CN106947753A - 一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶d固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，该方法按照以下步骤进行：步骤一，将印迹底物加入到磷脂酶D溶液中进行配合，得到酶‑底物配合物溶液(印迹酶)；步骤二，加入沉淀剂沉淀酶‑底物配合物，得到含有酶‑底物配合物聚集体混合溶液；步骤三，向沉淀后的混合溶液中加入水溶性交联剂进行交联反应，得到交联酶‑底物配合物聚集体；步骤四，对交联酶‑底物配合物聚集体进行洗涤，除去底物后得到交联印迹磷脂酶D聚集体。本发明的方法在磷脂酶D分子与底物分子印迹作用结束后，采用沉淀法“僵化”酶分子的这种“超活化”结构，再加入适当的水溶性交联剂对酶分子进行交联作用，实现了“超活化”结构酶分子的分子间交联和分子内交联，形成交联印迹磷脂酶D聚集体。

Description

一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法

技术领域

本发明属于磷脂类物质合成领域，涉及磷脂酶D，具体涉及一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法。

背景技术

近年来，随着人们对磷脂类物质的深入研究，更加明确地认识了磷脂的药用价值和营养价值，并将它广泛的应用到食品、药物及保健品等领域。以磷脂酰甘油(PG)为例，其可降低肺表面张力,稳定肺泡的功能，在肺部疾病的确诊和治疗方面有着广泛的应用。同时，PG由于其独特的结构和理化性质，还是人工合成胡萝卜素类脂的重要中间产物。

然而自然界获取的天然PG结构成分复杂，不能满足生产要求和市场需要。因此，需要采取相应手段对天然磷脂进行改性处理，以制备出高纯度，单一组分的磷脂产品。利用磷脂酶D(PLD),在丙三醇存在的条件下，催化自然界含量较高的磷脂(通常是磷脂酰胆碱，PC)发生磷脂酰基转移反应，可以合成高纯度磷脂酰甘油，是目前公认的制备高纯度稀有磷脂最有效的途径。该方法具有操作简单、反应条件温和、催化效率高以及产物收率高的显著优势。而游离磷脂酶D稳定性差、难回收、昂贵的价格却是制约PG大规模工业化生产的主要原因。通过固定化酶技术可以有效提高磷脂酶D的稳定性，实现磷脂酶D的回收再利用，降低生产成本，是实现PG大规模工业化生产先决条件。

对现有磷脂酶D的固定化技术而言，即便是利用单位体积活力收率最高的交联酶聚集体(CLEAs)技术，固定化后的磷脂酶D催化合成磷脂酰甘油的比活力(U/g)相比游离酶也会降低。考虑到磷脂酶D昂贵的价格，现有的固定化技术无疑会增加PG的生产成本。因此，有必要对磷脂酶D的固定化工艺做详细的研究，探索一种在保证酶稳定性的同时，能够提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，为磷脂生产和应用，以及固定化酶工程的发展提供参考价值。

发明内容

针对现有磷脂酶D固定化技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，本发明采用如下技术方案予以实现：

一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，该方法按照以下步骤进行：

步骤一，将印迹底物加入到磷脂酶D溶液中进行配合，得到酶-底物配合溶液；

步骤二，加入沉淀剂沉淀酶-底物配合物，得到含有酶-底物配合物聚集体混合溶液；

步骤三，向沉淀后的混合溶液中加入水溶性交联剂进行交联反应，得到交联酶-底物配合物聚集体；

步骤四，对交联酶-底物配合物聚集体进行洗涤，除去底物后得到交联印迹磷脂酶D聚集体。

本发明还具有如下区别技术特征：

该方法具体按照以下步骤进行：

步骤一，磷脂酶D的印迹：

将印迹底物加入到磷脂酶D溶液中，搅拌30～120min，得到酶-底物配合物，其中：

所述的印迹底物为丙三醇或磷脂酰胆碱，优选为丙三醇；

所述的磷脂酶D溶液为磷脂酶D的醋酸缓冲液；

所述的1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液中对应加入0.01～0.1g丙三醇；或者所述的1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液中对应加入0.1mL含有磷脂酰胆碱浓度为0.1～1mg/mL的乙醚溶液；

