CN106987621A - 通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法。该方法针对由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡的情况，包括如下：改变原有PCR扩增条件来增强PCR扩增时引物的容错性。该方法可有效解决由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡，重要优点是，对类似HLA的复杂基因进行PCR扩增时，即使引物序列上出现新的未知的多态性位点时，也能较好的进行扩增，减少等位基因扩增不平衡，有效避免其中一个等位基因扩增失败而导致的检测错误，而且还避免了针对引物结合区存在不同多态性位点时，需设计大量不同序列匹配引物进行扩增的难题。

Description

通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法
技术领域
本发明属于基因扩增领域，涉及一种解决等位基因扩增不平衡的方法，具体涉及一种通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法。
背景技术
PCR技术即基于聚合酶链式反应，是一种可以特异放大扩增特定基因片段的技术，可以使基因片段数万倍的增加。其原理的核心是寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合杂交，形成部分双链，在DNA聚合酶的作用下进行DNA合成。而寡核苷酸引物与单链DNA模板的结合是基于碱基配对原则：碱基配对遵循G(鸟嘌呤)：C(胞嘧啶)、A(腺嘌呤)：T(胸腺嘧啶)/U(尿嘧啶)的Watson-Crick碱基配对原则。
人体内每个细胞内有23对染色体，通常基因为双等位基因。进行普通PCR扩增时，两个等位基因一般情况下没有扩增效率的差异。但在复杂基因时，影响PCR扩增效率的因素会导致两个等位基因的扩增效率存在明显扩增差异，即等位基因扩增不平衡，严重时可出现一个等位基因扩增产量极少(扩增失败)，杂合的等位基因被错误的检测为纯合等位基因。例如HLA基因就是典型的复杂基因，具有高GC含量、高度同源性，高度多态性等特点。目前，HLA基因总数已经超过1万个，这些基因的有效扩增是HLA高分辨分型的重要基础。但以上特点决定了HLA基因的扩增引物设计特别困难以及扩增难度很高，容易出现HLA基因非特异扩增、等位基因丢失或等位基因扩增不平衡等问题，即相应基因扩增效率低或失败(扩增不平衡)使杂合基因位点丢失一个等位基因，分型错误为纯合基因位点。
当PCR引物与模板结合区域发生碱基错配时，会使核苷酸间结合能力下降，DNA双链结构不稳定，PCR扩增效率低下或扩增失败。当引物与一个等位基因匹配，而另一个等位基因不匹配，就会出现等位基因扩增不平衡现象。因此设计出序列匹配的引物成为PCR的关键因素。针对以上出现的等位基因扩增不平衡现象，现有技术采用如下策略进行解决：重新设计匹配的PCR引物。由于引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况，例如碱基突变等原因造成的等位基因扩增效率低，扩增不平衡时，重新设计与模板序列匹配的引物，这样就能解决扩增效率低下问题。
然而现有的解决方案存在着如下弊端：重新设计匹配的PCR引物，在面临高度复杂的基因，例如HLA基因，有大量的多态性位点，而且还有很多新的多态性(突变)位点没发现。如果采用发现一次引物与模板序列不匹配，就重新设计引物的策略，很快就会面临需要设计大量引物，引物设计极其困难的情况。特别是进行检测时，在引物结合区域出现从未发现的突变位点，很可能会导致严重的等位基因扩增不平衡现象，出现等位基因丢失，从而导致检测结果错误。
发明内容
本发明的目的是提供一种解决等位基因扩增不平衡的方法。
本发明所提供的解决等位基因扩增不平衡的方法，是针对由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡的情况。具体可包括如下步骤：通过改变原有PCR扩增条件来增强PCR扩增时引物的容错性，从而解决等位基因扩增不平衡的问题；所述原有PCR扩增条件为：对所述待测等位基因进行PCR扩增，出现所述待测等位基因扩增不平衡情况时所采用的PCR扩增条件。
其中，所述改变原有PCR扩增条件为如下中的任一种或任几种：
(a)在对所述待测等位基因进行PCR扩增时，降低退火温度；
(b)在对所述待测等位基因进行PCR扩增时，增加PCR缓冲液的离子浓度(如Mg2+)；
(c)在对所述待测等位基因进行PCR扩增时，增加引物序列的长度。
在所述方法中，在对所述待测等位基因进行PCR扩增时，除了作出所述(a)-所述(c)的改变外，其余的扩增条件均可与所述原有PCR扩增条件中的相应条件保持一致。
在所述方法中，进行所述(a)、所述(b)或/和所述(c)时，以既能增强PCR扩增时引物的容错性又能保证所述待测等位基因的特异性扩增为度。
所述(a)中，在已初步优化好的PCR扩增程序中，以梯度温度(例如1℃的梯度)递减的形式逐步降低退火温度，一直降至既能成功扩增与引物完全匹配的靶基因，也能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的退火温度；所述已初步优化好的PCR扩增程序为能够成功扩增与所述引物完全匹配的靶基因，但不能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的PCR扩增程序。
所述(b)中，在已初步优化好的PCR扩增体系中，以梯度浓度(如1mM的浓度梯度)递增的形式增加Mg2+浓度，一直增加至既能成功扩增与引物完全匹配的靶基因，也能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的Mg2+浓度；所述已初步优化好的PCR扩增体系为能够成功扩增与所述引物完全匹配的靶基因，但不能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的PCR扩增体系。
