CN106967772A - 一种利用磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的方法 - Google Patents

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周运涛
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Abstract

本发明公开了一种利用磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的方法，其步骤是：1、制备磁性固定化碱性蛋白酶：将磁性壳聚糖微球加入硼砂缓冲液中，然后加入碱性蛋白酶，在0‑10℃下反应2‑5h，再加入戊二醛，在0‑10℃下反应2‑5h，过滤，洗涤，干燥，得到磁性固定化碱性蛋白酶；2、提取虾壳中的蛋白：2.1、将虾壳粉加入到乙酸溶液中，在55‑75℃下反应1‑5h，过滤，向滤渣中加入碱性溶液至呈中性，过滤，洗涤，干燥，得改性虾壳粉；2.3、测定改性虾壳粉中虾壳蛋白的含量；2.4、将改性虾壳粉加入到硼砂缓冲液中，加入磁性固定化碱性蛋白酶，在45‑60℃下酶解1‑5小时，过滤，将滤液冷冻干燥，得到虾壳蛋白粉。该方法简单易操作，稳定性好，水解蛋白效果好，所需成本低。

Description

一种利用磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的方法
技术领域
本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及一种利用磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的方法。
背景技术
酶是一类具有催化功能的蛋白质，作为一种高效和高度专一的生物催化剂，酶在常温、常压的温和条件下就能催化某一类或某一生化反应，反应后数量和性质不发生变化。但是酶的稳定性差，对高温、有机溶剂或极端pH敏感，使得酶的应用、回收具有一定的困难，限制了酶的利用。
固定化酶是指利用化学或物理手段将游离的酶定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的酶。酶被固定化后在保持其高效专一及温和的酶催化作用，其性质更稳定，且易于和产物分离，还可以反复使用。固定化酶技术在工业、医药、化学分析、环境保护等领域得到了广泛的应用。目前，固定化酶的制备方法有：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法。
利用磁性高分子微球作为酶的固定化载体，不仅方便固定化酶从反应体系中分离和回收，还可以利用外部磁场控制磁性材料固定化酶的运动和方向，从而代替传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。使用磁力微球作为载体具有以下优点：(1)可以保持活性和稳定性；(2)方便回收，提高酶的使用效率；(3)适合大规模连续化生产；(4)提高固定化酶的催化效率。
虾壳中的蛋白质含量约为7％-13％，是一种优质的动物性蛋白质。虾壳蛋白质不仅可以用于食品、饮料，完全水解后制成氨基酸营养液，调料添加剂及饲养添加剂，也可将其用于制作虾黄酱、虾味素等调料或水解制取复合氨基酸。因此，充分利用虾壳中的蛋白具有良好的应用和开发前景。
