CN107022018A - 检测胰岛素抵抗的质谱模型及构建方法 - Google Patents

检测胰岛素抵抗的质谱模型及构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胰岛素抵抗筛查的方法，该方法基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪采用弱阳离子结合表面（WCX）芯片检测胰岛素抵抗相关的血清多肽，通过统计模型建立的诊断模型。发明内容具体包括：样品前处理的方法与质谱检测到的12条用于建模与判别诊断的血清多肽，以及基于其中3条多肽及12条多肽分别建立的判别模型。该方法操作简单，准确性高，为胰岛素抵抗筛查提供了新的思路。

Description

检测胰岛素抵抗的质谱模型及构建方法
技术领域
本发明涉及胰岛素抵抗检测领域，具体是通过研究比较胰岛素抵抗与正常人群的血清多肽谱，得到与胰岛素抵抗相关的多肽谱库，为胰岛素抵抗的临床诊断提供了丰富的分子靶标。
背景技术
胰岛素抵抗( insulin resistance， IR)即指一定量的胰岛素与其特异性受体结合后所产生的生物效应低于正常。表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖摄取减少及胰岛素抑制肝葡萄糖输出的作用减弱，是肥胖、高血压、糖尿病及动脉粥样硬化等多种疾病的共同危险因素和基础。由于胰岛素抵抗参与了众多疾病的形成，并为机体带来了严重的后果，例如，导致胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗易导致代谢综合征和2型糖尿病。50年代Yallow等应用放射免疫分析技术测定血浆胰岛素浓度，发现血浆胰岛素水平较低的病人胰岛素敏感性较高，而血浆胰岛素较高的人对胰岛素不敏感，由此提出了胰岛素抵抗的概念。
胰岛素抵抗发生在2型糖尿病发病之前，并贯穿于2型糖尿病的整个过程。在发病前，注重胰岛素抵抗的改善可效遏制2型糖尿病的发生和发展。胰岛素抵抗发生的本质是能量过剩，当人体摄入的热卡超过人体的生理需要，过多的热量储存在脂肪、肝脏、肌肉中，导致这些组织对胰岛素不敏感，而产生胰岛素抵抗，胰岛B细胞为了克服胰岛素抵抗需要分泌更多的胰岛素，过多时到了胰岛素抵抗的晚期，胰岛功能衰竭，不能分泌出正常量的胰岛素，胰岛B细胞的长期的超负荷工作使其功能逐渐衰竭，而发生糖尿病。所以抑制能量过剩，才是遏制胰岛素抵抗发生的根本。如何才能抑制能量过剩呢？最简单的方法就是少吃，多运动！平时多摄入低热卡的食物（如蔬菜、菇类、魔芋等），避免高热卡食物（啤酒、饮料、坚果、动物油等）。同时可以使用抑制食欲的降糖药物如诺和力、百泌达等。
目前胰岛素抵抗检测方法有正常血糖高胰岛素钳技术、胰岛素耐量试验、微小模型计算公式、空腹胰岛素、空腹血糖/空腹胰岛素等。正常血糖高胰岛素钳技术是目前公认的检测胰岛素抵抗的方法，并被认为是评价其他检测胰岛素抵抗方法的金标准（刘建雷等，小鼠扩展胰岛素钳夹术中糖代谢的变化，《中国糖尿病杂志》，2008年第6期；司晓晨等，胰岛素钳试验评定两种胰岛素抵抗大鼠模型，《南京中医药大学学报》，2003年11月第19卷第6期）。该方法主要包括：采用胰岛素钳夹术处理动物或患者血管，以放射性葡萄糖作为示踪剂，定期取血样监测体内糖代谢的动态改变。但该方法存在取血次数太多、费用昂贵、费时等局限性，不适用于常规临床检测。微小模型计算公式也存在上述局限性。
胰岛素耐量试验（王军，改良胰岛素耐量试验在2型糖尿病中的应用，《山东医药》，2002年第11期），纠正了胰岛素缺乏对胰岛素敏感性测定的影响，但如存在低血糖的风险，则会夸大机体的胰岛素敏感性。空腹胰岛素、空腹血糖/空腹胰岛素方法，对于糖尿病人的检测会受到限制，仅适用于非糖尿病人。由此可见，目前尚缺乏能早期筛查比较适用于临床检测胰岛素抵抗的技术方法。
目前，逐渐出现了质谱技术来监测胰岛素抵抗的生物标志物，例如罗天杰（PACAP衍生多肽RDB的高效制备及其改善胰岛素抵抗作用的初步研究，《药物生物技术》，2013）利用重叠延伸PCR法合成促胰液素/胰高血糖素/血管活性肠肽(VIP)家族中的新成员PACAP，并通过ESI-MASS技术检测了Mt为3990k的特征多肽即为所重组表达的PACAP。但该方法只是使用质谱技术验证所克隆边导的多肽标志物，并不涉及直接使用质谱技术检测与胰岛素抵抗的相关标志物。
