CN106986947A - 一种枸杞叶芽多糖的制备方法及其在治疗糖尿病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种枸杞叶芽多糖的制备方法及其在制备治疗糖尿病药物中的应用。其特点是，包括如下步骤：取宁杞9号枸杞鲜叶芽烘干；粉碎至60‑80目；将得到的枸杞叶芽干粉按照料液比例为1g：10ml‑1g：30ml，置入提取罐中；控制提取温度50‑90℃，提取时间4h‑10h；将提取液移至浓缩罐中，控制浓缩温度50‑80℃，浓缩压力‑0.05‑‑0.09MPa，浓缩时间6‑8h，浓缩至原液体积的10‑40％；将浓缩液置入醇沉灌中，加入4倍浓缩液体积的浓度为95％的食用酒精，过夜醇沉。本发明的枸杞叶芽多糖可以用于抑制DPP4酶的活性，以治疗2型糖尿病，从而作为保健品食用。

Description

一种枸杞叶芽多糖的制备方法及其在治疗糖尿病药物中的 应用
技术领域
本发明涉及一种枸杞叶芽多糖的制备方法及其在制备治疗糖尿病药物中的应用。
背景技术
多糖，又称多聚糖，是一类由十个以上的单糖分子通过脱水聚合而成的结构复杂的高分子化合物。多糖是自然界中种类最丰富、含量最多的生物大分子，与蛋白质、核酸、脂类一起被称为生命活动必需的四大基本物质，广泛存在于动物、植物和微生物的细胞内外。随着科学技术的发展，多糖由于其种类和生物功能的多样性而受到越来越多的关注。研究表明，多糖有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、防血脂和调节免疫功能等效果，有很高的利用价值及应用前景。
枸杞叶也叫天精草，是一种重要的药食同源植物，在宁夏、广东等地常将枸杞叶作为春季的新鲜蔬菜食用。枸杞叶芽营养丰富，有研究表明枸杞叶中含有多糖类、黄酮类、生物碱、萜类和甾醇类等多种生物活性的物质，并含有大量的矿物质、微量元素和丰富的蛋白质及20多种氨基酸(包括人体必须的8种氨基酸)，且其营养成分明显优于枸杞果。《本草纲目》中记载枸杞叶有补虚益精、坚筋耐老、养肝明目、散疮肿、除热毒、去皮骨节间风和补五劳七伤等功效。而现代医学则证明枸杞叶具有降低血糖、血压、血脂、预防心血管疾病、白内障，抗氧化、疲劳、癌症、衰老，防止微生物感染，清除自由基，促进益生菌细胞生长，耐缺氧等众多功能。
然而，由于关注度低、技术限制等原因，枸杞叶芽还没有得到很好的利用，其深加工产品也较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种枸杞叶芽多糖的制备方法，能够大大提高了叶芽多糖的得率和纯度，所得的枸杞叶芽多糖可以用于抑制DPP4酶的活性以治疗2型糖尿病，从而能够作为保健品食用；
本发明的目的之二是提供一种上述枸杞叶芽多糖在治疗糖尿病药物中的应用。
一种枸杞叶芽多糖的制备方法，其特别之处在于，包括如下步骤：
(1)取枸杞鲜叶芽烘干；
(2)粉碎至60-80目；
(3)将得到的枸杞叶芽干粉按照料液比例为1g：10ml-1g：30ml，置入提取罐中；
(4)控制提取温度50-90℃，提取时间4h-10h；
(5)将提取液移至浓缩罐中，控制浓缩温度50-80℃，浓缩压力-0.08- -0.09MPa，浓缩时间6-8h，浓缩至原液体积的10-40％；
(6)将浓缩液置入醇沉灌中，加入4倍浓缩液体积的浓度为95％的食用酒精，过夜醇沉；
(7)去上清液，将醇沉后的物质速冻，然后置于冷冻干燥机干燥至恒重，即得枸杞叶芽粗多糖；
(8)初步纯化，具体是将冻干后得到的枸杞叶芽粗多糖粉末溶于蒸馏水，调节pH为9-10，充分溶解后加入0.03％的碱性蛋白酶，在40-55℃酶解4-5h，得到的溶液经微滤后进行超滤，控制超滤膜分子截留量为10 kDa，收集分子量大于10kDa的溶液，将该溶液采用步骤(6)的方法再次用乙醇沉淀并采用步骤(7)的方法冻干后即得枸杞叶芽多糖。
