CN107014920B - 一种梅子配方酒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种梅子配方酒的检测方法，它是采用UPLC实现的。采用本发明检测方法，可以在较短的时间内实现对配方酒中绿原酸和芦丁的含量测定，为该配方酒的质量标准提供了一定的物质基础条件。

Description

一种梅子配方酒的检测方法

技术领域

本发明提供了一种梅子配方酒的检测方法。

背景技术

梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.属于蔷薇科杏属植物。梅果中含有丰富的氨基酸、维生素、有机酸及多种矿物质元素，具有很高的营养和保健功能。未熟时为青色，称“青梅”，初成熟时一般呈黄色称“黄梅”(邢湘臣等，2004)，味极酸并具苦涩味，果期5-6月(在华北果期延至7-8月)。梅的干燥近成熟果实，低温烘干后闷至色变黑，制成“乌梅”，此为药食两用品种，具敛肺，涩肠，生津，安蛔之功效，常用于肺虚久咳，久泻久痢，虚热消渴，蛔厥呕吐腹痛(中华人民共和国卫生部药典委员会等，2015)。`青梅中有一种柠檬酸和葡萄糖结合形成的酯类衍生物-梅素(Mumefural)，具有改善血液流动性的作用。

梅子果酒的成分复杂，主要活性成分不明确，梅果中的主要化学成分有机酸中常包括草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、马来酸、琥珀酸等；梅子果酒中主要成分也含有有机酸。但梅子果酒主要成分除了有机酸是否还含有其他活性成分，有待进一步研究。

发明内容

本发明提供了一种梅子配方酒的检测方法，它是使用UPLC进行检测的，具体操作如下：

(1)取梅子配方酒，除去溶剂后，使用适当溶剂溶解，制备供试品溶液；

(2)取绿原酸和芦丁，使用适当溶剂溶解，制备对照品溶液；

(3)分别取供试品溶液、对照品溶液注入色谱仪，采用外标法或指纹图谱技术进行检测即可，其色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

流动相：乙腈-乙酸水溶液，梯度洗脱条件：

其中，乙酸水溶液中乙酸的浓度为0.1％～5％v/v，进一步选自0.1％～1％，本发明一个具体实施方式中，其浓度为0.5％v/v。

本发明中，柱温选自25～35℃。

本发明中，检测波长选自327±5nm。

本发明中，色谱柱的尺寸为2.1×100mm。

本发明中，所述适当溶剂选自甲醇、水合甲醇、乙腈或水合乙腈。

本发明所述梅子配方酒与市售品有所区别，是由如下方法制备获得：

首先，制备梅子果酒，其次再使用梅子果酒制备梅子配方酒。

鲜青梅：干大枣：干枸杞：玉米酒＝1：(0.01～0.05)：(0.01～0.05)：(2～5)Kg:Kg:Kg:L；其中，青梅为蔷薇科杏属植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的未成熟果实；取鲜青梅、干大枣、干枸杞，在玉米酒中浸泡0.5年以上，降酸，澄清，即得梅子果酒。

进一步地，其原料配比可以是鲜青梅：干大枣：干枸杞：玉米酒＝1：0.05：0.05：(3～5)Kg:Kg:Kg:L，本发明一个具体实施方式中，其配比为1：0.05：0.05：5Kg:Kg:Kg:L。

其中，本发明所述玉米酒酒精含量为38～45度。

本发明一个具体实施方式中，浸泡温度为室温。

本发明一个具体实施方式中，浸泡时间为0.5～2年，多在1～2年。

在我国的云南、广东、福建等多地，有将青梅酿制青梅果酒的传统。青梅果酒的制作方法主要有发酵和浸泡两种。然而，我国青梅果酒的研制相比于日本、韩国相对落后，其中有一个较大的技术问题：酸度大，降酸技术问题。由于梅果的有机酸含量太高，梅子果酒虽在一定程度上稀释，但仍然高于一般果酒的酸度，梅子酒在降酸的同时，其他营养成分有一定损失，选择合适的降酸方法仍然需要进一步探索。

基于目前梅子果酒中存在的酸度较大的问题，本发明根据大量的前期考察实验，通过对离子交换树脂降酸(包括大孔型丙烯酸系、凝胶型苯乙烯系等)、化学试剂降酸(碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠、酒石酸钾等)、生物降酸(壳聚糖)等多种方式的探索，最终发现，只有使用壳聚糖才能获得较理想的降酸效果，而其他降酸方式和试剂均不满意。

基于降酸实验考察结果，本发明的降酸操作如下：

取浸泡后的酒液，加壳聚糖至其浓度为0.05～2.0％Kg/L，静置12～36h，取上清液即可。

本发明一个具体实施方式中，壳聚糖浓度为1.0％。

本发明另一个具体实施方式中，静置时间为24h。

除了酸度问题外，本发明中还对澄清技术进行了研究，成品梅子酒久置后常出现浑浊、失光、瓶底沉淀等现象，不仅口感上，就连梅子酒的基本质量都无法保证，其浑浊物的成分复杂，既含有蛋白质、苹果酸等有机物，又含有少量的果实纤维类物质，以及生产过程中残余的少量硅藻土成分，这些物质在果酒放置过程中发生一系列复杂而缓慢的物理和化学变化，凝聚成大分子或其它的沉淀物而析出，导致果酒的浑浊。因而，对果酒的澄清处理也成为加工工艺中的一大难题。

现有技术对于澄清方法报道较多，但对于青梅果酒而言，什么方法最为适当还未可知。本发明前期使用了自然澄清、离心澄清、冷藏澄清、澄清剂澄清(明胶、皂土、壳聚糖、澄清剂ZTC101、ZTCⅢ、沸石负载壳聚糖等)多种方式，最终发现：自然澄清，此法虽耗时较长，但对色度值损害不大；离心澄清，耗时较短，经济实惠；冷藏澄清本身耗能较大，不利于实际生产；沸石-壳聚糖澄清剂、5％皂土以及1％的壳聚糖的澄清效果最为明显，且在较小的加入量就能达到较高的透光率，明胶的澄清效果最差。最终选择使用沸石-壳聚糖澄清剂与低温离心澄清相结合的方式。