所述(c)中，在已初步优化好的引物中，以2-3个碱基梯度递增的形式增加用于扩增所述待测等位基因的原有引物对中与靶基因序列不完全匹配的引物的长度(可以在引物5’端或3’端增加，一般优先在引物的5’端增加引物长度)，一直增加至既能成功扩增与所述引物完全匹配的靶基因，也能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的引物长度；所述已初步优化好的引物为能够成功扩增与所述引物完全匹配的靶基因，但不能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的引物。
在所述方法中，所述待测等位基因可为任意基因，特别是高度复杂的基因，例如HLA基因，具体如HLA-B基因。
在本发明的实施例中，所述待测等位基因具体为基因型分别为B*46:01:01(IMGT/HLA Acc No:HLA00331)和B*51:01:02(IMGT/HLA Acc No:HLA00345)的HLA-B基因。
相应的，用于扩增所述待测等位基因的原有引物对为由上游引物BF和下游引物BR组成的引物对；所述上游引物BF的序列如序列表中序列1所示；所述下游引物BR的序列如序列表中序列2所示；其中，所述上游引物BF与基因型为B*51:01:02的HLA-B基因不完全匹配，B*51:01:02等位基因的引物区域(非编码区)序列存在三个T的碱基插入，导致B*51:01:02扩增效率很低，甚至失败。
在本发明的第一个实例中，所述方法是通过进行所述(a)来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题的；所述退火温度由65℃降至62℃，其余PCR扩增条件不变。
在本发明的第二个实例中，所述方法是通过进行所述(b)来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题的；所述Mg2+浓度由2.5mM升至5.5mM，其余PCR扩增条件不变。
在本发明的第三个实例中，所述方法是通过进行所述(c)来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题的；将所述上游引物BF的5’末端增加5个碱基(CCGGG),引物长度由原来的23个碱基升至28个碱基，其余PCR扩增条件不变。
进一步，当采用所述(a)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时(实施例1步骤一)，用于扩增所述待测等位基因的引物对为所述原有引物对；所述PCR扩增体系中Mg2+浓度为2.5mM。当采用所述(b)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时(实施例1步骤二)，用于扩增所述待测等位基因的引物对为所述原有引物对；所述退火温度为65℃。当采用所述(c)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时(实施例1步骤三)，所述PCR扩增体系中Mg2+浓度为2.5mM；所述退火温度为65℃。
更加具体的，所述原有PCR扩增条件参见实施例1步骤一。
本发明针对由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡的情况，提供了通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法。实验证明，该方法确实可以有效的解决由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡。该方法很重要的优点是，对类似HLA基因的复杂基因进行PCR扩增时，即使引物序列上出现新的未知的多态性(突变)位点时，也能较好的进行扩增，减少等位基因扩增不平衡，有效避免了其中一个等位基因扩增失败而导致的检测错误。
附图说明
图1为B*51:01:02等位基因的引物区域(非编码区)序列，与标准的HLA-B基因相比较，存在三个T的碱基插入。
图2为B*46:01:01/B*51:01:02基因型样品在调整退火温度前后的测序结果。自上而下退火温度分别是：62℃、63℃、64℃、65℃。
图3为B*46:01:01/B*51:01:02基因型样品在调整Mg2+前后的测序结果。退火温度为65℃的情况下，加大Mg2+浓度测序杂合情况，自上而下Mg2+终浓度分别是2.5Mm(增加0Mm)、3.5Mm(增加1Mm)、4.5Mm(增加2Mm)、5.5Mm(增加3Mm)
图4为B*46:01:01/B*51:01:02基因型样品在调整引物长度前后的测序结果。退火温度为65℃的情况下，增加引物长度的测序杂合情况，其中延长3个碱基的BF命名为YHF5延长5个碱基的BF命名为YHF6。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡
PCR退火过程中，寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合杂交，形成部分双链。高严谨度情况下，碱基完全互补时，杂交双链才稳定；低严谨度情况下，碱基并不完全配对的杂交双链也可稳定形成。本发明研究发现，当出现由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡问题时，适当降低退火温度、适当增加PCR缓冲液的离子浓度、适当增长引物序列长度等，可以增强引物扩增的容错性，有效扩增引物区突变的等位基因。另外，增强引物扩增容错性的同时，很可能影响引物的特异性。因此实际中需要多次实验，在增强引物容错性的同时，又能保证等位基因的特异性扩增。