进一步的，包括如下步骤：将步骤(8)得到的枸杞叶芽多糖，进行如下处理：(9)取DEAE-Cellulose 52经预处理后装入60cm×2.6cm层析柱中，用去离子水过夜平衡，控制流速为1mL/min，将枸杞叶多糖粉末0.5 g用去离子水溶解后加入到层析柱中，然后依次用去离子水、0.05mol/L的 NaCl溶液、0.1mol/L的NaCl溶液、0.2mol/L的NaCl溶液、0.4mol/L的NaCl溶液洗脱2-3个柱体积，控制流速为1mL/min，分管收集，每管10mL，用苯酚硫酸法测定每管中的糖含量，并以吸光度为纵坐标、管数为横坐标绘制洗脱曲线，将同一洗脱峰中的溶液合并，得到合并液体体积，超滤除盐并浓缩，利用超滤的方法，加入合并液9倍体积的去离子水进行超滤，超滤膜分子截留量为10kDa，收集分子量大于10kDa的溶液，然后将此部分体积浓缩为原来的20％，再次根据权利要求1中记载的步骤(6)的方法进行醇沉，根据权利要求1中记载的步骤(7)的方法冻干得到5种多糖，分别命名为LBLP-1、LBLP-2、LBLP-3、LBLP-4、LBLP-5。
进一步的，将步骤(9)得到的5种多糖，进行如下处理：(10)取Sephadex G-100经预处理后装入60cm×2.6cm层析柱中，蒸馏水过夜平衡，控制流速为1mL/min，分别取5种多糖0.1g分别充分溶解于蒸馏水后加到层析柱中，以1mL/min的流速洗脱2个柱体积并分管收集，每管收集10mL，并用苯酚硫酸法测定每管的糖含量，以吸光度为纵坐标、管数为横坐标绘制洗脱曲线，将同一洗脱峰中的溶液合并，浓缩至原体积的20％-40％后根据步骤(6)醇沉并根据步骤(7)冻干得到枸杞叶芽多糖。
步骤(1)中烘干具体是指在50-65℃烘干6-10h。
步骤(7)中具体是速冻至-40℃，然后在冷冻干燥机-40℃干燥24h-48h。
步骤(8)中微滤具体是指先过0.8μm后过0.45μm滤膜，从而将大分子物质去除防止堵塞超滤膜；步骤(8)中用NaOH溶液调节pH。
步骤(1)中的枸杞采用宁杞9号枸杞。
一种用上述任意一种制备方法制备的枸杞叶芽多糖在治疗糖尿病药物中的应用。
本发明的有益效果是：提供了一种利用上述制备方法所得的枸杞叶芽多糖的用途，即可以用于抑制DPP4酶的活性，以治疗2型糖尿病，从而作为保健品食用。另外，本发明的制备方法通过碱性蛋白酶水解、超滤、层析柱分离等方法将枸杞叶芽多糖进行纯化，综合考虑了枸杞叶芽多糖的得率和纯度，从而大大提高了叶芽多糖的得率和纯度。
附图说明
图1是枸杞叶多糖经DEAE-Cellulose 52分离的洗脱曲线(苯酚硫酸法检测)；
图2是经DEAE-Cellulose 52分离后得到的LBLP-1的洗脱曲线(苯酚硫酸法检测)；
图3是经DEAE-Cellulose 52分离后得到的LBLP-2的洗脱曲线(苯酚硫酸法检测)；
图4是经DEAE-Cellulose 52分离后得到的LBLP-3的洗脱曲线(苯酚硫酸法检测)；
图5是经DEAE-Cellulose 52分离后得到的LBLP-4的洗脱曲线(苯酚硫酸法检测)；
图6是枸杞叶多糖LBLP-1的分子量测定图(HPSEC)；
图7是枸杞叶多糖LBLP-3的分子量测定图(HPSEC)；
图8是枸杞叶多糖LBLP-5的分子量测定图(HPSEC)；
图9是阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖7 种单糖标准品的气相色谱图；
图10是粗多糖经水解和硅烷化后的气相色谱图(其中：1阿拉伯糖， 2鼠李糖，3核糖，4木糖，5甘露糖，6半乳糖，7葡萄糖)；