本发明提供的澄清操作如下：

取降酸后的上清液，加入沸石负载的壳聚糖至其浓度为5～10g/L，在36～60℃下澄清时间120～180min，1～5℃低温离心，取上清液即可。

本发明一个具体实施方式中，沸石负载的壳聚糖浓度为7g/L，澄清温度为36～40℃，澄清时间为160～180min，离心温度1～4℃。

本发明对梅子果酒进行了进一步地配方研究，经过口感测试，对其配方进行了优化，基于该优化结果，本发明提供了一种口感更好的梅子配方酒，包括如下配比的原料：

1000mL如前所述梅子果酒，梅酒140～200mL，饮用水500～1000mL，白糖0.6～1.4g；其中，所述梅酒为鲜青梅：玉米酒＝1：1～1.5Kg/L浸泡1～2年制备得到。

本发明一个具体实施方式中，包括如下配比的原料：

1000mL如前所述梅子果酒，梅酒160mL，饮用水750mL，白糖0.6g；其中，所述梅酒为鲜青梅：玉米酒＝1：1Kg/L浸泡2年制备得到。

其中，经过检测方法，本发明梅子配方酒酒精度为10～11度，总干浸物为19～20g/L，总糖含量为12～13g/L，总酸含量为6～7g/L。

本发明还提供了上述梅子配方酒的制备方法，其操作如下：按配比将原料混合均匀，进行冷热交替处理并去除沉淀，直至无沉淀产生，即得梅子配方酒。

冷热交替处理方法是果酒中常见的处理方式，本发明中的具体操作如下：酒体置于70-80℃水浴锅中保持20～40min，冷却过0.45μm滤膜，冷冻，冻结之后在常温解冻，过0.45μm滤膜，重复上述加热和冷冻操作，直至无沉淀产生。

本发明具体实施方式中使用冰箱进行冷冻，冰箱的常规冷冻温度为-18℃，但是，这并不表示本发明冷冻的温度需要限制在-18℃，只要能够达到酒体能够冷冻固化的温度即可。

经过上述方法检测发现，该配方酒中，绿原酸和芦丁的含量分别在30mg/L、20mg/L以上。绿原酸具有抗菌、利胆、抗病毒，还能增加白血球、止血、缩短血凝和出血时间、兴奋中枢神经系统等多种药理功能，对急性咽喉炎症和化脓性皮肤疾病疗效显著，芦丁具有抗自由基活性、抗脂质过氧化、抗病毒、抗急性胰腺炎等药理作用，可用于多种疾病的治疗。因此，可以将上述两种成分作为该配方酒与功效相关联的指标成分进行检测。

当然，基于上述内容，本发明同样还可以提供一种梅子配方酒中同时检测绿原酸和芦丁的方法，它包括如下操作步骤：

它是使用UPLC进行检测的，具体操作如下：

(1)取梅子配方酒，除去溶剂后，使用适当溶剂溶解，制备供试品溶液；

(2)取绿原酸和芦丁，使用适当溶剂溶解，制备对照品溶液；

(3)分别取供试品溶液、对照品溶液注入色谱仪，采用外标法进行检测即可，其色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

流动相：乙腈-乙酸水溶液，梯度洗脱条件：

本发明在预实验中研究发现，只有在上述色谱条件下(特别是流动相梯度洗脱条件)，才能够获得良好的分离度，将各个色谱峰有效分离，为实现对各色谱峰成分含量的测定做好了铺垫。

所述梅子配方酒由如下方法制备得到：

A、制备梅子果酒：

按如下配比取原料：

鲜青梅：干大枣：干枸杞：玉米酒＝1：(0.01～0.05)：(0.01～0.05)：(2～5)Kg:Kg:Kg:L；其中，青梅为蔷薇科杏属植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的未成熟果实；

取鲜青梅、干大枣、干枸杞，在玉米酒中浸泡0.5年以上，降酸，澄清，即得梅子果酒；

降酸的操作如下：取浸泡后的酒液，加壳聚糖至其浓度为0.05～2.0％Kg/L，静置12～36h，取上清液即可；进一步地，壳聚糖浓度为1.0％；进一步地静置时间为24h；

澄清的操作如下：取降酸后的上清液，加入沸石负载的壳聚糖至其浓度为5～10g/L，在36～60℃下澄清时间120～180min，1～5℃低温离心，取上清液即可；进一步地，沸石负载的壳聚糖浓度为7g/L，澄清温度为36～40℃，澄清时间为160～180min，离心温度1～4℃；

B、制备梅子配方酒

1000mL所述梅子果酒，梅酒140～200mL，饮用水500～1000mL，白糖0.6～1.4g，按配比混合均匀，进行冷热交替处理并去除沉淀，直至无沉淀产生，即得梅子配方酒；其中，所述梅酒为鲜青梅：玉米酒＝1：1～1.5Kg/L浸泡1～2年制备得到。

采用本发明检测方法，可以在较短的时间内实现对配方酒中绿原酸和芦丁的含量测定，为该配方酒的质量标准提供了一定的物质基础条件。

另外，本发明色谱条件下，可以分离出10个以上的色谱峰，各成分色谱峰分离度良好，若使用指纹图谱技术(色谱图如图7所示)，或可以实现对该配方酒质量的全面监控。

附图说明

图1梅子果酒AHP树状图

图2不同化学试剂对梅子果酒的酸度的影响

图3不同壳聚糖加入量对梅子果酒酸度的影响

图4不同壳聚糖加入量对梅子果酒色度值及吸光度的影响

图5沸石-壳聚糖澄清效果

图6混合对照品溶液的UPLC色谱图(1.绿原酸2.咖啡酸3.芦丁)