步骤二，磷脂酶D-底物配合物的沉淀：

向步骤一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加无水沉淀剂并搅拌，滴加完毕后，继续在搅拌下沉淀10～30min，得到含有磷脂酶D-底物配合物聚集体混合溶液，其中：

所述的1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液中对应加入8～10mL无水沉淀剂；

步骤三，磷脂酶D-底物配合物聚集体的交联：

向步骤二中得到的混合溶液中加入水溶性交联剂进行交联反应60～120min，反应结束后离心收集产物，得到交联酶-底物配合物聚集体，其中：

水溶性交联剂的质量浓度控制在0.5％～2.5％之间；

步骤四，磷脂酶D配体底物的洗涤脱除：

将步骤三中得到的交联酶-底物配合物聚集体用纯化溶剂洗去酶分子的配合底物，再用去离子水洗去未交联的酶分子，冷冻干燥，得到交联印迹磷脂酶D聚集体。

优选的，所述的步骤一、步骤二和步骤三均在冰浴条件下进行，冰浴即通过冰块使得反应体系的温度控制在0℃以下。

优选的，步骤一中，所述的醋酸缓冲液的浓度为0.2M，pH值为5.0～6.0。

优选的，步骤二中，所述的无水沉淀剂降温至0℃以下后再加入酶-底物配合物溶液中。

优选的，步骤二中，所述的无水沉淀剂为无水甲醇、无水乙醇、无水丙醇无水异丙醇或无水丙酮，优选为无水乙醇。

优选的，步骤三中，所述的水溶性交联剂为戊二醛。

优选的，步骤四中，若印迹底物为丙三醇，则对应的纯化溶剂为去离子水；若印迹底物为磷脂酰胆碱，则对应的纯化溶剂为无水乙醇。

优选的，步骤四中，所述的交联印迹磷脂酶D聚集体置于4℃下保存。

本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：

(Ⅰ)本发明的方法通过交联印迹酶聚集体技术，可以实现印迹磷脂酶D在水溶液中持续保持印迹特征，克服了现有印迹技术只能在有机溶剂中使用的缺陷。

(Ⅱ)本发明的方法制得的交联印迹磷脂酶D聚集体的酶活力得到了很大的提升，相比于传统交联无印迹酶聚集体技术制备的固定化磷脂酶D(CLEAs)和游离磷脂酶D，其磷脂酰甘油合成反应活力分别提高了约3.4和2.8倍。

(Ⅲ)本发明的方法制得的交联印迹磷脂酶D聚集体稳定性好，回收后可以重复利用，重复利用8次后，其磷脂酰甘油合成反应活力(140U/g)仍然高于传统交联无印迹酶聚集体技术制备的固定化磷脂酶D(CLEAs)首次使用时的酶活力(110U/g)，甚至与游离磷脂酶D首次使用时的酶活力几乎一样(137U/g)。

(Ⅳ)本发明的方法在磷脂酶D分子与底物分子配合作用形成利于催化的状态后(印迹酶)，采用沉淀法“僵化”酶分子的这种“超活化”结构，再加入适当的水溶性交联剂对酶分子进行交联作用，实现了“超活化”结构酶分子的分子间交联和分子内交联，形成交联印迹磷脂酶D聚集体。从而可以简便、低成本、大规模地制备具有高磷脂酰甘油合成反应活力的固定化磷脂酶D。所制备的交联印迹磷脂酶D聚集体具有催化活力高、性能稳定、可重复利用、不污染产品等优点。

附图说明

图1是不同沉淀剂对交联印迹磷脂酶D聚集体固定化酶活力的影响图。

图2是戊二醛浓度对所制备交联丙三醇印迹磷脂酶D聚集体固定化酶活力的影响图。

图3是戊二醛浓度对所制备交联磷脂酰胆碱印迹磷脂酶D聚集体固定化酶活力的影响图。

图4是交联丙三醇印迹磷脂酶D聚集体固定化酶的重复再利用的活性图。

以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。

具体实施方式

在广义范围上，固定化酶是将酶分子束缚/限制在某一载体或某一区域内以减少酶的流失。此技术在有效改善酶分子稳定性的同时，会导致酶三维结构发生变化。通常这种变化是不利的，从而引起酶活力的下降，降低了酶催化的高效性。因此，探索一种能够制备具有较高酶活的固定化方法一直是固定化技术的研究热点。