图11是LBLP-1经水解和硅烷化后的气相色谱图(其中：1阿拉伯糖， 2核糖)；
图12是LBLP-3经水解和硅烷化后的气相色谱图(其中：1阿拉伯糖， 2鼠李糖，3核糖，4木糖，6半乳糖，7葡萄糖)；
图13是LBLP-5经水解和硅烷化后的气相色谱图(其中：1阿拉伯糖， 2鼠李糖，3核糖，4木糖，6半乳糖，7葡萄糖)。
具体实施方式
本发明要解决的技术问题是提供一种枸杞叶芽多糖的制备方法并探究其用途。为了解决上述技术问题，本发明提供了枸杞叶芽多糖的制备方法及其在治疗糖尿病药物中的应用。包括以下步骤：
(1)原料处理：宁杞9号鲜叶芽50-65℃烘干6-10h；
(2)粉碎机粉碎：60-80目；
(3)料液：按照1g：10ml-1g：30ml的原料及纯净水比例，置入提取罐中；
(4)提取温度：控制温度50-90℃；
(5)提取时间:提取时间4h-10h；
(6)浓缩:将提取液转移至浓缩罐中，浓缩温度控制50-80℃，浓缩压力-0.06-0.08MPa，浓缩时间6-8h，浓缩至原液体积的10-40％；
(7)将浓缩液置入醇沉灌中，用95％食用酒精调至酒精终浓度80％后过夜醇沉；
(8)去上清液后，将醇沉后的物质速冻后，置冷冻干燥机，干燥24-48 h，即得枸杞叶芽粗多糖；
(9)初步纯化：将粗多糖溶于蒸馏水，NaOH溶液调节pH为9-10，加入适量碱性蛋白酶，40℃酶解4h，溶液经过滤后进行超滤，超滤膜分子截留量为10kDa，收集分子量大于10kDa的溶液，再次用乙醇沉淀并干燥后得到纯度较高的多糖粉末。
作为本发明—枸杞叶多糖的制备方法的改进，将步骤(9)中得到的多糖粉末进行以下步骤：
(10)DEAE-Cellulose 52离子交换层析柱分离：
DEAE-Cellulose 52经预处理后装入层析柱(60cm×2.6cm)中，用去离子水过夜平衡(流速为1mL/min)，将干燥的枸杞叶多糖粉末0.5g用去离子水溶解后加入到层析柱中，然后依次用去离子水、0.05、0.1、0.2、0.4 mol/L的NaCl溶液洗脱2-3个柱体积(流速为1mL/min)，分管收集，每管10mL。用苯酚硫酸法测定每管中的糖含量，并以吸光度为纵坐标、管数为横坐标绘制洗脱曲线，将同一洗脱峰中的溶液合并，超滤除盐并浓缩 (超滤膜截留量为10kDa)，再次醇沉冻干得到5种多糖，分别命名为 LBLP-1、LBLP-2、LBLP-3、LBLP-4、LBLP-5。
作为本发明，枸杞叶多糖制备方法的进一步改进，将步骤(10)中得到的各部分多糖进行以下步骤：
(11)Sephadex G-100层析柱分离：
Sephadex G-100经预处理后装入层析柱(中60cm×2.6cm)，蒸馏水过夜平衡(流速为1mL/min)，将步骤(10)中得到的各部分多糖0.1g溶于蒸馏水后加到层析柱中，以1mL/min的流速洗脱2个柱体积并分管收集，每管收集10mL，并用苯酚硫酸法测定每管的糖含量，以吸光度为纵坐标、管数为横坐标绘制洗脱曲线，将同一洗脱峰中的溶液合并，浓缩后醇沉并冻干得到枸杞叶芽多糖。
本发明同时还公开了利用上述制备方法所得的枸杞叶芽多糖在治疗糖尿病药物中的应用：用于抑制DPP4酶的活性，以治疗2型糖尿病，从而可作为保健品食用。
本发明提供了枸杞叶芽多糖的制备方法及其治疗糖尿病药物中的应用，并通过碱性蛋白酶水解、超滤、层析柱分离等方法将枸杞叶芽多糖进行纯化，综合考虑了枸杞叶芽多糖的得率和纯度，大大提高了叶芽多糖的得率和纯度。