目前，虾壳中蛋白质的提取主要是利用酸除去虾壳中的钙，然后用碱将虾壳中的蛋白质提取出来，调节提取液pH，使蛋白质沉淀析出，或用盐析法将蛋白质回收。另一种方法是使用蛋白酶将虾壳中的蛋白质水解出来，所得水解液可以进一步调配制成虾油，或者经喷雾干燥制成蛋白粉。用碱法提取蛋白的过程中会带来严重的环境污染，而单纯用酶法来水解蛋白质由于酶的不能回收利用，也存在着严重的浪费。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的方法，该方法简单易操作，稳定性好，水解蛋白效果好，提取所需成本低。
实现本发明上述目的所采取的技术方案为：
一种利用磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的方法，包括如下步骤：
1、制备磁性固定化碱性蛋白酶：
1.1、将磁性壳聚糖微球加入pH＝9-12的硼砂缓冲液中，再加入碱性蛋白酶，磁性壳聚糖微球、碱性蛋白酶和硼砂缓冲液的比例为1mg:100-400U:0.1-1ml，在0-10℃下反应2-5h，得到混合产物；
1.2、向混合产物中加入戊二醛，使戊二醛的终浓度为0.005-0.01g/ml，在0-10℃下反应2-5h，过滤，将滤渣用硼砂缓冲液洗涤，干燥，得到磁性固定化碱性蛋白酶；
2、提取虾壳中的蛋白：
2.1、将虾壳粉加入到浓度为50-90g/L乙酸溶液中，虾壳粉与乙酸溶液的质量体积比为1g:6-14ml，在55-75℃下反应1-5h，得混合液；
2.2、将混合液过滤，向滤渣中加入碱性溶液至体系呈中性，过滤，再用蒸馏水洗涤滤渣，干燥，得改性虾壳粉；
2.3、测定改性虾壳粉中虾壳蛋白的含量；
2.4、将改性虾壳粉加入到pH为9-12的硼砂缓冲液中，接着加入磁性固定化碱性蛋白酶(磁性固定化碱性蛋白酶的活性可以通过Folin-酚法进行测定)，磁性固定化碱性蛋白酶与虾壳蛋白的比例为10-20U:1mg，在温度为45-60℃下搅拌酶解1-5小时，酶解结束后，用吸铁石分离出磁性固定化碱性蛋白酶，将分离出的磁性固定化碱性蛋白酶洗涤后保存备用，再将所得的酶解液过滤，将滤液进行冷冻干燥，得到虾壳蛋白多肽，即为虾壳蛋白粉。
进一步，所述的碱性蛋白酶比活力为20000-32000U/mL。
进一步，所述的碱性溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果和优点在于：
1、本发明的方法提取步骤简单，所需成本较低，虾壳蛋白粉产量高，且酶解过程可连续进行，不需要进行灭酶，可实现大规模连续化生产。
2、采用本发明的方法提取虾壳中的蛋白，提取率高达57％以上。
3、本发明采用磁性固定化碱性蛋白酶，所得的固定化碱性蛋白酶不仅酶活高，且性质稳定，方便储存。
4、本发明制备的固定化碱性蛋白酶具有较强的磁场响应性，因此可以使用外部磁场快速方便地聚集、分离、回收固定化碱性蛋白酶，从而使碱性蛋白酶反复使用，进而提高碱性蛋白酶的使用率。
附图说明
图1为磁性壳聚糖微球的透射电镜扫描图。
图2为磁性壳聚糖微球(下)和固定化碱性蛋白酶(上)的红外光谱图。
图3为虾壳蛋白的提取率与温度的关系曲线。
图4为虾壳蛋白的提取率与提取pH的关系曲线。
图5为虾壳蛋白的提取率与酶底比的关系曲线。
图6为磁性固定化碱性蛋白酶的酶活保留比例与使用次数的关系曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例中所使用的磁性壳聚糖微球为发明人自制(李丹丹，江连洲，李杨.磁性壳聚糖微球固定化碱性蛋白酶的酶学性质)，其制备方法如下：
a、取3-9g壳聚糖溶解于1.5％(v/v)的乙酸溶液中，于600r/min下搅拌30min，得到壳聚糖乙酸溶液；
b、取Fe3O4分散液A(将粒径为10-50nm的Fe3O4纳米颗粒分散于水溶液中)4-6mL于20mL壳聚糖乙酸溶液中，超声分散2小时，得到Fe3O4分散液B；
c、取40-50mL液体石蜡、2-4mL吐温于烧杯中，于600r/min下进行搅拌，得到混合液A；
