CN106950378A

CN106950378A - 一种诊断去势抵抗性前列腺癌试剂盒

Info

Publication number: CN106950378A
Application number: CN201610013095.XA
Authority: CN
Inventors: 牛远杰; 蒋宁; 王准; 尚芝群; 赵阳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-01-07
Filing date: 2016-01-07
Publication date: 2017-07-14

Abstract

本发明公开了一种诊断去势抵抗性前列腺癌试剂盒，该试剂盒包括：YAP抗体、二甲苯、乙醇、3％H₂O₂溶液、1％BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、0.01M的pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液和0.01M PBS。本发明的试剂盒能特异性的对去势抵抗性前列腺癌进行诊断，灵敏度高，特异性强，成本低。基于YAP蛋白的表达量与去势抵抗性前列腺癌的相关性，以该蛋白作为分子标记对其表达量进行检测可以诊断前列腺癌中较难区分的AR低表达的去势抵抗性前列腺癌。

Description

一种诊断去势抵抗性前列腺癌试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种诊断去势抵抗性前列腺癌试剂盒。

背景技术

雄激素受体(AR)属于调节类固醇激素作用的核转录因子家族。其能与配体形成复合体，绑定到基因组中的一个招募基本的转录装置和共调节剂的平台---雄激素反应元件(AREs)。其中的共调节蛋白能够起到AR的激活剂或抑制剂的作用，它们的失调会导致前列腺癌的进展。已有一些研究已经报道过AR能够抑制一些基因，且间接的说明了一些涉及抑制辅助因子蛋白的机制，而直接机制是通过绑定到他们的调节元件区包括ARE基序一致的部分，通过多硫蛋白EZH2调节的。但是AR是怎样抑制基因的表达还不是十分清楚。

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一，其仍然是男性的第二死亡原因。AR信号通路在前列腺癌的起源和进展中起重要作用。因此雄激素剥夺治疗，例如阿比特龙和恩杂鲁胺，是进展性前列腺癌(ADPC)的主要治疗方式。然而，这些治疗虽然开始时起到使疾病退化的作用，但通常，进展性前列腺最终会发展成去势抵抗性前列腺癌(CRPC)，这就需要一种新的方法去阻遏AR信号通路，阻止CRPC的进展。

YAP(Yes－associated protein)一种细胞内连接蛋白，是Hippo信号通路中的核心元素，参与细胞内信号转导并对其下游靶因子的转录共激活的过程，调控细胞增生和凋亡间的平衡，从而保证组织器官的正常大小及机体内环境的稳态。在正常细胞中YAP因被磷酸化，从而滞留胞质内，导致增殖抑制、从而促进凋亡，产生接触性抑制。近年来，已有文献报道，在人类肿瘤中YAP蛋白表达增高且出现在细胞核中YAP增多，如前列腺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、恶性胶质瘤等。说明了YAP在肿瘤中起重要作用。此外，已有一些研究提示YAP在调节肿瘤干细胞方面有重要作用，当然，YAP在肿瘤中的具体作用还有待进一步研究发现。此外，YAP在控制生长以及调节干细胞和祖细胞有关。在上皮中，YAP调节对干细胞和祖细胞的行为具有不同的影响。在小鼠肝脏中，YAP的表达导致祖细胞标记基因(CK19,SOX9和A6)表达，且YAP激活导致去分化单个成体干细胞。出人意料的是YAP过表达导致小肠丢失干细胞而不是获得干细胞。然而，YAP在干细胞中的精确功能还并不十分清楚。

关于YAP与去势抵抗型前列腺癌的关系及其机制的研究还鲜有报道。前列腺癌病人经过药物去势治疗后，平均18个月进展为去势抵抗型前列腺癌，对任何内分泌治疗不敏感，使患者失去治疗的机会。去势抵抗性前列腺癌发病机制尚不十分清楚，一般可分为神经内分泌、干细胞，雄激素受体阳性等亚型。目前，尚没有明确的诊断指标预测和诊断去势抵抗性前列腺癌干细胞亚型。本发明通过临床数据和基础生物实验数据来研究YAP与去势抵抗型前列腺癌之间的关系，本发明的成果可以为临床诊断去势抵抗型前列腺癌提供新的方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种诊断去势抵抗性前列腺癌试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

一种诊断去势抵抗性前列腺癌试剂盒，包括：YAP抗体、二甲苯、乙醇、3％H₂O₂溶液、1％BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、0.01M的pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液和0.01M PBS。

本发明的优点：

本发明的试剂盒能特异性的对去势抵抗性前列腺癌进行诊断，灵敏度高，特异性强，成本低。基于YAP蛋白的表达量与去势抵抗性前列腺癌的相关性，以该蛋白作为分子标记对其表达量进行检测可以诊断前列腺癌中较难区分的AR低表达的去势抵抗性前列腺癌。

附图说明

图1敲减YAP蛋白能够有效抑制前列腺癌C4-2细胞的侵袭生长。

图2敲减YAP蛋白能够抑制前列腺癌干细胞球的生长.

