和89-93的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在另一些实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:4具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽是免 疫球蛋白轻链可变区，其包含分别相应于SEQ ID NO:6的氨基酸22-32、48-54和87-91的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在另一些实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白轻链可变区，其包含与SEQID NO:6具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白轻链可变区，其包含分别相应于SEQ ID NO:8的氨基酸24-34、50-56和89-93的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在另一些实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:8具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列相同性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供分离的核酸分子，其编码前述本发明的抗体或抗体片段或多肽。在具体实施方式中，本发明的核酸分子包含SEQ ID NO:1所示的编码重链可变区的核苷酸序列。在其他一些具体实施方式中，本发明的核酸分子包含SEQ ID NO:3、5或7所示的编码轻链可变区的核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的核酸分子可操作地连接至启动子。
本发明还提供表达载体，其包含至少一种前述本发明的核酸分子。
本发明还提供分离的宿主细胞，其由至少一种前述本发明的核酸分子或表达载体转化。
在另一方面，本发明提供生产抗体的方法，包括：
(i)用前述至少一种本发明的核酸分子或表达载体转化宿主细胞，
(ii)在适合所述核酸分子或表达载体表达的情况下培养所述转化的宿主细胞，和
(iii)分离并纯化由所述核酸分子或表达载体所表达的抗体或抗体片段。
本发明还涉及通过上述本发明的方法而获得的分离的抗体或抗体片段，其能够特异性结合HIV-1gp120。优选地，通过上述本发明的方法而获得的分离的抗体或抗体片段对多种HIV-1具有广谱中和活性。
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含至少一种前述本发明 的抗体或抗体片段，以及可药用载体。
在另一方面，本发明提供检测人类对象的HIV-1感染的方法，包括：
(i)使来自所述对象的生物学样品与前述本发明的抗体或抗体片段相接触，并且
(ii)确定所述样品中是否存在由所述抗体或所述抗体片段形成的免疫复合物，
其中存在所述免疫复合物表明所述对象有HIV-1感染。
在本发明的检测人类对象的HIV-1感染的方法的一些实施方式中，在步骤(i)中，所述样品固定化于固相基材，且所述接触包括将所述抗体或抗体片段加至固定化有所述样品的固相基材。在一些实施方式中，所述抗体或抗体片段标记了荧光标记、酶标记或放射性标记。在另一些实施方式中，在步骤(ii)中，使所述固相基材与特异性结合所述抗体或抗体片段的第一结合配偶体相接触。在一些实施方式中，所述第一结合配偶体是特异性结合所述抗体或抗体片段的第二抗体。
在本发明的检测人类对象的HIV-1感染的方法的另一些实施方式中，在步骤(i)中，所述抗体或抗体片段固定化于固相基材，且所述接触包括将所述样品加至固定化有所述抗体或抗体片段的固相基材。在一些实施方式中，在步骤(ii)中，使所述固相基材与特异性结合HIV-1的抗原的第二结合配偶体相接触。在一些实施方式中，所述第二结合配偶体是特异性结合HIV-1的抗原的第二抗体。在一些实施方式中，所述第二抗体特异性结合HIV-1gp120。在一些实施方式中，所述抗体或抗体片段与所述特异性结合HIV-1抗原的第二抗体结合HIV-1抗原上的不同表位。
在本发明的检测人类对象的HIV-1感染的方法的一些实施方式中，来自所述对象的生物学样品是全血、血浆、血清、血细胞或血细胞裂解物。