d、将Fe3O4分散液B逐渐滴加入混合液A中，于40℃、600r/min下搅拌1h，得混合液B；
e、将混合液B加入5wt％的戊二醛中，并继续于40℃、600r/min下搅拌反应20min，得混合产物A；
f、向混合产物A中加入0.1mol/L NaOH溶液，调节pH值至10，在600r/min下进行搅拌反应2h，得混合产物B；
g、用外加磁场从混合产物B中分离出颗粒状物，将颗粒状物用乙醚、丙酮、乙醇和超纯水依次洗涤，重复洗涤几次，最后将颗粒状物冷冻干燥，得到磁性壳聚糖微球。
以下实施例中所使用的碱性蛋白酶均为sigma公司生产的碱性蛋白酶。
实施例1
1、制备磁性固定化碱性蛋白酶：
1.1、将0.1g磁性壳聚糖微球加入25mL pH＝10的硼砂缓冲液中，再加入1mL32000U/mL的碱性蛋白酶，在4℃下反应3h，得到混合产物；
1.2、向混合产物中加入500μL戊二醛(纯度为50％)，在4℃下反应3h，过滤，将滤渣反复用硼砂缓冲液洗涤，冷冻干燥，得到磁性固定化碱性蛋白酶；
2、制备虾壳粉：
去除全部肉质取虾壳，将虾壳用蒸馏水反复清洗，直至没有悬浮的杂质物质，然后置于鼓风干燥箱中，在100℃下烘干24小时，再将干燥好的虾壳用粉碎机进行粉碎，过100目筛，贮存备用；
3、提取虾壳中的蛋白：
3.1、将0.5g虾壳粉加入到5mL 50g/L乙酸溶液中，在65℃下反应3h，得混合液；
3.2、将混合液过滤，向滤渣中加入0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7，过滤，再用蒸馏水洗涤滤渣，干燥，得改性虾壳粉；
3.3、测定改性虾壳粉中虾壳蛋白的含量，测得虾壳蛋白的质量分数为53.98％；
3.4、将0.2g改性虾壳粉加入到10mL pH为10的硼砂缓冲液中，接着按照15U/mg的酶底比加入磁性固定化碱性蛋白酶(事先将磁性固定化碱性蛋白酶在pH为10的硼砂缓冲液中溶胀过夜)，在酶解温度为55℃、转速为100r/min下搅拌酶解3小时，酶解结束后，用吸铁石分离出磁性固定化碱性蛋白酶，将分离出的磁性固定化碱性蛋白酶用缓冲液洗涤后保存于4℃、pH为10的硼砂缓冲液中，再将所得的酶解液过滤，将滤液进行冷冻干燥，得到虾壳蛋白多肽，即为虾壳蛋白粉，虾壳蛋白提取率为57.36％。
本实施例制备的磁性固定化碱性蛋白酶的透射电镜扫描图如图2所示，而磁性壳聚糖微球的透射电镜扫描图如图1所示，磁性壳聚糖微球表面有大量凹凸不平的孔径，这样可以有效的增加微球的比表面积，有利于碱性蛋白酶的交联，表明该微球是酶的良好的载体，
本实施例制备的磁性固定化碱性蛋白酶和磁性壳聚糖微球的红外光谱图如图3所示，由图2可知，在磁性固定化碱性蛋白酶和磁性壳聚糖微球的红外光谱图中，545cm-1处的特征吸收峰是Fe3O4的特征峰；1545cm-1处是CN伸缩振动的特征吸收峰，表明交联反应发生；636cm-1处是戊二醛的特征吸收峰；3409cm-1处是-NH2和-OH伸缩振动的特征吸收峰。由此表明，磁性固定化碱性蛋白酶与磁性壳聚糖微球一样，保持了壳聚糖和Fe3O4原有的特征吸收峰，表明磁性固定化碱性蛋白酶具备磁性和交联酶的功能。
实施例2
1、制备磁性固定化碱性蛋白酶：
1.1、将0.2g磁性壳聚糖微球加入25mL pH＝10的硼砂缓冲液中，再加入1mL20000U/mL的碱性蛋白酶，在4℃下反应3h，得到混合产物；
1.2、向混合产物中加入250μL戊二醛(纯度为50％)，在4℃下反应3h，过滤，将滤渣反复用硼砂缓冲液洗涤，冷冻干燥，得到磁性固定化碱性蛋白酶；
2、制备虾壳粉：
去除全部肉质取虾壳，将虾壳用蒸馏水反复清洗，直至没有悬浮的杂质物质，然后置于鼓风干燥箱中，在100℃下烘干24小时，再将干燥好的虾壳用粉碎机进行粉碎，过100目筛，贮存备用；