中国专利申请CN201080024021（与胰岛素抵抗有关的生物标记和使用该生物标记的方法）和CN200880012978（糖尿病状况的代谢标志物及其使用方法）公开了一种利用包括质谱技术在内的多种检测技术，对来自患者的体液或组织液中的代谢标志物（如脂质代谢物）进行检测，该方法可用于诸如诊断和监测胰岛素抵抗、前期糖尿病或对可改变糖尿病状况的药物的反应。然而，该发明罗列了大量的已知的、可能或潜在的代谢标志物，同时所述质谱法只是涉及通过分馏或过柱出峰来检测蛋白组分的质谱技术（例如层析法、HPLC、色谱法），因此能否用于临床检测还有待验证。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是一种软电离生物质谱，由离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)两部分组成。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。国内迄今为止尚无采用MALDI-TOF-MS技术获得检测胰岛素抵抗多肽标志物的报道。
发明内容
本发明的目的是建立一种对胰岛素抵抗多肽标志物的检测技术，提出一种用于检测胰岛素抵抗特征多肽的质谱模型及其制备方法。
本发明的第一个目的是提供一种用于检测胰岛素抵抗的血清多肽标志物组合，由具有质荷比2579.8 m/z, 2878.2 m/z, 2938.1 m/z 的多肽组成，其中所述多肽序列如下所示：
SEQ ID No.1：NVHSGSTFFKYYLQGAKIPKPEA，2579.8 m/z
SEQ ID No.2：MADEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV，2878.2 m/z
SEQ ID No.3：VVDPDAPPSPPLGAPGLPPAGSPPDSHVLLA，2938.1 m/z
在一个实施方案中，上述多肽标志物组合由所述具有质荷比2579.8m/z、2878.2m/z、2938.1m/z的多肽，以及具有质荷比1887.9m/z、1896.1m/z、2595.4m/z、3236.3m/z、4443m/z、5873.8m/z、8889.5m/z、8943.8m/z、8953.1m/z，共12条多肽组成。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测胰岛素抵抗特征多肽的质谱模型，该模型包括由SEQ ID No.1-3所述的特征多肽组成。
在一个实施方案中，所述特征多肽质荷比分别为2579.8 m/z, 2878.2 m/z,2938.1 m/z。
在另一实施方案中，所述质谱模型中的特征多肽由所述2579.8 m/z, 2878.2 m/z, 2938.1 m/z 的多肽，以及1887.9m/z, 1896.1 m/z, 2595.4 m/z, 3236.3 m/z, 4443m/z, 5873.8 m/z, 8889.5 m/z, 8943.8 m/z, 8953.1m/z ，共12条多肽组成。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测胰岛素抵抗人群的检测产品，其中包含上述的血清特征多肽组合，或包含上述质谱模型。其中，该产品选自检测试剂盒、检测试剂、检测芯片等。
在一个实施方案中，该试剂盒有WCX磁珠、磁珠缓冲液、洗涤液和多肽洗脱液组成，其中所述磁珠、磁珠缓冲液、洗涤液和多肽洗脱液可以使用市售试剂盒，如美国Bruker 公司研制的WCX磁珠试剂盒，或发明人公司研制的SPE-C磁珠试剂盒（专利号ZL2008101879684）。
在另一个实施方案中，该试剂盒还包括含有上述胰岛素抵抗特征多肽的标准质谱样品管，该样品管既可以是含有单一特征多肽的样品管，也可以是含有多种特征多肽的样品管，所述标准样品管中的样品用于与待测样品进行质谱时进行平行质谱测试，以判断待测样品中是否含有所述胰岛素抵抗血清特征多肽。
在另一个实施方案中，该试剂盒还包括含有上述胰岛素抵抗特征多肽的标准数据库的软件或芯片，可用于待测样品进行质谱检测时提供标准数据或曲线的比对，以判断待测样品中是否含有所述胰岛素抵抗特征多肽。
本发明的第四个目的是提供制备所述的质谱模型的构建方法，包括：
1)收集多例临床确诊的胰岛素抵抗患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；
2)对血清多肽进行质谱前预处理：
3)对预处理过的两组血清多肽进行质谱检测读取，获得两组血清多肽的指纹图谱；