图7梅子配方酒的UPLC色谱图(1.绿原酸3.芦丁)

具体实施方式

青梅果，于2014年7月6日、2015年7月6日采自金川县马奈乡，经鉴定为蔷薇科杏属植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的未成熟果实，即青梅；玉米酒，购于2015年6月27日金川县安宁镇蔡家酒厂、2014年7月马奈乡马家酒厂，酒精度约在38～45度；枸杞，购自宁夏银川灵武；大枣，购自新疆。

实施例1梅子果酒的制备

(1)按如下配比取原料：

鲜青梅：干大枣：干枸杞：玉米酒＝1：0.05：0.05：5Kg:Kg:Kg:L

所述玉米酒酒精含量为38～45度。

(2)制备：

取鲜青梅、干大枣、干枸杞，在玉米酒中浸泡1～2年，降酸，澄清，即得梅子果酒，其中，降酸的操作如下：

取浸泡后的酒液，加壳聚糖至其浓度为1.0％Kg/L，静置24h，取上清液即可；澄清的操作

如下：

取降酸后的上清液，加入沸石负载的壳聚糖至其浓度为7g/L，在36～40℃下澄清时间160～180min，2～3℃低温离心，取上清液即可。

实施例2梅子配方酒的制备

取1000mL实施例1制备的梅子果酒，梅酒160mL，饮用水750mL，白糖0.6g；按配比将原料混合均匀，进行冷热交替处理并去除沉淀，直至无沉淀产生，即得梅子配方酒。

冷热交替处理方法是果酒中常见的处理方式，本发明中的具体操作如下：酒体置于70-80℃水浴锅中保持20～40min，冷却过0.45μm滤膜，-18℃冷冻，冻结之后在常温解冻，过0.45μm滤膜，重复上述加热和冷冻操作，直至无沉淀产生。

其中，所述梅酒为鲜青梅：玉米酒＝1：1Kg/L浸泡2年制备得到。

实施例3梅子果酒的配方考察

挑选新鲜青梅果，去除杂质，擦去表面污渍，称取1kg，洗净，沥干至无水滴下，置于适量玉米酒中30s，沥干至无液体滴下；按照下表2-2、表2-3，分别加入枸杞、大枣及不同体积比例的玉米酒，密封避光，于25℃的室温下，每个月轻轻摇晃一次，浸提0.5-2年，见表1，表2。

表1梅子果酒样品^*1

*梅子果酒时间2015年7月6日-2016年7月6日

表2梅子果酒样品^#2

^#梅子果酒时间2014年7月6日-2016年7月6日

化学成分定性鉴别：梅子果酒的化学预试验结果表示，梅子果酒中含有黄酮类、有机酸、多酚类及鞣质、糖和苷、氨基酸和蛋白质等成分。其中有机酸类是梅果中主要成分，黄酮类及多酚类化合物具有较好的药理活性，因此，选择总多酚、总黄酮作为梅子果酒浸提工艺的考察指标之一。

基于层次分析法的多指标综合评价优选梅子果酒的处方和浸提工艺

层次分析法(AnalyticalHierarchy Process，AHP)(任爱农等，2008)是将评价目标分为若干层次和若干指标，依照不同权重进行综合评价的方法。本研究将评价体系设计为三层，如图1。引入九分位的相对重要的比例标度，如表3，在由评估主体确定各指标的相对重要性，并将结果形成判断矩阵。

表3 9分位判断标准

表4 5项目标成对比较判断优先矩阵

1建立评价目标树

对梅子果酒浸提工艺评价这个总评价目标可以通过指标性成分、干浸出物这个次级目标来反映，指标性成分通过总黄酮、总多酚、总酸、总糖4个目标来反映。

2构成两两比较优先矩阵

比较同一层次目标的相对重要性，并构成两两比较矩阵。评分标准，见表4。目标树中4项目标成对比较的判断优先矩阵，见表5。

3计算权重并检验其一致性

参考相关文献报道(查日维等，基于层次分析法的多指标综合评价优选宣木瓜提取方；李慧等，基于层次分析法及多指标正交试验优选酒炖女贞子炮制工艺)计算，求得总黄酮、总酚、总酸、总糖、干浸出物的权重系数分别为：0.271、0.158、0.050、0.110和0.411。随机一致性比率CR＝CI/RI，当CR＜0.1时，判断矩阵具有满意的一致性及权重计算正确性。本次试验的一致性比率为CR＝0.040＜0.1，表明权重计算正确。

4多指标成分测定

对浸提表1中浸提一年的24种浸提液进行活性成分的测定，分别求出梅子果酒中总多酚、总黄酮、总糖的含量；参考葡萄酒、果酒质量标准，测定指有机酸及总浸物的含量，结果如下表5，6：

表5梅子酒中总酸的含量

表6梅子酒中总浸出物的测定

5多指标层次分析法的计算结果

采用多指标层次分析法法确定的权重系数进行综合评价，其中得率用D表示，计算如下式(3-1)，综合评分用Y表示，计算如下式(3-2)，计算结果如表7：

其中：D——表示得率，C——表示浓度(g.L^-1)，V——表示理论体积(L)，M——表示酒体加入固体质量和(kg)

其中：F-表示总多酚得率(g.kg^-1)，H-表示总黄酮得率(g.kg^-1)，S-表示总酸得率(g.kg^-1)，J-表示总干浸物(g.L^-1)，T-表示总糖得率(g.kg^-1)

表7梅子果酒不同浸提工艺的综合评价

6小结

以活性成分及干浸出物为指标，基于AHP的综合评分法得到的评分最高的四组是：24号样品>14号样品>19号样品。基于AHP的综合评价及相关文献报道，梅子果酒的最佳处方为24号，其中新鲜青梅果:大枣(干):枸杞(干):玉米酒比例为1:0.05:0.05:5(固/液＝kg.L^-1)。