下面以具体实例对这种通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡问题的方法进行阐述。
等位基因：基因型分别为B*46:01:01(IMGT/HLA Acc No:HLA00331)和B*51:01:02(IMGT/HLA Acc No:HLA00345)的HLA-B基因。
一、通过适当降低退火温度来解决等位基因扩增不平衡问题
1、原有PCR扩增条件如下：
(1)扩增引物：为用于扩增B*46:01:01和B*51:01:02等位基因的引物，上游引物BF，下游引物BR。
BF：5’-GTCCCAGTTCTAAAGTCCCCACG-3’(序列1)；
BR：5’-TCAAGGGAGGGCGACATTCTAG-3’(序列2)。
B*51:01:02等位基因的上游引物区域(非编码区)序列有3个碱基与标准HLA-B基因(包括基因型为B*46:01:01的HLA-B基因)序列不同，即存在3个T碱基的插入，导致与标准HLA-B基因序列不匹配(图1)。
(2)PCR扩增反应体系：
(3)PCR扩增反应程序：
96℃3min；96℃25s，65℃50s，72℃1min，35个循环；72℃5min；12℃保存。
结果显示：采用如上原有PCR扩增条件对基因型为B*46:01:01/B*51:01:02杂合型的HLA-B基因进行PCR扩增时，会产生等位基因扩增不平衡的情况，仅扩增分型得到基因型为B*46:01:01，而遗漏了B*51:01:02等位基因。如图2中“调整前”所示。
2、改变PCR扩增反应程序中的退火温度
扩增引物和PCR扩增反应体系完全同步骤1。PCR扩增反应程序中仅改变退火温度，将其从原来的65℃以1℃的梯度逐步降低(一直降至能成功扩增B*46:01:01和B*51:01:02的合适退火温度)，其余与步骤1相比均不变。
结果显示：当退火温度降低到62℃时，对基因型为B*46:01:01/B*51:01:02杂合型的HLA-B基因进行PCR扩增，在B*51:01:02引物区3个T的碱基不匹配情况下，仍然成功扩增出B*46:01:01和B*51:01:02两个等位基因，且没有非特异扩增，分型结果正确，即B*46:01:01/B*51:01:02。如图2中“调整后”中所示。
二、通过适当增加PCR缓冲液的离子浓度来解决等位基因扩增不平衡问题
1、原有PCR扩增条件同步骤一1。
结果显示：采用如上原有PCR扩增条件对基因型为B*46:01:01/B*51:01:02杂合型的HLA-B基因进行PCR扩增时，会产生等位基因扩增不平衡的情况，仅扩增分型得到基因型为B*46:01:01，而遗漏了B*51:01:02等位基因。如图3中“调整前”所示。
2、改变PCR缓冲液里的Mg2+浓度
扩增引物和PCR扩增反应程序完全同步骤1。PCR扩增反应体系中Mg2+浓度由2.5mM以1mM浓度梯度逐步上升(一直升至能成功扩增B*46:01:01和B*51:01:02的合适Mg2+浓度)，其余与步骤1相比均不变。
结果显示：当Mg2+浓度升至5.5mM时，对基因型为B*46:01:01/B*51:01:02杂合型的HLA-B基因进行PCR扩增时，在B*51:01:02引物区3个T的碱基不匹配情况下，仍然成功扩增出B*46:01:01和B*51:01:02两个等位基因，且没有非特异扩增，分型结果正确，即B*46:01:01/B*51:01:02。如图3中“调整后”中所示。
三、通过适当增加引物序列长度来解决等位基因扩增不平衡问题
1、原有PCR扩增条件同步骤一1。
结果显示：采用如上原有PCR扩增条件对基因型为B*46:01:01/B*51:01:02杂合型的HLA-B基因进行PCR扩增时，会产生等位基因扩增不平衡的情况，仅扩增分型得到基因型为B*46:01:01，而遗漏了B*51:01:02等位基因。如图4中“调整前”所示。
2、改变PCR扩增引物BF的长度
PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序完全同步骤1。以2-3个碱基梯度递增，在上游引物BF的5’端增加其长度，下游引物BR长度及序列均不变。
结果显示：当上游引物BF的5’端增加5个碱基，即全长28个碱基，引物序列为：5’-CCGGGGTCCCAGTTCTAAAGTCCCCACG-3’(序列3，下划线部分为增加的5个碱基)时，对基因型为B*46:01:01/B*51:01:02杂合型的HLA-B基因进行PCR扩增时，在B*51:01:02引物区3个T的碱基不匹配情况下，仍然成功扩增出B*46:01:01和B*51:01:02两个等位基因，且没有非特异扩增，分型结果正确，即B*46:01:01/B*51:01:02。如图4中“调整后”中所示。
以上实验结果表明，本发明所提供的方法对类似HLA基因的复杂基因进行PCR扩增，在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况时也能成功扩增，减少等位基因扩增不平衡，有效避免了其中一个等位基因扩增失败，出现检测错误。
<110> 北京博奥晶典生物技术有限公司；成都博奥晶芯生物科技有限公司
<120> 通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法
<130> GNCLN170603
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gtcccagttc taaagtcccc acg 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
<400> 2
tcaagggagg gcgacattct ag 22
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
<400> 3
ccggggtccc agttctaaag tccccacg 28

Claims (10)