在本发明的检测人类对象的HIV-1感染的方法的一些实施方式中，来自所述对象的生物学样品含有血细胞，且其中所述方法进一步包括在步骤(i)之前、过程中或之后，将所述生物学样品与特异性结合所述血细胞的第三结合配偶体相接触。在一些实施方式中，所述第三结合配偶体 是特异性结合所述血细胞的抗体。在一些具体的实施方式中，所述血细胞是淋巴细胞，例如T细胞，例如CD4+T细胞。在另一些具体的实施方式中，所述血细胞是单核细胞。在一些具体的实施方式中，所述第三结合配偶体是特异性结合所述血细胞上的特征性标记物的抗体。
在另一方面，本发明涉及前述本发明的抗体或抗体片段在制备用于检测人类对象的HIV-1感染的试剂盒中的用途。
在另一方面，本发明还提供用于检测人类对象的HIV-1感染的试剂盒，其包含前述本发明的抗体或抗体片段。
在另一方面，本发明还提供预防或治疗人类对象的HIV-1感染的方法，包括给所述对象施用有效量的至少一种前述本发明的抗体或抗体片段或本发明的药物组合物。在一些实施方式中，所述对象患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括给所述对象施用至少一种抗HIV-1的抗病毒药物。
在另一方面，本发明还涉及前述本发明的抗体或抗体片段在制备用于预防或治疗人类对象的HIV-1感染的药物组合物中的用途。在一些实施方式中，所述对象患有AIDS。
以下实施例用于阐述本发明，其无意于以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：广谱中和抗体DRVIA7的鉴定
从中国HIV-1感染者体内分离得到抗体DRVIA7
发明人从一个中国HIV-1感染者的样品中分离得到了一株单克隆抗体。经鉴定，该抗体对多种HIV-1具有广谱中和性，命名为DRVIA7。携带包含抗体DRVIA7的重链基因的表达载体(DRVIA7H)和轻链基因的表达载体(DRVIA7L)的大肠杆菌分别以保藏号CGMCCNo.11879和CGMCC No.11880保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。DRVIA7H中所含重链可变区的编码序列为SEQ ID NO:1，其编码的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。DRVIA7L中所含轻链可变区的编码序列为SEQ ID NO:3，其编码的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
DRVIA7抗体的表达和纯化
将携带重链表达载体DRVIA7H的大肠杆菌和轻链表达载体DRVIA7L的大肠杆菌，分别接种于100ml含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基(Amersham公司产品)中，37℃，200rpm振荡培养16小时。利用Omega公司的Plasmid Midi Kit试剂盒提取表达载体质粒。利用PEI转染试剂(Polysciences公司产品)以等量的重链和轻链表达载体共转染293F细胞，8％CO2，37℃培养6天。利用Protein A亲和柱(GE health公司产品)纯化得到抗体DRVIA7。利用NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo公司产品)测定抗体浓度，4℃放置待检测。
DRVIA7抗体的结合能力
通过ELISA方法测定了抗体的结合能力。将抗原蛋白CN54gp140(CN54亚型gp140蛋白)、WT YU2gp120(野生型YU2亚型gp120蛋白)和T278G YU2gp120(T278G点突变YU2亚型gp120蛋白)用PBS稀释至2μg/ml，每孔100μl包被于96孔ELISA板中(Corning Costar公司产品)，4℃过夜。用PBS-T溶液(0.05％吐温-20)洗板5次；每孔加入250μl封闭液(PBS，2％BSA+5％脱脂奶粉)室温封闭1小时。PBS-T洗板3次。将抗体DRVIA7以10μg/ml为起始浓度，用封闭液进行5倍系列稀释，分别取100μl样本加入到ELISA板中，37℃孵育1小时。PBS-T洗板5次。每孔加入100μl用封闭液1:5000稀释后的辣根酶标记的山羊抗人IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司产品)，37℃孵育1小时。PBS-T洗板5次。加入TMB显色底物(北京金豪制药股份有限公司产品)100μl，室温避光显色20分钟。每孔直接加入50μl终止液(北京金豪制药股份有限公司产品)终止反应，酶标仪读取450nm和630nm波长的吸光度值(OD)。结果如图1显示，单克隆抗体DRVIA7特异性结合gp140抗原蛋 白(图1A)以及野生型和突变的gp120抗原蛋白(图1B)。
DRVIA7抗体的中和能力