4)对所有的胰岛素抵抗和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；
5)对所得数据进实验质控处理，筛选出具有下列质荷比峰的多个特征多肽：2579.8 m/z, 2878.2 m/z, 2938.1 m/z，其中，所述特征多肽的序列分别如SEQ ID No.1-3所示，并根据上述多肽建立检测胰岛素抵抗筛查的质谱模型。
6）对所得多肽标志物进行序列鉴定，并根据鉴定的多肽建立胰岛素抵抗筛查的质谱模型。
在一个实施方案中，步骤5）中所述所述特征多肽是具有所述质荷比峰1887.9m/z,1896.1 m/z, 2579.8 m/z, 2595.4 m/z, 2878.2 m/z, 2938.1 m/z, 3236.3 m/z, 4443m/z, 5873.8 m/z, 8889.5 m/z, 8943.8 m/z, 8953.1 m/z，根据上述多肽建立检测胰岛素抵抗筛查的质谱模型。
在一个实施方案中，其中步骤2）预处理的方法包括使用磁珠纯化和稳定样品中的血清多肽和多肽。
在一个实施方案中，其中所述步骤3）采用WCX磁珠系统或试剂盒对两组血清多肽进行吸附，并对结合在弱阳离子上的两组血清多肽进行读取，获得两组血清多肽的指纹图谱。
在一个实施方案中，其中所述步骤5)所述的质控处理，保留出峰强度值大于300的质谱图谱数据，并采用Sigma血清的组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足一致性的允许范围来进行筛选，所述变异系数为13.8%。
在上述任一实施方案中，该方法还包括用了传统统计学与现代信息学方法相结合的方法进行数据处理，从而得到胰岛素抵抗和健康人血清多肽指纹图谱检测模型。
本发明第五个发明目的是提供一种利用所述标记物或质谱模型来用于筛选治疗涉及胰岛素抵抗疾病的药物的用途。
在一个实施方案中，对疑似胰岛素抵抗的患者在服用抑制胰岛素抵抗的药物的药物一段时间以后，分时间段采集餐前和餐后血清样本，进行质谱检测，并通过胰岛素抵抗诊断的质谱模型做判断，即可筛选是否有抑制胰岛素抵抗活性的期望药物。例如，通过胰岛素抵抗诊断的质谱模型分析结果表明是“健康人”，可知患者所使用的药物有抑制胰岛素抵抗的活性。如果用于胰岛素抵抗诊断的质谱模型分析结果表明是“胰岛素抵抗”，可知患者所使用的药物无抑制胰岛素抵抗活性。
本发明结合生物信息学方法筛选出相应的胰岛素抵抗的特征多肽标记并建立检测模型进行分析检测，所述的生物信息学方法包括对多肽指纹图谱进行标准化处理、对所得数据进实验质控处理、筛选所期望的血清特征多肽，并建立质谱模型，以及可选择地包括使用遗传算法结合最近邻算法建立并验证质谱模型等。其中，所述的实验质控处理指保留出峰强度值大于300的质谱图谱数据，并采用Sigma血清的组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足一致性的允许范围来进行筛选。本发明中，变异系数优选为13.8%。
技术效果
本发明采用胰岛素抵抗与正常人具有差异的多肽组合进行对胰岛素抵抗的检测，并采用了传统统计学与现代信息学方法相结合的方法进行数据处理，从而得到胰岛素抵抗和健康人血清多肽指纹图谱检测模型，所发现的多肽标志物为寻找新的更理想的胰岛素抵抗筛查标志物提供了基础和资源。
本发明模型的构建方法设计合理可行，为胰岛素抵抗的预防和治疗提供了新的筛查方法，同时为胰岛素抵抗机制研究提供了新的思路。
附图说明
图1为训练组部分健康人血清多肽图谱。
图2 为训练组部分胰岛素抵抗患者血清的多肽图谱。
图3为盲选组A组部分血清多肽图谱
图4为盲选组B组部分血清多肽图谱
图5为盲选组B组部分血清多肽检测图。
图6为盲选组B组部分血清多肽检测图。
具体实施方式
本发明将结合具体实施例做进一步的说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1、建立胰岛素抵抗模型的材料和方法
1.样本和仪器：
共439例血清样本，288例作为训练组，151例作为盲选样本组。训练组中胰岛素抵抗140例，正常组148例。详细样本特征见表1。盲选样本组中胰岛素抵抗和正常组例数目暂时未知。所有的血清样本均在清晨空腹下抽取，分离血清后储存在-80℃低温冰箱中。
基质辅助激光解析飞行时间质谱CLIN-TOF及实验用的WCX磁珠试剂盒由中国Bioyong公司研制。使用Bioyong公司的数据分析软件Bioexplorer做数据的预处理，处理后的数据采用统计分析软件SPSS 19.0 软件处理。