3、提取虾壳中的蛋白：
3.1、将0.5g虾壳粉加入到5mL 75g/L乙酸溶液中，在65℃下反应3h，得混合液；
3.2、将混合液过滤，向滤渣中加入0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7，过滤，再用蒸馏水洗涤滤渣，干燥，得改性虾壳粉；
3.3、测定改性虾壳粉中虾壳蛋白的含量，虾壳蛋白的质量分数为58.32％。
3.4、将0.1g改性虾壳粉加入到10mL pH为10的缓冲液中，接着按照15U/mg的酶底比加入磁性固定化碱性蛋白酶(事先将碱性蛋白酶在pH为10的硼砂缓冲液中溶胀过夜)，在酶解温度为55℃、转速为100r/min下搅拌酶解3小时，酶解结束后，用吸铁石分离出磁性固定化碱性蛋白酶，将分离出的磁性固定化碱性蛋白酶用缓冲液洗涤后保存于4℃、pH为10的硼砂缓冲液，再将所得的酶解液过滤，将滤液进行冷冻干燥，得到虾壳蛋白多肽，即为虾壳蛋白粉，虾壳蛋白提取率为53.14％。
实施例3
1、制备磁性固定化碱性蛋白酶：
1.1、将0.2g磁性壳聚糖微球加入25mLpH＝10的硼砂缓冲液中，再加入2mL32000U/mL的碱性蛋白酶，在10℃下反应4h，得到混合产物；
1.2、向混合产物中加入350μL戊二醛(纯度为50％)，在4℃下反应3h，过滤，将滤渣反复用硼砂缓冲液洗涤，冷冻干燥，得到磁性固定化碱性蛋白酶；
2、制备虾壳粉：
去除全部肉质取虾壳，将虾壳用蒸馏水反复清洗，直至没有悬浮的杂质物质，然后置于鼓风干燥箱中，在100℃下烘干24小时，再将干燥好的虾壳用粉碎机进行粉碎，过100目筛，贮存备用；
3、提取虾壳中的蛋白：
3.1、将0.5g虾壳粉加入到5mL 90g/L乙酸溶液中，在65℃下反应3h，得混合液；
3.2、将混合液过滤，向滤渣中加入0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7，过滤，再用蒸馏水洗涤滤渣，干燥，得改性虾壳粉；
3.3、测定改性虾壳粉中虾壳蛋白的含量，虾壳蛋白的质量分数为55.21％。
3.4、将0.15g改性虾壳粉加入到10mL pH为10的缓冲液中，接着加入按照10U/mg的酶底比加入磁性固定化碱性蛋白酶(事先将碱性蛋白酶在pH为10的硼砂缓冲液中溶胀过夜)，在酶解温度为55℃、转速为100r/min下搅拌酶解3小时，酶解结束后，用吸铁石分离出磁性固定化碱性蛋白酶，将分离出的磁性固定化碱性蛋白酶用缓冲液洗涤后保存于4℃、pH为10的硼砂缓冲液，再将所得的酶解液过滤，将滤液进行冷冻干燥，得到虾壳蛋白多肽，即为虾壳蛋白粉，虾壳蛋白提取率为54.66％。
实验一、温度对磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的影响
试验方法：以酶底比(磁性固定化碱性蛋白酶活与虾壳蛋白质量的比值)为15u/mg，在PH为10的硼砂缓冲液中酶解，酶解时间为3h，酶解温度分别为45℃，50℃，55℃，60℃，酶解结束后，测定不同温度条件下虾壳蛋白的提取率。
实验结果：
所得虾壳蛋白的提取率与温度的关系如图3所示，从图3可以看出，虾壳蛋白较佳的酶解温度为45-60℃，虾壳蛋白最佳的酶解温度为55℃。
实验二、pH对磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的影响
试验方法：以酶底比(磁性固定化碱性蛋白酶活与虾壳蛋白质量的比值)为15u/mg，分别在pH为9.5、10、10.5的缓冲液中酶解，酶解时间为3h，酶解温度为55℃，酶解结束后，测定不同pH条件下虾壳蛋白的提取率。
实验结果：