本发明所得的枸杞叶芽多糖经分离纯化后得到5个组分 (DEAE-Cellulose 52分离洗脱曲线如如图1所示)：LBLP-1、LBLP-2、 LBLP-3、LBLP-4、LBLP-5。其中LBLP-2糖含量最少，且不能被乙醇沉淀；LBLP-3糖含量最高，是枸杞叶多糖的主要组成成分；LBLP-4在80％溶液中成胶状物质，质地松散且上浮；LBLP-5在80％乙醇中呈胶状物质，质地紧密且下沉。枸杞叶中，粗多糖、LBLP-1、LBLP-3、LBLP-4、LBLP-5 对DPP4均有抑制效果，且与其浓度成正相关，各组分的IC50分别为7.75 mg/mL、0.11mg/mL、0.61mg/mL、31.94mg/mL、14.82mg/mL。
本发明同时还提供了枸杞叶芽多糖中各组分的结构特征。经 DEAE-Cellulose 52分离后的多糖再用Sephadex G-100进行进一步纯化，其洗脱曲线如图2所示。进一步的，用GC、GC-MS、HPSEC、NMR等分析枸杞叶多糖的结构特征，发现LBLP-1的重复单元为 [→3)-α-D-Ribf-(1→5)-α-L-Arap-(1→3)-α-D-Ribf-(1→]n(即由1,3键连接的α,D呋喃型核糖和1,5键连接的α,L吡喃型阿拉伯糖以2：1的比例连接而成的直链多糖)，其分子量为35.37kDa。LBLP-3由阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖6种单糖构成，含量比为1.76:1.19:2.32:1.00: 1.88:3.18，但LBLP-3并不是分子量均一的多糖。经测定，LBLP-3由3个分子量的单糖构成，其分子量分别为31.55kDa、62.76kDa、97.43kDa。 LBLP-5的单糖组成与LBLP-3相同，当含量比为1.81:2.71:2.94:2.90:1.00: 1.45，分子量为164.00kDa。而枸杞叶粗多糖中，共检测出7种单糖，阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，其中含量最高的是核糖，最低的是木糖。
本发明与其他文献(枸杞子和传统枸杞叶)相比，首次发现了枸杞叶芽多糖中含有核糖，这在其他植物源多糖中还很少见，并且本发明获得多糖中的核糖在各个组分的多糖中均占较高比例，说明核糖在枸杞叶多糖中也是一种比较重要的成分，与其结构和功能密切相关。因此，本发明为植源性核糖的提取与开发利用提供了一定的理论基础，具有实际应用价值。
下面结合具体的实施案例对本发明进一步详细说明。
实施例1：
1)原料处理：将来自宁夏森淼集团科技股份有限公司银川枸杞基地的宁杞9号枸杞叶芽洗净，然后于鼓风干燥机中60℃烘干6h，用粉碎机将烘干后的枸杞叶芽粉碎并过60目筛。
2)料液比例按照1g：20ml，将枸杞叶芽粉按料液比例，将原料及纯净水置提取罐，机组TS-NS-300，功率为50-60KW；
3)提取温度控制60℃，0.5h打一次循环，以便多糖更好地溶出，提取时间8h；将提取液转移至浓缩罐中，浓缩温度控制70℃，浓缩压力 -0.08MPa～-0.09MPa，浓缩时间5h，浓缩至原液体积的20％；
4)将浓缩液置入醇沉灌中，加入4倍浓缩液体积的浓度为95％食用酒精后过夜醇沉；
5)去上清液后，将醇沉后的物质，放入冷冻干燥机中，-40℃，干燥至恒重，即得枸杞叶芽粗多糖粉末；
6)初步纯化：将得到的粗多糖粉末充分溶于蒸馏水，用NaOH(2mol/L) 溶液调节pH为9，加入0.03％碱性蛋白酶(武汉刚正生物科技有限公司碱性蛋白酶)，40℃酶解4h，溶液先用0.8μm滤膜微滤，然后用0.45μm的滤膜微滤，利用超滤的方法，加入合并液9倍体积的去离子水进行超滤，超滤膜分子截留量为10kDa，收集分子量大于10kDa的溶液，后将此部分体积浓缩为原来的20％，再次根据步骤4)进行醇沉并根据步骤5)进行冷冻干燥后得到纯度较高的枸杞叶芽多糖粉末。