表1 样本特征描述表
注：BMI：身体质量指数；SBP：收缩压；DBP：舒张压；WHR：腰臀比；UA：尿酸；TCHO：胆固醇；TG：甘油三酯；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；FBG：空腹血浆葡萄糖。
2.技术路线：
血清的采集：收集静脉血在BD管中，避免溶血。缓慢地上下振荡管五次，使血液中的凝结块混匀。室温（25℃）血凝结1小时，垂直放置。吸取血清（上清液）到对应的已标记管中。标记干净的0.5ml离心管，同一血清样品每管50ul，分装多管。立即冻存血清样品于-80℃。由于反复冻融血清样品易造成多肽降解，从而使得肽谱丢失部分多肽，应避免反复冻融。
血清样品的磁珠处理：在进行CLIN-TOF质谱检测实验前，从低温冰箱提取分装的血清样品各1管，放于湿冰上。化冻60－90分钟。取出95μl磁珠结合缓冲液（CB），10μl混匀的磁珠悬浮液，10μl血清样品至样品管，混匀。室温静置5min后，将样品管放入磁珠分离器。使磁珠贴壁1分钟，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体，再向样品管中加入100μl磁珠清洗缓冲液（CW），用排枪上下吸打混匀，避免产生气泡，静置2分钟。将样品管在磁珠分离器上静置1分钟，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体。重复从加100μl磁珠清洗缓冲液，到最后吸去悬浮液体的操作步骤1次。从磁珠分离器上取下样品管，并向样品管中加入10μl磁珠洗脱缓冲液（CE），溶解贴壁的磁珠，样品管放入磁珠分离器，磁珠贴壁2min，磁珠与悬浮的液体充分分离后，将上清液移入已标记的0.2ml样品管中。
3．生物信息学方法
（一）质谱数据采集
应用CLIN-TOF质谱仪。平均每个样品结晶点收集有效峰数共400 shots。数据收集范围：1-10KDa。平均分子量偏差小于100ppm。
实验质控：对于每一张采集到的原始图谱，我们设定S/N>=5，舍弃S/N<5的峰。
（二）原始数据预处理
原始数据经Bioyong公司数据分析软件BioExplorer处理，1-10KDa的峰值经小波变换处理质谱图，包括去基线、平滑谱图，选峰，归一化等。
（三）胰岛素抵抗特征多肽的选择
每个质荷比多肽峰对各类样本的区分的相对重要性都不同，这里综合运用了T检验P值和受试者接受曲线(ROC)的方法来评价每个多肽峰的相对重要性。
（四）遗传算法
遗传算法是一种很有效的全局随机化搜索算法，它借鉴了生物界自然选择和自然遗传的机制，其主要特点是群体搜索策略和群体中个体之间的信息交搜索不依赖于梯度信息。遗传算法对多个个体组成的群体进行操作,通过遗传算子可以使个体间的信息得以交换,这样的群体中的个体一代一代地得以优化,并逐步逼近最优解。它尤其适用于处理传统搜索方法难以解决的复杂和非线性问题，可广泛用于涉及高维空间的组合优化领域。本发明方法的分类函数采用二元逻辑回归分析。
在二元逻辑回归分析中引入了交叉验证的过程，这里采用随机选择样本中的288例来建立模型，余下的151例作为验证。它可以监督训练过程，避免建立的模型出现对建模样本表现好，对预测样本表现差的现象。
在对训练样本建立质谱数据分类模型后，利用验证样本来检验所建立模型的分类能力。
实施例2、筛选胰岛素抵抗的特征多肽
应用实施例1的方法对来自训练组中的健康人群148例，胰岛素抵抗患者140例的血清多肽图谱作了检测分析。用初步筛选的质荷比峰按照P值小于0.05为统计差异显著的差异多肽峰，采用二元逻辑回归分析建立最终的诊断模型。
健康人群148例，胰岛素抵抗患者140例样本经过实施例1中的方法共产生248个分子量的峰值，其中有88个多肽峰表达有显著差异（P<0.05）。
通过Wilcoxon test 计算P值，P < 0.05表示两组有统计学差异，得到分别为1887.9m/z, 1896.1 m/z, 2579.8 m/z, 2595.4 m/z, 2878.2 m/z, 2938.1 m/z、3236.3m/z, 4443 m/z, 5873.8 m/z, 8889.5 m/z, 8943.8 m/z, 8953.1m/z等十二个特征多肽，参见表2。
表2 胰岛素抵抗和正常人比较的十二个建模多肽峰的比较