实施例3降酸工艺考察

前期实验研究了梅子果酒的基本成分，梅子果酒中有机酸的含量较高，浸提两年的总酸(即可滴定酸，以柠檬酸计)含量高达15.20g.L^-1，不适宜直接饮用。目前，用于梅子酒等酸度较大的酒或饮料的降酸方法主要有：离子交换树脂降酸、化学试剂降酸、生物降酸等等。综合考虑成本及操作难易程度，本研究通过考察化学试剂、壳聚糖及离子交换法对梅子果酒酸度的影响，选择最佳降酸工艺。

1化学试剂对梅子酒酸度的影响

由图2数据可得，化学试剂的降酸选用单一试剂时可优选碳酸钠，其次为碳酸氢钠和碳酸钾。碳酸氢钾的降酸能力稍弱，可作为复合降酸剂，不建议单独使用。酒石酸钾和碳酸钙的降酸能力较弱，不建议使用。

2壳聚糖对梅子果酒酸度的影响

如上图3、4所示，为不同质量分数的壳聚糖对梅子果酒酸度的影响，随着壳聚糖量的增加，梅子果酒的酸度急剧下降。当壳聚糖质量分数达到1％时，梅子果酒的酸度降低至10.57g.L^-1，基本达到果酒饮用酸度。壳聚糖的添加，在降低酸的同时，还具备良好的吸附作用，因此对梅子果酒的澄清度和色度值有明显影响，当加入量为1.5％之前，酸度降低基本呈线性降低，下降幅度较大，而透光度增长幅度从初始时的较快，也渐缓慢，色度值逐渐下降，下降幅度从开始的较快到逐渐缓慢，可能由于壳聚糖在此阶段以降酸为主，对酸度的影响强于澄清度和色度值；当加入量大于1.5％之后，酸度降低幅度降低，而澄清度急速上升且色度值急剧下降，壳聚糖对透光率和色度值的影响强于其降酸的作用，可能由于壳聚糖在此段主要发挥其澄清剂作用。

当壳聚糖在加入量为0.5％时，其降酸效果明显，且对梅子果酒的澄清度有明显改善，对色度值影响不大。

3树脂对梅子果酒酸度的影响

三种树脂的静态吸附结果如下表8所示，三种树脂的降酸效果来看，D314型>D301型>717型，D314型树脂的降酸效果与D301型相近，降酸比例分别为：37％和35.42％。717型树脂降酸率为19.26％，远小于前两种树脂，且处理后酸度任然高达11.74g.L^-1。阴离子交换树脂的降酸效果与其离解带电基团的能力有关，试验选用的三种树脂均含有弱碱性胺基基团，在水中能离解出OH^-而呈现弱碱性，可将梅子果酒中的弱酸分子吸附，从而降低梅子果酒酸度。其中D314型和D301型两种阴离子树脂活性中心多，离子扩散速度快，因此降酸效果较好。

在静态吸附降酸过程中，树脂对梅子果酒的理化指标和活性成分均有影响。两种树脂对酒精度数、浸出物、总糖含量、总酚含量及总黄酮含量均有所降低，从总糖来看，D301树脂的吸附能力较强于D314型树脂，其降幅达45.4％，对色度值、吸光度及澄清度影响较大，澄清度和色泽是酒体外观质量的重要指标(Fabios et al.,2000；Gomez-Plaza etal.,2000)，经过D314树脂和D301树脂处理后的酒体透光率较大，分别达到54.9％和53.3％，而色度值降低至1.719和1.769，表明此两种树脂中D314型树脂对梅子酒颜色吸附较多。

表8三种树脂的降酸效果及其他影响

4小结

试验选用的化学试剂、大孔树脂、壳聚糖对梅子果酒进行降酸试验比较。化学试剂的降酸选用单一试剂时可优选碳酸钠，其次为碳酸氢钠和碳酸钾。因为K⁺的引入，会使的口感的苦涩味加重，故碳酸钾的量不宜过高。壳聚糖的单用降酸效果明显，同时还具有很好的澄清效果，是较好的降酸兼澄清试剂，可优先选用。两种树脂D301和D314均表现出较好的降酸效果，处理后的酒体澄清度高，且酒体的整体口感较好，经两种树脂处理后的酒体营养成分和理化指标差异不大，但色度值损失较大，且树脂气味较重，影响酒体的整体风味，故不建议选用。

考虑到壳聚糖有一定的澄清效果，且其降酸效果明显，对酒体色度值影响相对较小，降酸后酒体口感较好，本试验优选壳聚糖作为降酸试剂，加入量为1％。

实施例4澄清工艺考察

浸泡型梅子果酒相对于发酵型梅子果酒而言，澄清度相对较高，但酒体中任含有大量的大分子物质，在储存过程中，极易产生沉淀而影响酒体的稳定性及口感。目前的常用的澄清方法有自然澄清，离心澄清，澄清剂有加入明胶、皂土、蛋清、壳聚糖、PVPP澄清液等，且化学试剂用量差异较大，为了保证梅子果酒的相对稳定性，综合考虑色泽和透光率，考察了自然澄清、离心澄清、冷藏澄清和几种常用的澄清剂明胶、皂土、壳聚糖并增加了两种中药的澄清剂ZTC101和ZTCⅢ和一种优化处理的澄清剂沸石负载壳聚糖试剂对梅子酒澄清效果的影响，筛选最适合梅子果酒澄清试剂和方法。

试验方法

经预试验波长扫描200-800nm，选取吸光度最大处波长为测定吸光度值波长，吸光度最小的波长为透光率测定波长。梅子果酒有末端吸收，而在420nm时吸光度较大，在720nm透光率最高，故以蒸馏水为空白，在420nm处测定其吸光度，在720nm处测定其透光率。