通过TZM-bl/假病毒中和实验[7]测定了抗体的中和能力。用DMEM生长培养基(Hyclone公司产品)将抗体DRVIA7梯度系列稀释，100μl稀释好的抗体和50μl含有200TCID50的假病毒加入96孔平底培养板中，5％CO2，37℃孵育1小时。将含有1×104个TZM-bl细胞和11μg/ml DEAE-dextran(Sigma公司产品)的细胞液加入96孔板中，同时设置细胞对照(只含TZM-bl细胞)和病毒对照(只含TZM-bl细胞和假病毒)，5％CO237℃培养48小时。利用Bright-Glo luciferase reagent试剂盒(Promega公司产品)检测荧光素酶反应，计算50％抑制剂量。如表2A和表2B所示，DRVIA7抗体可以中和不同亚型的HIV-1病毒，为广谱中和抗体。
DRVIA7抗体的晶体结构
通过X射线晶体衍射，解析了未结合型DRVIA7抗体和 DRVIA7+gp120复合物的晶体结构，具体结构参数如表3所示。图2显示了DRVIA7抗体与HIV-1gp120结合的结构示意图。
表3.X射线晶体学数据收集和细化统计分析
a插入的数字指的是最高分辨率。
b计算方法为平均值(I)/平均值(σI)。
cRsym＝ΣhklΣi|Ihkl,i-<Ihkl>|/ΣhklΣiIhkl,I,其中Ihkl,i是反射h,k,l的ith测定的成比例强度,<Ihkl>是反射的平均强度,n是冗余度.Rpim是一种冗余度非依赖的强度测量方法.Rpim＝Σhkl(1/(n-1))1/2Σi|Ihkl,i-<Ihkl>|/ΣhklΣiIhkl,I,其中Ihkl,i是反射h,k,l的ith测定的成比例强度,<Ihkl>是反射的平均强度,n是冗余度。
dRcryst＝Σhkl|Fo-Fc|/Σhkl|Fo|x 100
eRfree被计算成Rcryst,但是在一个测试组上包含了5％的细化统计排除的数据。
f这些数值使用MolProbity数据库计算得出(http:// molprobity.biochem.duke.edu/)。
实施例2：改造的抗体DRVIA7H+gDRVI01-L57
基于氨基酸残基的能量评估
发明人对DRVIA7+gp120形成的复合物进行了基于氨基酸残基的能量评估(residue-based energy evaluation)[8]。如图3所示，发现在DRVIA7轻链可变区的N端、CDRL1区和CDRL3区可能存在干扰DRVIA7与gp120结合的结构冲突。
改造的轻链可变区gDRVI01-L57
基于这一发现，发明人对DRVIA7的轻链进行了系列的改造。对CDRL1区进行了多种改造，但是抗体的中和能力并未有显著提高。然而，当删除DRVIA7轻链可变区N端两个氨基酸后，发现改造抗体的结合能力和中和宽度均有大幅度提高，将改造后的抗体轻链可变区命名为gDRVI01-L57。携带包含编码轻链可变区gDRVI01-L57的抗体轻链基因的表达载体(gDRVI01-L57)的大肠杆菌以保藏号CGMCC No.11881保藏于CGMCC。轻链表达载体gDRVI01-L57中所含轻链可变区编码序列为SEQ ID NO:5，其编码的轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:6。
抗体DRVIA7H+gDRVI01-L57结合能力
使用携带重链表达载体DRVIA7H的大肠杆菌和轻链表达载体gDRVI01-L57的大肠杆菌，按照与实施例1类似的方法进行抗体表达和纯化，获得了抗体DRVIA7H+gDRVI01-L57。按照与实施例1类似的方法，通过ELISA方法测定抗体DRVIA7H+gDRVI01-L57的结合能力。结果如图1C所示，抗体DRVIA7H+gDRVI01-L57与CN54GP140的结合能力较抗体DRVIA7明显提高。
抗体DRVIA7H+gDRVI01-L57中和能力
按照与实施例1类似的方法，通过TZM-bl/假病毒中和实验测定抗体的中和能力。结果如表2A和表2B所示，抗体DRVIA7H+gDRVI01-L57 对所测试的全球假病毒组和病毒免疫室假病毒组的中和宽度较抗体DRVIA7显著提高。
为了进一步探讨抗体DRVIA7H+gDRVI01-L57中和能力提高的机制，发明人分析了DRVIA7抗体轻链N端(LC-Nt)和CDRL1区与gp120的结合。如图4所示，发明人发现野生型DRVIA7抗体轻链的N端与gp120上的N461糖基化位点非常接近。鉴于N联糖基化位点有利于病毒逃逸中和，因此删除N端两个氨基酸后，可能有助于避免N461糖基化位点对抗体与gp120结合的影响，而这可能有利于抗体中和病毒。
实施例3：通过筛选抗体轻链基因库获得抗体DRVIA7H+gDRVI01-L40
DRVIA7抗体序列分析