因此，这样模型定为采用12个输入变量，分别是：1887.9m/z, 1896.1 m/z, 2579.8 m/z, 2595.4 m/z, 2878.2 m/z, 2938.1 m/z, 3236.3 m/z, 4443 m/z, 5873.8 m/z,8889.5 m/z, 8943.8 m/z, 8943.8 m/z。其中，预测2579.8 m/z, 2878.2 m/z, 2938.1 m/z 3个特征多肽为可初步建立质谱模型的必要特征多肽。
实施例3、胰岛素抵抗特征多肽的鉴定
磁珠富集法
1.据实施例2中确定待鉴定峰后，查找前期处理样本中待鉴定峰值强度最高的样品。
2.按照案例1磁珠富集法获得多肽样品。每组取15例多台样品，混匀为一管。3000rpm 离心5分钟。磁力架上取上清，待测。
采用nano-LC-MS/MS平台进行多肽序列鉴定，包括Aquity UPLC(Water,MA)和LTQOrbitrap XL mass spectrometer(Thermo Fisher,MA)。离子模式为正离子模式，扫描范围为 400-1500m/z。序列分析采用Mascot（2.3.2）搜索，一级质谱精度50ppm，二级质谱精度0.8Da。
液相分析柱：类型C18，规格500mm*75mm，孔径100A，粒径2um。流动相A:0.1%甲酸水溶液，流动相B:0.1%乙腈溶液。洗脱梯度见表3，鉴定结果见表4。
表3液相梯度
表4 胰岛素抵抗特异多肽鉴定结果
实施例4、对3个特征多肽的质谱模型进行胰岛素抵抗的盲选样本测试
应用实施例2建模方法，分别用 2579.8 m/z, 2878.2 m/z, 2938.1 m/z 3个多肽峰建模。
（一）对质谱模型进行样本的训练测试
将训练组288例样本，用于模型的建立，其中胰岛素抵抗140例，正常组148例。所有患者均经病理报告确定。所有的血清样本均在清晨空腹下抽取，分离血清后储存在-80℃低温冰箱中。
用实施例1筛选出的特征多肽峰建立胰岛素抵抗的质谱模型。该模型定为采用3个输入变量，分别是：2579.8 m/z, 2878.2 m/z, 2938.1 m/z。
训练组结果如表5：
表5模型训练结果
从表5中可以看出对训练样本的结果为140例胰岛素抵抗组中的105例判断正确，敏感性75%；148例正常组中的110例判断正确，敏感性为74.33%。
（二）对质谱模型进行盲选样本的验证测试
模型训练完成后，建立起了一个有3个输入变量的模型，接着用这个模型对151个盲选样本来预测，并判断出样本的类别。将151例样本进行编号，盲选后随机分为2组，结果详见表6。
表6 盲选样本预测结果
根据预先编号计算样本实际检测结果如表7所示：
表7 盲选样本实际结果
实施例5、对12个特征多肽的质谱模型进行胰岛素抵抗的盲选样本测试
（一）对质谱模型进行样本的训练测试
将训练组288例样本，用于模型的建立，其中胰岛素抵抗140例，正常组148例。所有患者均经病理报告确定。所有的血清样本均在清晨空腹下抽取，分离血清后储存在-80℃低温冰箱中。
用实施例1筛选出的特征多肽峰建立胰岛素抵抗的质谱模型。该模型定为采用12个输入变量，分别是：1887.9m/z, 1896.1 m/z, 2579.8 m/z, 2595.4 m/z, 2878.2 m/z,2938.1 m/z, 3236.3 m/z, 4443 m/z, 5873.8 m/z, 8889.5 m/z, 8943.8 m/z, 8943.8m/z。
训练组结果如表8：
表8模型训练结果
从表8中可以看出对对训练样本的结果为140例胰岛素抵抗组中的134例判断正确，敏感性95.7%；148例正常组中的123例判断正确，敏感性为83.11%。
（二）对质谱模型进行盲选样本的验证测试
模型训练完成后，建立起了一个有12个输入变量的模型，接着用这个模型对151个盲选样本来预测，并判断出样本的类别。将151例样本进行编号，盲选后随机分为2组，结果详见表9。
表9 盲选样本预测结果
根据预先编号计算样本实际检测结果如表10所示：
表10 盲选样本实际结果
由实施例4和5的结果可知，使用3个特征多肽建立的质谱模型，其已经具有初步可信的鉴定结果，足以区分大多数样本中的胰岛素抵抗患者和正常样本。结合12个特征多肽建立的质谱模型，其预测胰岛素抵抗的准确率已经达到98.6%，预示着这两种质谱模型具有良好的临床应用前景。
实施例6、与其他胰岛素抵抗检测方法的比较
本发明方法原理不同于其他胰岛素抵抗检测方法，本发明方法的结果表明，采用血清多肽检测是一个效果非常好的诊断手段，对于早期的胰岛素抵抗诊断大有裨益。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京毅新博创生物科技有限公司