实施例2：
DEAE-Cellulose 52离子交换层析柱纯化。
DEAE-Cellulose 52柱料经预处理后装入层析柱(60cm×2.6cm)中，用去离子水过夜平衡(流速为1mL/min)。
称取实例1枸杞叶芽多糖粉末0.5g，用去离子水溶解后加入到层析柱中，然后依次用去离子水、0.05mol/L的NaCl溶液、0.1mol/L的NaCl溶液、0.2mol/L的NaCl溶液、0.4mol/L的NaCl溶液以1mL/min的流速洗脱，用自动部分收集器分管收集，每管10mL，每种洗脱液收集50管。
从管中吸取0.2mL溶液，加水至1mL，再加入1mL质量浓度为6％苯酚溶液(现用现配)，摇匀后迅速加入3mL浓硫酸(含量95％-98％)，摇匀，室温放置5min，然后置于沸水浴中加热15min，冷水迅速冷却至室温，室温放置20min，在波长490nm处用分光光度计测定吸光度，并以吸光度为纵坐标、管数为横坐标绘制洗脱曲线。
将同一洗脱峰中的溶液合并，超滤除盐，利用超滤的方法，加入合并液9倍体积的去离子水进行超滤，超滤膜分子截留量为10kDa，收集分子量大于10kDa的溶液，后将此部分体积浓缩为原来的20％，根据实例1 步骤(4)进行醇沉，实例1步骤(5)进行冻干，冻干后得到5种多糖，分别命名为LBLP-1、LBLP-2、LBLP-3、LBLP-4、LBLP-5。
实施例3：
Sephadex G-100层析柱纯化。
Sephadex G-100经预处理后装入层析柱(中60cm×2.6cm)，蒸馏水过夜平衡(流速为1mL/min)。
称取实施例2中得到的LBLP-1、LBLP-3、LBLP-4、LBLP-5各0.1mg 溶于蒸馏水后分别加入层析柱中，用蒸馏水以1mL/min的流速洗脱，用自动部分收集器分管收集，每管10mL，每种洗脱液收集50管。
从管中吸取0.2mL溶液，加水至1mL，再加入1mL质量分数为6％苯酚溶液(现用现配)，摇匀后迅速加入3mL浓硫酸(含量95％-98％)，摇匀，室温放置5min，然后置于沸水浴中加热15min，冷水迅速冷却至室温，室温放置20min，在波长490nm处用分光光度计测定吸光度，并以吸光度为纵坐标、管数为横坐标绘制洗脱曲线。
将同一洗脱峰中的溶液合并，根据实例2步骤(4)超滤除盐并浓缩，根据实例1步骤(4)醇沉，离心根据实例1步骤(5)冻干后得到较纯的枸杞叶芽多糖。
实施例4：
枸杞叶芽多糖的单糖组分测定。
称取20mg多糖于鸡心瓶中，加入2mL的2mol/L的三氟乙酸溶液 (TFA)，用漩涡混合器充分溶解后封管，并在立式灭菌锅中120℃水解2 h，用旋转蒸发仪将瓶内的溶液蒸干并去除三氟乙酸。
加入2mL吡啶，漩涡振荡器充分震荡，充分溶解水解后的单糖，加入0.4mL三甲基氯硅烷和0.8mL六甲基二硅胺烷，密封并充分震荡，然后在恒温水浴锅中50℃反应15min。
反应结束后加入1.5mL蒸馏水并充分震荡，静置30min，取吡啶层于离心机中3,000r/min离心15min，进行气相色谱分析。
色谱条件为：Shimadzu GC-2010气相色谱仪，Rtx-5(30m×0.25mm ×0.25um)毛细管柱，氢火焰离子检测器(FID)；上样量为1μL，进样口温度为280℃；色谱柱温度程序为180℃保持20min，以20℃/min的速度上升到280℃，保持10min；氢气和氮气的流速为20mL/min；检测器温度为300℃。粗多糖和个组分多糖的单糖种类及含量比如表1所示。
表1枸杞叶芽多糖的单糖组成
实验1、枸杞叶芽多糖的DPP4抑制活性研究：
本发明将在实施例3中得到的LBLP-1、LBLP-3、LBLP-4、LBLP-5 和实例1得到的粗多糖进行了DPP4抑制率的测定，具体结果如表2所示。