所得虾壳蛋白的提取率与提取pH值的关系如图4所示，从图4可以看出，虾壳蛋白较佳的提取pH值为9.5-10.5℃，虾壳蛋白最佳的酶解提取pH值为10。
实验三、酶底比(磁性固定化碱性蛋白酶活与虾壳蛋白质量的比值)对磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的影响
试验方法：分别以酶底比为10u/mg、15u/mg、20u/mg，在pH为10的缓冲液中酶解，酶解时间为3h，酶解温度为55℃，酶解结束后，测定不同酶底比条件下虾壳蛋白的提取率。
实验结果：
所得虾壳蛋白的提取率与酶底比的关系如图5所示，从图5可以看出，虾壳蛋白较佳的酶底比为10-20U/mg，虾壳蛋白最佳的酶底比值为15U/mg。
实验四、磁性固定化碱性蛋白酶重复使用实验
试验方法：(参照SB/T 10317-1999蛋白酶活力测定法)
在pH为10、酶解温度为40℃下，用磁性固定化碱性蛋白酶酶解1wt％的酪蛋白溶液(称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入4ml 0.2mol/LNaOH，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内)，酶解时间为15min，重复使用磁性固定化碱性蛋白酶5次在上述条件下酶解酪蛋白，测定每次酶解结束后磁性固定化碱性蛋白酶的酶活。
实验结果：
所得酶活保留比例与使用次数的关系如图6所示，从图6可以看出，磁性固定化碱性蛋白酶重复使用5次后，仍然可保留69.64％的酶活力。

Claims (3)

1.一种利用磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：
1.1、制备磁性固定化碱性蛋白酶：
1.1.1、将磁性壳聚糖微球加入pH＝9-12的硼砂缓冲液中，再加入碱性蛋白酶，磁性壳聚糖微球、碱性蛋白酶和硼砂缓冲液的比例为1mg:100-400U:0.1-1ml，在0-10℃下反应2-5h，得到混合产物；
1.1.2、向混合产物中加入戊二醛，使戊二醛的终浓度为0.005-0.01g/ml，在0-10℃下反应2-5h，过滤，将滤渣用硼砂缓冲液洗涤，干燥，得到磁性固定化碱性蛋白酶；
1.2、提取虾壳中的蛋白：
1.2.1、将虾壳粉加入到浓度为50-90g/L乙酸溶液中，虾壳粉与乙酸溶液的质量体积比为1g:6-14ml，在55-75℃下反应1-5h，得混合液；
1.2.2、将混合液过滤，向滤渣中加入碱性溶液至体系呈中性，过滤，再用蒸馏水洗涤滤渣，干燥，得改性虾壳粉；
1.2.3、测定改性虾壳粉中虾壳蛋白的含量；
1.2.4、将改性虾壳粉加入到pH为9-12的硼砂缓冲液中，接着加入磁性固定化碱性蛋白酶，磁性固定化碱性蛋白酶与虾壳蛋白的比例为10-20U:1mg，在温度为45-60℃下搅拌酶解1-5小时，酶解结束后，用吸铁石分离出磁性固定化碱性蛋白酶，将分离出的磁性固定化碱性蛋白酶洗涤后保存备用，再将所得的酶解液过滤，将滤液冷冻干燥，得到虾壳蛋白多肽，即为虾壳蛋白粉。
2.根据权利要求1所述的利用固定磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的方法，其特征在于：所述的碱性蛋白酶比活力为20000-32000U/mL。
3.根据权利要求1所述的利用固定磁性固定化碱性蛋白酶提取虾壳蛋白的方法，其特征在于：所述的碱性溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
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