<120> 检测胰岛素抵抗的质谱模型及构建方法
<160> 3
<170> PatentIn Version 2.1
<210>1
<211>23
<212>氨基酸
<220>
<223>间-α-胰蛋白酶抑制因子重链H4（人）
<440>1
NVHSGSTFFK YYLQGAKIPK PEA 23
<210> 2
<211> 27
<212> 氨基酸
<220>
<223> 纤维蛋白原α链（人）
<440> 2
MADEAGSEAD HEGTHSTKRG HAKSRPV 27
<210> 3
<211> 31
<212> 氨基酸
<220>
<223> α2-HS糖蛋白（人）
<440> 3
VVDPDAPPSP PLGAPGLPPA GSPPDSHVLL A 31

Claims (10)

1.一种用于检测胰岛素抵抗的血清多肽标志组合物，由具有质荷比2579.8 m/z,2878.2 m/z, 2938.1 m/z 的多肽组成，其中所述多肽序列如下所示：
SEQ ID No.1：NVHSGSTFFKYYLQGAKIPKPEA，2579.8 m/z
SEQ ID No.2：MADEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV，2878.2 m/z
SEQ ID No.3：VVDPDAPPSPPLGAPGLPPAGSPPDSHVLLA，2938.1 m/z。
2.权利要求1所述的组合物，其中多肽标志物组合由所述具有质荷比2579.8m/z、2878.2m/z、2938.1m/z的多肽，以及具有质荷比1887.9m/z、1896.1m/z、2595.4m/z、3236.3m/z、4443m/z、5873.8m/z、8889.5m/z、8943.8m/z、8953.1m/z的12条多肽组成。
3.权利要求1所述的质谱模型，其中该模型包括具有质荷比2579.8 m/z, 2878.2 m/z,2938.1 m/z 的多肽，以及1887.9m/z, 1896.1 m/z, 2595.4 m/z, 3236.3 m/z, 4443 m/z, 5873.8 m/z, 8889.5 m/z, 8943.8 m/z, 8953.1m/z 的12条多肽。
4.一种用于检测胰岛素抵抗人群的检测产品，其中包含上述的血清特征多肽组合，或包含上述质谱模型。
5.权利要求4的检测产品，其中该产品是试剂盒，包含WCX磁珠、磁珠缓冲液、洗涤液和多肽洗脱液。
6.权利要求5的检测产品，其中该试剂盒还包括含有上述胰岛素抵抗特征多肽的标准数据库的软件或芯片，可用于待测样品进行质谱检测时提供标准数据或曲线的比对，以判断待测样品中是否含有所述胰岛素抵抗特征多肽。
7.制备权利要求3或4所述的质谱模型的构建方法，包括：
1)收集多例临床确诊的胰岛素抵抗患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；
2)对血清多肽进行质谱前预处理：
3)对预处理过的两组血清多肽进行质谱检测读取，获得两组血清多肽的指纹图谱；
4)对所有的胰岛素抵抗和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；
5)对所得数据进实验质控处理，筛选出具有下列质荷比峰的多个特征多肽：2579.8 m/z, 2878.2 m/z, 2938.1 m/z，其中，所述特征多肽的序列分别如SEQ ID No.1-3所示，并根据上述多肽建立检测胰岛素抵抗筛查的质谱模型;
6）对所得多肽标志物进行序列鉴定，并根据鉴定的多肽建立胰岛素抵抗筛查的质谱模型。
8.权利要求8的方法，其中步骤5）中所述所述特征多肽是具有所述质荷比峰1887.9m/z, 1896.1 m/z, 2579.8 m/z, 2595.4 m/z, 2878.2 m/z, 2938.1 m/z, 3236.3 m/z,4443 m/z, 5873.8 m/z, 8889.5 m/z, 8943.8 m/z, 8953.1 m/z，根据上述多肽建立检测胰岛素抵抗筛查的质谱模型。
9.一种利用权利要求1或2的标记物，或利用权利要求3或4质谱模型来用于筛选治疗涉及胰岛素抵抗疾病的药物的用途。