图3前列腺癌病例评分+，无转移生长。

图4前列腺癌病例，结合临床PSA及病理诊断为去势抵抗性前列腺癌，评分+++.有骨转移，前列腺包膜外浸润生长，去势治疗8个月后死亡。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

所述YAP抗体为商品化抗体，制备方法参见文献：

Yokoyama WM,et al.2001.Production of Monoclonal Antibodies.Current Protocolsin Immunology.74:2.5.1-2.5.25.)相应的，利用特异性抗YAP蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体。

实施例1

实施例2

2×10⁴敲减YAP蛋白的C4-2去势抵抗性前列腺癌细胞和对照细胞(正常C4-2细胞)分别接种于聚碳酸酯膜小室(Corning公司产品)的上层，培养24小时后用结晶紫将穿过聚碳酸酯膜的细胞染色后，在显微镜下观察并照相，分别记数每个视野穿过聚碳酸酯膜的癌细胞，求平均值并计算标准差。结果显示，与对照细胞相比较，敲减YAP蛋白的去势抵抗性前列腺癌细胞体外迁移能力显著减少(图1)，提示YAP可能增加去势抵抗性前列腺癌细胞转移。

实施例3

2×10⁴过表达YAP的C4-2去势抵抗性前列腺癌细胞和对照细胞(正常C4-2细胞)分别接种混有1640血清培养液的matrigel中，培养一周后用结晶紫将胶的细胞染色后，在显微镜下观察并照相，分别记数每个视野形成球的癌细胞，求平均值并计算标准差。结果显示，与对照细胞相比较，YAP高表达的去势抵抗性前列腺癌细胞体外转移生长能力显著增高(图2)，提示YAP可能增加去势抵抗性前列腺癌细胞转移。

实施例4

随机选取15例前列腺癌患者术后去势抵抗性前列腺癌组织的石蜡切片使用实施例1的诊断去势抵抗性前列腺癌试剂盒验证对去势抵抗性前列腺癌的诊断：包括如下步骤：

(1)将去势抵抗性前列腺癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜；

(2)切片脱腊脱水；步骤为：将烤箱过夜石蜡切片于：

二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→二甲苯Ⅲ10min→100％乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min→双蒸水5min(Ⅰ代表第一个容器，II代表第二个容器)

(3)3％H₂O₂溶液，室温浸泡20min；

(4)双蒸水洗5min×3；

(5)抗原修复：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸30min；

(6)自然冷却至室温，双蒸水洗5min×3；

(7)37℃，1％BSA封闭液封闭30min；

(8)甩去所述封闭液，加一抗(YAP1抗体，稀释比例1：200)置入湿盒中4℃冰箱放置16小时；

(9)室温复温15min，然后0.01M PBS洗5min×4；

(10)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，购自中国中山金桥公司，即用型，无需稀释)45min，37℃；

(11)0.01M PBS洗5min×4，DAB显色试剂显色2-10min，镜下观察；

(12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；

(13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；

(14)取出，盖玻片覆盖；

(15)显微镜下观察阳性染色，分别于癌组织和癌旁组织各随机选取3个视野，拍照；

(16)YAP1阳性表达为细胞胞膜和(或)胞浆上呈现棕黄色颗粒；采用半定量结果判断，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。①阳性着色细胞数：每张切片上观察5个高倍视野(×200)，计数阳性细胞百分比，阳性细胞数<5％为0分，5％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，76％～100％为4分。②阳性着色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。③两者计分相乘即为阳性等级：0分为阴性(-)，1-4分为弱阳性(+)，5-8分为阳性(++)，9-12分为强阳性(+++)。

YAP高低表达标准以评分高于++为YAP蛋白高表达，低于+为YAP蛋白低表达。

结果：随机选取15例前列腺癌标本YAP免疫组化试剂盒染色，病例1免疫组化评分为+++；病例2为+；病例3为+；病例3为++；病例4为+++；病例5为+；病例6为+；病例7为+；病例8为++；病例9为+++；病例10为+；病例11为+++；病例12为+；病例13为+；病例14为+；病例15为+，病例中位数为+。病例1，3,4,8,9,11与病理医师诊断一致，均为去势抵抗型前列腺癌。

实施例5

样本：某前列腺癌患者肿瘤的组织切片，采用本发明的实施例1的试剂盒，采用实施例4的检测方法，检测YAP蛋白在癌组织中的表达量。癌组织的显微图片如图3所示。经计算，该组织的评分+，低表达。结合临床PSA和病理分级诊断为前列腺癌I期，未发生精囊及包膜外浸润和远处骨转移。

实施例6

样本：某前列腺癌患者肿瘤的组织切片，采用本发明的实施例1的试剂盒，采用实施例4的检测方法，检测YAP蛋白在癌组织中的表达量，癌组织的显微图片如图4所示。经计算，该组织的评分++，诊断为去势抵抗性前列腺癌(结合临床PSA，并为病理医师确认)。

由以上试验结果可知，采用本发明的试剂盒能帮助诊断去势抵抗性前列腺癌。当免疫组化评分高于+时，去势抵抗性前列腺癌可能性高。显然，YAP蛋白与去势抵抗性前列腺癌的转移潜能具有相关性，因此，以YAP蛋白作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能帮助诊断去势抵抗性前列腺癌。相应的，特异性抗YAP蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，能用于制备诊断去势抵抗性前列腺癌试剂盒。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.一种诊断去势抵抗性前列腺癌试剂盒，其特征是包括：YAP抗体、二甲苯、乙醇、3％H₂O₂溶液、1％BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、0.01M的pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液和0.01M PBS。