表2枸杞叶多糖DPP4抑制活性对比
本发明公开了一种枸杞叶芽多糖的制备方法及其在治疗糖尿病药物中的应用，本发明采用多功能提取浓缩机组提取制备枸杞叶芽多糖，提取料液比1g：10ml-1g：30ml，提取机组功率40Kw-50Kw，提取时间4h-10h，温度控制,60-90℃，其浓缩温度控制，50-80℃，浓缩负压力—0.05-0.09MPa 的条件，浓缩至原液体积的10-40％。本发明同时还提供了一种枸杞叶芽(宁杞9号)多糖中各组分的结构特征。经DEAE-Cellulose 52分离后的多糖再用Sephadex G-100进行进一步纯化，其洗脱曲线如图2所示。进一步用 GC、GC-MS、HPSEC、NMR等分析宁杞9号叶芽多糖亚结构特征，发现 LBLP-1的重复单元为[→3)-α-D-Ribf-(1→5)-α-L-Arap-(1→3)-α -D-Ribf-(1→]n(即由1,3键连接的α,D呋喃型核糖和1,5键连接的α,L吡喃型阿拉伯糖以2：1的比例连接而成的直链多糖)，其分子量为35.37 kDa。LBLP-3由阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖6种单糖构成，含量比为1.76:1.19:2.32:1.00:1.88:3.18，但LBLP-3并不是分子量均一的多糖。经测定，LBLP-3由3个分子量的单糖构成，其分子量分别为31.55kDa、62.76kDa、97.43kDa。LBLP-5的单糖组成与LBLP-3相同，当含量比为1.81:2.71:2.94:2.90:1.00:1.45，分子量为164.00kDa。而宁杞9号叶芽粗多糖中，共检测出7种单糖，阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，其中含量最高的是核糖，最低的是木糖。
与现有技术相比，本发明采用多功能提取浓缩机组提取制备枸杞叶芽多糖的工艺，在枸杞叶芽提取制备多糖方面尚属空白，其技术具有提取工艺的连续性，并有提取能耗低、有效成分得率高和批量生产的特点，尤其是本发明提取工艺可直接得到枸杞叶芽多糖，工艺步骤连续完成，具有批量规模生产推广应用的价值。
经提取和初步纯化的枸杞叶芽的粗多糖，进一步研究发现其中共有7 种单糖，分别为阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，核糖为含量最多的单糖组分。因此，通过与其他文献(枸杞子和传统枸杞叶)对比，本发明首次从宁杞9号叶芽多糖中发现了核糖，且核糖在各个组分的多糖中均占较高比例，说明核糖在宁杞9号叶芽多糖中也是一种比较重要的成分，与其结构和功能密切相关。因此，本发明为植源性核糖的提取与开发利用提供了一定的理论基础，具有实际应用价值。
最后，还要注意的是，以上的举例仅是本发明很少的几个具体实施例，显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。因此，在此领域能从本发明的公开内容中直接到处或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种枸杞叶芽多糖的制备方法及其在治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取枸杞鲜叶芽烘干；
(2)粉碎至60-80目；
(3)将得到的枸杞叶芽干粉按照料液比例为1g：10ml-1g：30ml，置入提取罐中；
(4)进行提取，控制提取温度50-90℃，提取时间4h-10h；