如图5所示，利用抗体基因分析数据库IMGT V-QEST server(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest？livret＝0&Option＝humanIg)分析了DRVIA7抗体基因。DRVIA7抗体重链属于IgHV1-02*02家系，CDRH3为11个氨基酸(Kabat命名法)。轻链属于IgKV1-5*03家系，CDRL3为5个氨基酸。与VRC01抗体[1]比较发现，DRVIA7抗体与VRC01抗体使用了相同的重链家系基因，同时轻链CDRL3的长度与VRC01相同，揭示了DRVIA7抗体可能属于VRC01-like抗体。
DRVIA7与VRC01-like抗体的结构比较分析
实施例1中解析了DRVIA7抗体的晶体结构。通过与已发表的四种VRC01-like抗体VRC01(PDBID:3NGB)、VRC03(PDBID:3SE8)、PG04(PDBID:3SE9)和12A21(PDBID:4JPW)的结构比对发现，DRVIA7抗体结构与之非常相似(图6)，可能属于VRC01-like抗体。
建立感染者的抗体轻链基因库
利用自其分离到抗体DRVIA7的HIV-1感染者的血液样品，通过深 度测序技术建立了该感染者体内的抗体轻链基因库，发现该感染者体内存在大量的DRVIA7-like轻链基因。根据序列比较发现VRC01-like抗体轻链具有共同特征。根据VRC01-like抗体的CDRL3的特征(包括长度为5个氨基酸、第三个残基是疏水性的和第4为是氨基酸Q或者E)自抗体轻链基因库中筛选轻链。如图7所示，得到了703条具备VRC01-like抗体CDRL3特征的轻链(蓝色表示)，最终验证了22条候选轻链(红色表示)。
抗体DRVIA7H+gDRVI01-L40
通过将上述22条候选轻链与DRVIA7抗体重链分别配对，并按照与实施例1类似的方法进行抗体表达和纯化，制备了一系列抗体，并对其进行了结合与中和能力的测定，最终鉴定得到了轻链可变区gDRVI01-L40。由包含gDRVI01-L40的轻链与DRVIA7抗体的重链配对产生的抗体DRVIA7H+gDRVI01-L40较DRVIA7显示出更强的CN54GP140结合能力(图1D)和中和能力(表2A和表2B)。携带包含编码轻链可变区gDRVI01-L40的抗体轻链基因的表达载体(gDRVI01-L40)的大肠杆菌以保藏号CGMCC No.11882保藏于CGMCC。轻链表达载体gDRVI01-L40中所含轻链可变区编码序列为SEQ ID NO:7，其编码的轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:8。
尽管参照具体实施方式描述了本发明，但应该理解的是，这些实施方式仅仅是用于举例阐述本发明的应用原则。在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对其做出各种改变。
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Claims (29)
1.分离的人单克隆抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中所含的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3组成的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分别由SEQ ID NO:2的氨基酸31-35、50-66和99-109组成，
所述轻链可变区包含：
(i)分别由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中所含的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3组成的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别由SEQ ID NO:4的氨基酸24-34、50-56和89-93组成；
(ii)分别由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列中所含的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3组成的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别由SEQ ID NO:6的氨基酸22-32、48-54和87-91组成；或
(iii)分别由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列中所含的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3组成的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别由SEQ ID NO:8的氨基酸24-34、50-56和89-93组成，