1自然澄清

取5份梅子果20mL，静置于25℃常温，间隔1d取上清液于720nm处测定透光率，420nm处测定吸光度值。

2离心澄清

取5份梅子果酒10mL，分别离心3min、5min、10min、15min、20min，取上清液于720nm处测定透光率，420nm处测定吸光度值。

3冷藏澄清

取5份梅子果酒20mL，分别置于2℃冷藏柜里，冷藏3h、5h、7h、1d、2d后取上清液于720nm处测定透光率，420nm处测定吸光度值。

4澄清剂的澄清

4.1澄清剂的制备

(1)沸石-壳聚糖的制备：用5％的醋酸溶液缓慢溶解壳聚糖，配制成0.5％的壳聚糖溶液。用60mL此溶液将50g沸石调成糊状，使之充分浸润。将此糊状物加热干燥，研细，即得沸石负载壳聚糖澄清剂。

(2)皂土溶剂的配置：称取5g皂土，加入100mL蒸馏水浸泡24h，搅拌均匀，皂土吸水膨胀后形成胶体悬浮液备用。

(3)ZTC101溶液的配置：称取10g的ZTC101粉末，加入100mL蒸馏水，定容在100mL容量瓶中，既得到质量体积分数为10％的ZTC101澄清剂。

(4)ZTC-Ⅲ型澄清剂：A组为白色粉末颗粒。称取1.000g，加入100mL蒸馏水搅拌溶胀24小时备用。B为淡黄色或白色粉末。称取1.000g加入100mL蒸馏水搅拌均匀，然后加入醋酸1mL搅拌，溶胀24小时备用。使用时先加入B组，间隔10min在加入A组。

(5)1％壳聚糖溶液的制备：称取1g柠檬酸，加入98mL蒸馏水加热溶解，再加入1g壳聚糖，加热搅拌溶解，配成1％壳聚糖溶液，冷却备用。

(6)5％明胶溶液的制备：称5g明胶，用100mL蒸馏水充分浸泡，置于60-70℃的水浴锅加热至完全溶解，冷却备用。

4.2澄清剂试验

(1)沸石-壳聚糖澄清：取7份20mL酒样分别加入沸石-壳聚糖0.05g、0.07g、0.10g、0.12g、0.15g、0.2g、0.4g，轻轻晃动，静置24h后测定透光率T₇₂₀％和吸光度A₄₂₀。

(2)5％皂土混悬液澄清：取7份20mL酒样分别加入5％皂土混悬液0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、mL、3mL、5mL，轻轻晃动，静置24h后测定透光率T₇₂₀％和吸光度A₄₂₀。

(3)ZTC101溶液的澄清：取7份20mL酒样分别加入10％ZTC101溶液0.2mL、0.6mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL、4mL，轻轻晃动，静置24h后测定透光率T₇₂₀％和吸光度A₄₂₀。

(4)ZTC-Ⅲ型澄清：取7份20mL酒样分别按下述表格加入ZTCⅢ溶液，加入B组溶液10min后加入A组溶液，静置24h后测定透光率T₇₂₀％和吸光度A₄₂₀。

表9 ZTCⅢ型澄清剂的加入量

(5)1％壳聚糖溶液澄清：取7份20mL酒样分别加入1％Z壳聚糖溶液0.3mL、0.6mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL，轻轻晃动，静置24h后测定透光率(T₇₂₀％)和色度值A₄₂₀。

(6)5％明胶溶液澄清：取7份20mL酒样分别加入5％明胶溶液0.3mL、0.6mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL，轻轻晃动，静置24h后测定透光率(T₇₂₀％)和色度值A₄₂₀。

5澄清结果分析

5.1自然澄清

随着静置时间的增加，透光率又快到慢的增加，整理处于上升的趋势，当澄清时间达到5d左右，透光率增加缓慢，基本变化不大。吸光度随着时间增加，呈现下降趋势，当透光率基本趋于不变时，吸光度任然处于下降的趋势。

5.2离心澄清

在5分钟内，随着时间增加，透光率快速增大，之后基本趋于稳定，而吸光度则随着离心时间的增加缓慢下降。因此，离心澄清5min即可，目前还未发现时间更长，对成本以外带来不利因素。

5.3冷藏澄清随着时间增加，透光率增大，吸光度逐渐降低。

5.4澄清剂澄清

沸石-壳聚糖澄清效果如图5所示，沸石-壳聚糖加入量在5mg.mL^-1时透光率快速增大，当沸石-壳聚糖加入量到6mg.mL^-1时，再增加沸石-壳聚糖的量时，透光率增加缓慢，透光率相对不变。色度值在沸石-壳聚糖加入量为5mg.mL^-1时降低至最低，随着沸石-壳聚糖的增加而缓慢增加。

5％皂土的澄清效果，随着皂土加入量的增加，透光率逐渐增大，当皂土加入量为5.56mg.mL^-1时，透光率达到最大值，再增加皂土的量，透光率出现下降的趋势，可能由于5％皂土本身是悬浊液，随着含量过大，其悬浊液的效果大于澄清效果，从而影响透光率。而随着皂土量的增大，色度值一直处于下降的趋势，表明皂土有较强的吸附作用。

10％的ZTC101澄清剂的澄清效果，随着ZTC101加入量的增加，透光率逐渐增大，当皂土加入量大于1mL时，透光率相对稳定，而随着ZTC101量的增大，色度值开始处于下降的趋势，当加入量达到2mL左右，吸光度下降缓慢，或有增加的趋势。

ZTCⅢ型澄清剂的澄清效果，由于此澄清剂为两种溶液的混合作用，故此前考察了两溶液的加入量关系，当两溶液加入量为B组:A组为3:1时，透光率较高。随着ZTCⅢ加入量的增加，透光率逐渐增大，当B组:A组加入量为1.2:0.4时，透光率达到最大值，再增加ZTCⅢ的量，透光率略为下降，随后逐渐趋于平衡。而随着ZTCⅢ量的增大，色度值一直处于下降的趋势。

1％壳聚糖澄清剂的澄清效果，随着1％壳聚糖加入量的增加，透光率逐渐增大，当壳聚糖加入量为2mL时，透光率达到最大值，再增加壳聚糖的量，透光率出现下降的趋势。而随着壳聚糖量的增大，色度值一直处于下降的趋势，先快后慢，逐渐趋于平缓。