(5)将提取液移至浓缩罐中，控制浓缩温度50-80℃，浓缩压力-0.05--0.09MPa，浓缩时间6-8h，浓缩至原液体积的10-40％；
(6)将浓缩液置入醇沉灌中，加入4倍浓缩液体积的浓度为95％的食用酒精，过夜醇沉；
(7)去上清液，将醇沉后的物质速冻，然后置于冷冻干燥机干燥至恒重，即得枸杞叶芽粗多糖；
(8)初步纯化，具体是将冻干后得到的枸杞叶芽粗多糖粉末溶于蒸馏水，调节pH为9-10，充分溶解后加入0.03％的碱性蛋白酶，在40-55℃酶解4-5h，得到的溶液经微滤后进行超滤，控制超滤膜分子截留量为10kDa，收集分子量大于10kDa的溶液，将该溶液采用步骤(6)的方法再次用乙醇沉淀并采用步骤(7)的方法冻干后即得枸杞叶芽多糖。
2.如权利要求1所述的枸杞叶芽多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将步骤(8)得到的枸杞叶芽多糖，进行如下处理：
(9)取DEAE-Cellulose 52经预处理后装入60cm×2.6cm层析柱中，用去离子水过夜平衡，控制流速为1mL/min，将枸杞叶多糖粉末0.5g用去离子水溶解后加入到层析柱中，然后依次用去离子水、0.05mol/L的NaCl溶液、0.1mol/L的NaCl溶液、0.2mol/L的NaCl溶液、0.4mol/L的NaCl溶液洗脱2-3个柱体积，控制流速为1mL/min，分管收集，每管10mL，用苯酚硫酸法测定每管中的糖含量，并以吸光度为纵坐标、管数为横坐标绘制洗脱曲线，将同一洗脱峰中的溶液合并，得到合并液体体积，超滤除盐并浓缩，利用超滤的方法，加入合并液9倍体积的去离子水进行超滤，超滤膜分子截留量为10kDa，收集分子量大于10kDa的溶液，然后将此部分体积浓缩为原来的20％，再次根据权利要求1中记载的步骤(6)的方法进行醇沉，根据权利要求1中记载的步骤(7)的方法冻干得到5种多糖，分别命名为LBLP-1、LBLP-2、LBLP-3、LBLP-4、LBLP-5。
3.如权利要求2所述的枸杞叶芽多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将步骤(9)得到的5种多糖，进行如下处理：
(10)取Sephadex G-100经预处理后装入60cm×2.6cm层析柱中，蒸馏水过夜平衡，控制流速为1mL/min，分别取5种多糖0.1g分别充分溶解于蒸馏水后加到层析柱中，以1mL/min的流速洗脱2个柱体积并分管收集，每管收集10mL，并用苯酚硫酸法测定每管的糖含量，以吸光度为纵坐标、管数为横坐标绘制洗脱曲线，将同一洗脱峰中的溶液合并，浓缩至原体积的20％-40％后根据步骤(6)醇沉并根据步骤(7)冻干得到枸杞叶芽多糖。
4.如权利要求1所述的枸杞叶芽多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中烘干具体是指在50-65℃烘干6-10h。
5.如权利要求1所述的枸杞叶芽多糖的制备方法，其特征在于：步骤(7)中具体是速冻至-40℃，然后在冷冻干燥机-40℃干燥24h-48h。
6.如权利要求1所述的枸杞叶芽多糖的制备方法，其特征在于：步骤(8)中微滤具体是指先过0.8μm后过0.45μm滤膜，从而将大分子物质去除防止堵塞超滤膜；步骤(8)中用NaOH溶液调节pH。
7.如权利要求1所述的枸杞叶芽多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中的枸杞采用宁杞9号枸杞。
8.一种用权利要求1至7中任意一种制备方法制备的枸杞叶芽多糖在治疗糖尿病药物中的应用。
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