并且其中所述抗体是特异性结合HIV-1gp120的中和抗体。
2.权利要求1的抗体，其中所述重链可变区由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述轻链可变区由以下组成：
(i)SEQ ID NO:4所示氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:6所示氨基酸序列；或
(iii)SEQ ID NO:8所示氨基酸序列。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体是IgG、IgM或IgA。
5.分离的抗体片段，其是权利要求1的抗体的功能性片段。
6.权利要求5的抗体片段，其选自Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、单链Fv蛋白(scFv)和二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)。
7.分离的核酸分子，其编码权利要求1的抗体或抗体片段。
8.权利要求7的核酸分子，其由SEQ ID NO:1所示的编码重链可变区的核苷酸序列组成。
9.权利要求7或8的核酸分子，其由SEQ ID NO:3、5或7所示的编码轻链可变区的核苷酸序列组成。
10.权利要求7的核酸分子，其可操作地连接至启动子。
11.一种表达载体，包含至少一种权利要求7的核酸分子。
12.一种分离的宿主细胞，由至少一种权利要求7的核酸分子或权利要求11的表达载体转化。
13.生产抗体的方法，包括：
(i)用至少一种权利要求7的核酸分子或权利要求11的表达载体转化宿主细胞，
(ii)在适合所述核酸分子或表达载体表达的情况下培养所述转化的宿主细胞，和
(iii)分离并纯化由所述核酸分子或表达载体所表达的抗体或抗体片段。
14.分离的抗体或抗体片段，其通过权利要求13的方法而获得。
15.药物组合物，包含权利要求1的抗体或权利要求14的抗体或抗体片段中的至少一种，以及可药用载体。
16.权利要求1的抗体或权利要求14的抗体或抗体片段在制备用于检测人类对象的HIV-1感染的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于以包括以下步骤的方法检测人类对象的HIV-1感染：
(i)使来自所述对象的生物学样品与权利要求1或14的抗体或抗体片段相接触，并且
(ii)确定所述样品中是否存在由所述抗体或所述抗体片段形成的免疫复合物，
其中存在所述免疫复合物表明所述对象有HIV-1感染。
17.权利要求16的用途，其中在步骤(i)中，所述样品固定化于固相基材，且所述接触包括将所述抗体或抗体片段加至固定化有所述样品的固相基材。
18.权利要求16的用途，其中所述抗体或抗体片段标记了荧光标记、酶标记或放射性标记。
19.权利要求17的用途，其中在步骤(ii)中，使所述固相基材与特异性结合所述抗体或抗体片段的第一结合配偶体相接触。
20.权利要求19的用途，其中所述第一结合配偶体是特异性结合所述抗体或抗体片段的第二抗体。
21.权利要求16的用途，其中在步骤(i)中，所述抗体或抗体片段固定化于固相基材，且所述接触包括将所述样品加至固定化有所述抗体或抗体片段的固相基材。
22.权利要求21的用途，其中在步骤(ii)中，使所述固相基材与特异性结合HIV-1的抗原的第二结合配偶体相接触。
23.权利要求22的用途，其中所述第二结合配偶体是特异性结合HIV-1的抗原的第二抗体。
24.权利要求23的用途，其中所述抗体或抗体片段与所述特异性结合HIV-1抗原的第二抗体结合HIV-1抗原上的不同表位。
25.权利要求16的用途，其中来自所述对象的生物学样品是全血、血浆、血清、血细胞或血细胞裂解物。
26.权利要求16的用途，其中来自所述对象的生物学样品含有血细胞，且其中所述方法进一步包括在步骤(i)之前、过程中或之后，将所述生物学样品与特异性结合所述血细胞的第三结合配偶体相接触。
27.权利要26的用途，其中所述第三结合配偶体是特异性结合所述血细胞的抗体。
28.权利要求1的抗体或权利要求14的抗体或抗体片段在制备用于预防或治疗人类对象的HIV-1感染的药物组合物中的用途。
29.权利要求28的用途，其中所述对象患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
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