5％明胶澄清剂的澄清效果，随着明胶加入量的增加，透光率反而出现下降趋势。而随着明胶量的增大，色度值一直处于下降的趋势，表明明胶对于所澄清的梅子酒并没有很明显的澄清作用。

5.5澄清剂试验小结

对于自然澄清、离心澄清和冷藏澄清，自然澄清，此法虽耗时较长，但对色度值损害不大；离心澄清，耗时较短，经济实惠；冷藏澄清本身耗能较大，不利于实际生产。澄清剂的使用最为广泛，沸石-壳聚糖澄清剂、5％皂土以及1％的壳聚糖的澄清效果最为明显，且在较小的加入量就能达到较高的透光率，明胶的澄清效果最差。由于皂土及壳聚糖多配置成液体使用，其本身的体积对酒体整体有影响，综上所述，本试验梅子果酒本身透光率较高，为保证其透光率，同时兼顾吸光度值，本试验选用单一沸石-壳聚糖作为澄清剂结合离心冷藏试验进行进一步澄清试验，考察最佳的澄清工艺。

6沸石-壳聚糖响应面法优化梅子果酒的澄清工艺

6.2响应面试验设计与结果

根据单因素试验结果，选取沸石-壳聚糖加入量、澄清时间、澄清温度三个因素，采用三水平三因素的Box-Behnken响应面试验设计，优选沸石-壳聚糖的最佳澄清工艺。响应面分析因素与水平设计见表10，试验设计与结果见表11。

表10响应面分析因素与水平表

表11响应面试验设计与结果

根据表12中的试验数据，采用Design-Expert V8.0.6软件对其进行数据分析，得到的透光率R对沸石-壳聚糖量(A)、澄清时间(B)和澄清温度(C)的回归方程为：

Y＝92.08+0.79×A+0.33×B+0.84×C-0.10×AB-0.48×AC-0.30×A²-0.48×B²-0.40×C²

表12回归模型方差分析

注：***P＜0.0001表示极显著，*P＜0.05为显著

方程回归分析及方差分析结果见表13。模型的F＝98.42，P<0.0001<0.001，表明实验所采用的二次模型是极显著的，具有统计学意义。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程度，即二者差异的程度。本例失拟项P值为0.2747>0.05，对模型是有利的，无失拟因素存在，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。

因素A沸石-壳聚糖加入量和C澄清温度的P值均<0.0001，说明因素A沸石-壳聚糖加入量和C澄清温度对透光率的影响是极显著的，而因素B澄清时间的P值＝0.0002<0.05，所以因素B澄清时间对透光率有显著影响；A的2次方的P值<0.0001，说明A的2次方对透光率有极显著的影响，B的2次方和C的2次方P值<0.05，说明B的2次方和C的2次方对透光率有显著影响。

校正系数R²＝0.9821；R²(Adj)＝0.9216，变异系数C.V.％为0.14％说明该模型的拟合性较好。

6.3验证试验

采用Design-Expert V8.0.5b软件分析，得到梅子果酒最佳低温离心辅助澄清工艺为：沸石-壳聚糖加入量7g.L^-1、澄清时间2.81h、澄清温度36.17℃、低温离心时间5min，透光率为92.6119％。

为验证响应面法的可靠性，同时考虑到实际操作的可行性，将工艺条件修正为：沸石-壳聚糖加入量7g.L^-1、澄清时间169min、澄清温度36℃、低温离心时间5min。采用上述优化条件进行3次验证试验，梅子果酒的透光率实测值为92.73％，与理论预测值的相对偏差为0.13％，与理论预测值基本一致。

7小结

针对梅子果酒，本试验对五种澄清剂(明胶、皂土、壳聚糖、ZTC101、ZTCⅢ、沸石-壳聚糖)的澄清效果进行考察，其中沸石-壳聚糖、5％的皂土和1％的壳聚糖澄清效果较好，以上三种中又属5％皂土的澄清力度最好，同时皂土的强吸附性导致酒体的吸光度大幅度下降，且5％的皂土和1％的壳聚糖均为液体，澄清时会影响酒体本身的性质，故选择沸石-壳聚糖试剂对梅子酒进行澄清。

采用低温离心辅助沸石-壳聚糖澄清，通过单因素试验设计，并在此基础上运用三因素三水平的响应面法，优化选择出澄清效果最佳的工艺。确定沸石-壳聚糖最佳澄清工艺为：沸石-壳聚糖加入量7g.L^-1、澄清时间2.81h、澄清温度36.17℃、2℃低温离心时间5min。

实施例5梅子配方酒的制备考察

通过前期层次分析法的多指标综合评价，优选出最佳的浸提工艺为24号鲜青梅:枸杞:大枣:梅子酒为1:0.05:0.05:5(固/液＝kg.L^-1)，纱布过滤、壳聚糖降酸、沸石壳聚糖澄清工艺，由于玉米酒度数较高，酒香浓郁而梅香较淡，对梅子果酒进行口感进价和勾兑调配，制备出口感良好的梅子配方酒。

1仪器与材料

2试验方法

2.1梅子配方酒的感官评价标准

参考中华人民共和国农业行业标准—绿色食品果酒(农业部)中的感官评价内容设置枣酒的感官评价指标项目，参考葡萄酒、啤酒和其他果酒的感官评价评分标准中不同指标评分所占的权重，设置梅子酒不同感官评价指标的评分权重，在用感官质量的模糊数学评价法，构建出梅子酒的感官评价方法为：梅子酒评定域由4个因素构成，即X＝(色泽、香气、滋味、风格)；各因素的权重分别为色泽(0.2)、香气(0.2)、滋味(0.4)、风格(0.2)，即A＝(0.2，0.2，0.4，0.2)。