1.一种解决由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡的方法，包括如下步骤：通过改变原有PCR扩增条件来增强PCR扩增时引物的容错性，从而解决等位基因扩增不平衡的问题；所述原有PCR扩增条件为：对所述待测等位基因进行PCR扩增，出现所述待测等位基因扩增不平衡情况时所采用的PCR扩增条件。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述改变原有PCR扩增条件为如下中的任一种或任几种：
(a)在对所述待测等位基因进行PCR扩增时，降低退火温度；
(b)在对所述待测等位基因进行PCR扩增时，增加PCR缓冲液的离子浓度；
(c)在对所述待测等位基因进行PCR扩增时，增加引物序列的长度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：进行所述(a)、所述(b)或/和所述(c)时，以既能增强PCR扩增时引物的容错性又能保证所述待测等位基因的特异性扩增为度。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述(a)中，在已初步优化好的PCR扩增程序中，以梯度温度递减的形式逐步降低退火温度，一直降至既能成功扩增与引物完全匹配的靶基因，也能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的退火温度；所述已初步优化好的PCR扩增程序为能够成功扩增与所述引物完全匹配的靶基因，但不能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的PCR扩增程序。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述(b)中，在已初步优化好的PCR扩增体系中，以梯度浓度递增的形式增加Mg2+浓度，一直增加至既能成功扩增与引物完全匹配的靶基因，也能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的Mg2+浓度；所述已初步优化好的PCR扩增体系为能够成功扩增与所述引物完全匹配的靶基因，但不能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的PCR扩增体系。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：所述(c)中，在已初步优化好的引物中，以2-3个碱基梯度递增的形式增加用于扩增所述待测等位基因的原有引物对中与靶基因序列不完全匹配的引物的长度，一直增加至既能成功扩增与引物完全匹配的靶基因，也能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的引物长度；所述已初步优化好的引物为能够成功扩增与所述引物完全匹配的靶基因，但不能扩增与所述引物不完全匹配的靶基因的引物。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述待测等位基因为HLA基因或其他任意基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述待测等位基因为基因型分别为B*46:01:01和B*51:01:02的HLA-B基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：用于扩增所述待测等位基因的原有引物对为由上游引物BF和下游引物BR组成的引物对；所述上游引物BF的序列如序列表中序列1所示；所述下游引物BR的序列如序列表中序列2所示；其中，所述上游引物BF与基因型为B*51:01:02的HLA-B基因不完全匹配；
所述方法是通过进行所述(a)或所述(b)或所述(c)来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题的；
当采用所述(a)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，所述退火温度由65℃降至62℃，其余PCR扩增条件不变；
当采用所述(b)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，所述PCR扩增反应体系中Mg2+浓度由2.5mM升至5.5mM，其余PCR扩增条件不变；
当采用所述(c)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，将所述上游引物BF的5’末端增加5个碱基，其余PCR扩增条件不变。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：当采用所述(a)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，用于扩增所述待测等位基因的引物对为所述原有引物对；所述PCR扩增体系中Mg2+浓度为2.5mM；
当采用所述(b)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，用于扩增所述待测等位基因的引物对为所述原有引物对；所述退火温度为65℃；
当采用所述(c)的方式来解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题时，所述PCR扩增体系中Mg2+浓度为2.5mM；所述退火温度为65℃。
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CN1896284A (zh) * 2006-06-30 2007-01-17 博奥生物有限公司 一种鉴别等位基因类型的方法
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