10. 一种用于检测胰岛素抵抗特征多肽的质谱模型，该模型包括由SEQ ID No.1-3所述的特征多肽。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112885411A (zh) * 2019-11-29 2021-06-01 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于深度学习的多肽检测方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111077214A (zh) * 2019-12-31 2020-04-28 北京毅新博创生物科技有限公司 质谱检测乳制品中A1、A2型β酪蛋白的质谱模型及其构建方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005079410A2 (en) * 2004-02-16 2005-09-01 Nelsestuen Gary L Biological profiles and methods of use
CN101398423A (zh) * 2008-11-11 2009-04-01 毅新兴业（北京）科技有限公司 一种用于检测肝癌特征蛋白的质谱模型及制备方法
CN103483442A (zh) * 2013-08-22 2014-01-01 向华 检测龋齿蛋白的质谱模型及构建方法
CN104007169A (zh) * 2014-05-29 2014-08-27 深圳市第二人民医院 一种胃癌的唾液蛋白诊断模型及其建立方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7015004B2 (en) * 2001-11-23 2006-03-21 Syn X Pharma, Inc. Inter-alpha trypsin inhibitor biopolymer marker indicative of insulin resistance
US7052849B2 (en) * 2001-11-23 2006-05-30 Syn X Pharma, Inc. Protein biopolymer markers predictive of insulin resistance
US7094549B2 (en) * 2001-11-23 2006-08-22 Syn X Pharma, Inc. Fibronectin biopolymer marker indicative of insulin resistance
CN101403740B (zh) * 2008-11-13 2012-09-05 马庆伟 用于检测肝癌特征蛋白的质谱模型及制备方法
EP2414535A4 (en) * 2009-03-31 2012-12-26 Metabolon Inc BIOMARKERS RELATED TO INSULIN RESISTANCE AND METHODS OF USE

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005079410A2 (en) * 2004-02-16 2005-09-01 Nelsestuen Gary L Biological profiles and methods of use
CN101398423A (zh) * 2008-11-11 2009-04-01 毅新兴业（北京）科技有限公司 一种用于检测肝癌特征蛋白的质谱模型及制备方法
CN103483442A (zh) * 2013-08-22 2014-01-01 向华 检测龋齿蛋白的质谱模型及构建方法
CN104007169A (zh) * 2014-05-29 2014-08-27 深圳市第二人民医院 一种胃癌的唾液蛋白诊断模型及其建立方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王秀丽等: "WCX磁珠联合MALDI-TOF-MS技术在结直肠癌诊断中的应用", 《世界华人消化杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112885411A (zh) * 2019-11-29 2021-06-01 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于深度学习的多肽检测方法

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