选取年龄在20-50岁的喜爱饮酒的消费者男女各10人组成人评议组，对酒体感官质量逐一评价，每个因素的评价结果是品评员先给出分数，这些分数划分为优、良、中、差四个个等级；色泽的评分范围为0-20分，香气的评分范围为0-20分，滋味的评分范围为0-40分，风格的评分范围为0-20分，感官评价给分标准如下表13。把每位品评员对各因素评定分值转化为评语域等级，再根据品评员的评级结果，每位评员一票，统计各等级得票数；根据各等级的得票数建立模糊矩阵，并设定感官特殊性：优为100分；良为80分；中为60为分；差为40分，即感官特殊性数集V＝(100 80 60 40)，则样品的模糊综合评分按照下式6-1计算。

T＝R·V (6-1)

计算出各评价指标的模糊评价得分以及产品感官的模糊评价综合得分(即模糊综合评价得分)。模糊综合评分越高，梅子酒的感官品质越好。

表13感官品评标准

2.2最佳浸提工艺的梅子配方酒感官评价

最佳浸提工艺的24号梅子配方酒经过滤、澄清处理后，由于酒体本身酸度较低，为尽量减少其他杂质的引入，直接进行口感的评价。20人的口感品评如下：

表14 24号品评结果

梅子配方酒未经处理24号酒样经品评小组感官品评结果见表14，对品评结果按行进行归一化处理得到模糊关系矩阵Y。

由权重A＝(0.2，0.2，0.4，0.2)对矩阵Y进行隶度归一化处理结果得：R＝(0.25，0.42，0.26，0.07)，进行模糊综合评分，得未处理之前的梅酒综合评分为：77分。此时梅酒呈金黄色，晶莹剔透，酒香浓郁，梅的香味较淡，酸甜度适中，由于白酒味重，有轻微的灼喉之感，为增加梅酒的香味，稀释淡化白酒浓度，本试验选用饮用水、白砂糖、梅酒(梅子:玉米酒＝1kg:1L，浸泡两年)对24号配方的梅子果酒进行勾兑，以增加其特征香味，降低其酒精度数。

2.4梅子配方酒的勾兑工艺正交试验

根据单因素试验结果，选取影响勾兑工艺的三个因素：1:1梅酒加入量(A)，蒸馏水的加入量(B)，白砂糖的加入量(C)作为考察因素，水平表见下表15。每个因素设定3个水平，按照L₉(3³)表设计试验，并按照口感品评模糊评价进行修正，口感品评结果见下表16，正交结果见17，方差分析见18。

表15响应面分析因素与水平表

表16梅子配方酒勾兑品评结果

表17正交试验设计与结果

表18方差分析结果

由表6-6数据分析可知：三个因素对口感的影响程度依次为：1:1梅酒的加入量(A)>糖的加入量(C)>水的加入量(B)。由上表可知F＝30.132，P值＝0.031<0.05，因此所用模型有统计学意义。其中1:1梅酒的加入量和白砂糖的加入量各水平间差异性显著(P<0.05)，而水加入量各水平间差异不显著(0.05<P<0.1)。结合直观分析，最佳勾兑工艺为A₂B₂C₁，即1:1梅酒加入量为0.16mL.mL^-1，水的加入量为0.75mL.mL^-1，白砂糖加入量为0.6g.L^-1。

2.5稳定性冷热处理

由于酒体经过后期调配，相对不稳定，为防止酒体浑浊或产生沉淀而影响口感，对酒体进行冷热交替处理。酒体置于70-80℃水浴锅中保持30min，冷却过0.45μm滤膜，-18℃冷藏，冻结之后在常温解冻，过0.45μm滤膜，直至无沉淀产生，即得成品梅子配方酒。

经冷热交替处理后，酒香更加浓郁，色泽稍有加深，酒体晶莹透亮，常温放置30d未见沉淀产生。

3小结

本试验采用口感模糊评价及正交试验相结合的方法，确定梅子配方酒的最佳勾兑工艺为1:1梅酒加入量为0.16mL.mL^-1，水的加入量为0.75mL.mL^-1，白砂糖加入量为0.6g.L^-1；经冷热交替处理后，酒香更加浓郁，色泽稍有加深，酒体晶莹透亮，有利于增加酒体的稳定性。

实施例6梅子配方酒的UPLC检测

色谱条件

ACQUITYHSS C₁₈柱(2.1×100mm，1.7μm)柱温30℃；流动相为乙腈(A)-5‰乙酸水溶液(B)，梯度洗脱，洗脱条件见表19；流速0.2mL.min^-1，检测波长327nm，进样体积1μL；检测波长范围200-400nm。

表19梯度洗脱程序

对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品0.00244g，用70％甲醇溶液溶解并定容至10mL容量瓶中，得到浓度为0.244mg.mL^-1的绿原酸对照品溶液。

精密称取芦丁对照品0.00111g，用70％甲醇溶液溶解并定容至100mL容量瓶中，得到浓度为0.111mg.mL^-1的芦丁对照品溶液。

供试品溶液的制备

精密量取10mL酒样，50℃旋干，加入70％甲醇溶解过滤，定容到10mL容量瓶中，过0.22μm滤膜备用。

线性关系的考察

分别精密量取绿原酸对照品溶液0.250、0.375、0.500、0.620、0.750、0.875、1.000mL于10mL容量瓶中，70％甲醇溶液定容，测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，Y＝3×10⁷X–24393(R²＝0.9999，n＝7)试验结果表明：绿原酸在12.2mg.L^-1-48.8mg.L^-1范围内与峰面积具有良好的线性关系。

分别精密量取芦丁对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6置于5mL容量瓶中，70％甲醇溶液定容，测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，Y＝6×10⁶X-8808.5(R²＝0.9991，n＝6)试验结果表明：芦丁在2.22mg/L-26.64mg.L^-1范围内与峰面积具有良好的线性关系。

梅子配方酒中绿原酸及芦丁的含量测定结果：

表20梅子配方酒中芦丁和绿原酸含量测定结果

如下图6、7，为混合对照品及酒样的UPLC谱图，按照上述标准曲线分别计算，结果如表20所示，梅子配方酒中的芦丁和绿原酸含量丰富，分别为26.53mg.L^-1和37.73mg.L^-1，绿原酸具有抗菌、利胆、抗病毒，还能增加白血球、止血、缩短血凝和出血时间、兴奋中枢神经系统等多种药理功能，对急性咽喉炎症和化脓性皮肤疾病疗效显著，芦丁具有抗自由基活性、抗脂质过氧化、抗病毒、抗急性胰腺炎等药理作用，可用于多种疾病的治疗。上述两种成分与梅子果酒的功效相关联，可以作为质量检测的物质指标。

Claims (18)

1.一种梅子配方酒的检测方法，其特征在于：它是使用UPLC进行检测的，具体操作如下：

(1)取梅子配方酒，除去溶剂后，使用适当溶剂溶解，制备供试品溶液；

(2)取绿原酸和芦丁，使用适当溶剂溶解，制备对照品溶液；

(3)分别取供试品溶液、对照品溶液注入色谱仪，采用外标法或指纹图谱技术进行检测即可，其色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

流动相：乙腈-乙酸水溶液，梯度洗脱条件：

；

所述梅子配方酒由如下方法制备得到：

A、制备梅子果酒：

按如下配比取原料：

鲜青梅：干大枣：干枸杞：玉米酒＝1 Kg：0.01～0.05 Kg：0.01～0.05 Kg：2～5 L ；其中，青梅为蔷薇科杏属植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的未成熟果实；

取鲜青梅、干大枣、干枸杞，在玉米酒中浸泡0.5年以上，降酸，澄清，即得梅子果酒；

降酸的操作如下：取浸泡后的酒液，加壳聚糖至其浓度为0.05～2.0％Kg/L，静置12～36h，取上清液即可；

澄清的操作如下：取降酸后的上清液，加入沸石负载的壳聚糖至其浓度为5～10g/L，在36～60℃下澄清时间120～180min，1～5℃低温离心，取上清液即可；

B、制备梅子配方酒

1000mL所述梅子果酒，梅酒140～200mL，饮用水500～1000mL，白糖0.6～1.4g，按配比混合均匀，进行冷热交替处理并去除沉淀，直至无沉淀产生，即得梅子配方酒；其中，所述梅酒为鲜青梅：玉米酒＝1：1～1.5Kg/L浸泡1～2年制备得到。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：乙酸水溶液中乙酸的浓度为0.1％～5％v/v。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：乙酸水溶液中乙酸的浓度为0.1％～1％。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：柱温选自25～35℃，检测波长选自327±5nm。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：色谱柱的尺寸为2.1×100mm。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述适当溶剂选自甲醇、水合甲醇、乙腈或水合乙腈。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：降酸的操作中，壳聚糖浓度为1.0％。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：降酸的操作中，静置时间为24h。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：澄清的操作中，沸石负载的壳聚糖浓度为7g/L，澄清温度为36～40℃，澄清时间为160～180min，离心温度1～4℃。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤A中，鲜青梅：干大枣：干枸杞：玉米酒＝1 Kg：0.05 Kg：0.05 Kg：3～5L。

11.根据权利要求10所述的检测 方法，其特征在于：鲜青梅：干大枣：干枸杞：玉米酒＝1 Kg：0.05 Kg：0.05 Kg：5L；所述玉米酒酒精含量为38～45度。

12.根据权利要求1或10所述的检测方法，其特征在于：步骤A中，浸泡温度为室温，浸泡时间为0.5～2年。

13.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤B中，1000mL梅子果酒，梅酒160mL，饮用水750mL，白糖0.6g；其中，所述梅酒为鲜青梅：玉米酒＝1：1Kg/L浸泡2年制备得到。

14.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述梅子配方酒酒精度为10～11度，总干浸物为19～20g/L，总糖含量为12～13g/L，总酸含量为6～7g/L。

15.一种梅子配方酒中同时检测绿原酸和芦丁的方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

它是使用UPLC进行检测的，具体操作如下：

(1)取梅子配方酒，除去溶剂后，使用适当溶剂溶解，制备供试品溶液；

(2)取绿原酸和芦丁，使用适当溶剂溶解，制备对照品溶液；

(3)分别取供试品溶液、对照品溶液注入色谱仪，采用外标法进行检测即可，其色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

流动相：乙腈-乙酸水溶液，梯度洗脱条件：

所述梅子配方酒由如下方法制备得到：

A、制备梅子果酒：

按如下配比取原料：

鲜青梅：干大枣：干枸杞：玉米酒＝1 Kg：0.01～0.05 Kg：0.01～0.05 Kg：2～5L；其中，青梅为蔷薇科杏属植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的未成熟果实；

取鲜青梅、干大枣、干枸杞，在玉米酒中浸泡0.5年以上，降酸，澄清，即得梅子果酒；

降酸的操作如下：取浸泡后的酒液，加壳聚糖至其浓度为0.05～2.0％Kg/L，静置12～36h，取上清液即可；

澄清的操作如下：取降酸后的上清液，加入沸石负载的壳聚糖至其浓度为5～10g/L，在36～60℃下澄清时间120～180min，1～5℃低温离心，取上清液即可；

B、制备梅子配方酒

1000mL所述梅子果酒，梅酒140～200mL，饮用水500～1000mL，白糖0.6～1.4g，按配比混合均匀，进行冷热交替处理并去除沉淀，直至无沉淀产生，即得梅子配方酒；其中，所述梅酒为鲜青梅：玉米酒＝1：1～1.5Kg/L浸泡1～2年制备得到。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：降酸的操作中，壳聚糖浓度为1.0％。

17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：降酸的操作中，静置时间为24h。

18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：澄清的操作中，沸石负载的壳聚糖浓度为7g/L，澄清温度为36～40℃，澄清时间为160～180min，离心温度1～4℃。