在固定化酶领域，交联酶聚集体(CLEAs)是应用最为广泛的制备具有较高单位体积催化活力固定化酶的方法。理论上通过交联酶聚技术可以最大程度降低酶三维结构的变化尽可能保留酶原有结构，实现酶活力的最大化。微观上，交联剂在酶分子之间发生作用的同时会发生分子内交联，“僵化”酶的三维结构。这种“僵化作用”在稳定酶三维结构的同时会降低酶分子结构的柔韧性，限制了酶分子在催化过程中分子结构合理的变构，致使其并不能获得理想的催化性能。

利用印迹技术，即通过底物的配合作用诱导酶分子构象定向排布，预先形成有利于催化的“超活化”状态(印迹酶)，再利用交联酶聚集体技术，通过分子间和分子内的交联作用，“记忆”酶分子的这种“超活化”结构，使酶分子始终保持在利于催化的结构状态下，提高交联酶聚集体固定化酶的催化性能的同时，克服了酶印迹技术无法在水相中使用的缺点，操作简便、成本低，是具有应用前景的新颖固定化酶技术。

本发明的原理：依据酶分子印迹理论，当酶分子与底物结合时，通过底物的配合作用诱导酶分子构象定向排布，使其形成利于催化的“超活化”状态，增加了酶于底物之间的亲和力，表现出更高的催化活性。再利用交联酶聚集体技术，“记忆”酶分子的这种“超活化”状态，从而制备无载体的高磷脂酰甘油合成反应活力固定化磷脂酶D。本发明中利用短链交联剂戊二醛进行酶分子间和分子内交联，其自身韧性小，能为酶分子提供更高的刚性，能更有效的“记忆”酶分子的这种“超活化”结构，使酶分子始终保持在利于催化的结构状态下，有效抑制了酶分子印迹效果在水相中的衰退。

遵从上述技术方案，以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

实施例1：

本实施例给出一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，该方法按照以下步骤进行：

步骤一，磷脂酶D的印迹：

将0.05g丙三醇加入1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液(浓度为0.2M，pH值为5.5)，冰浴温和搅拌下，印迹60min，得到含有酶-底物配合物(印迹酶)溶液。

步骤二，磷脂酶D-底物配合物的沉淀：

向步骤一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加8mL过冷(0℃以下)无水沉淀剂(分别使用了甲醇、乙醇、丙酮、丙醇和异丙醇作为沉淀剂)，滴加完毕后，继续在冰浴下温和搅拌下沉淀10min，得到含有磷脂酶D-底物配合物聚集体混合溶液。

步骤三，磷脂酶D-底物配合物聚集体的交联：

冰浴条件下，向步骤二中得到的混合溶液中加入水溶性交联剂质量浓度为25％的戊二醛，调节反应液中戊二醛质量浓度为1.5％，交联120min，反应结束后离心收集产物，得到交联酶-底物配合物聚集体。

步骤四，磷脂酶D配体底物的洗涤脱除：

将步骤三中得到的交联酶-底物配合物聚集体用去离子水冲洗，洗去酶分子的配合底物和未交联的酶分子，用去离子水冲洗至少3次，冷冻干燥，得到交联印迹磷脂酶D聚集体，将制得交联印迹酶聚集体置于4℃保存备用。

对比例1：

本对比例给出一种磷脂酶D固定化方法，该方法的与实施例1的区别仅仅在于没有实施例1的步骤一，即在其制备过程中不用添加印迹底物丙三醇，其余步骤与交联印迹磷脂酶D聚集体的制备一样，最终制得交联无印迹磷脂酶D聚集体。

本对比例制得的交联无印迹磷脂酶D聚集体作为对照组。

固定化酶活力的测定：

通过利用磷脂酰基转移反应制备磷脂酰甘油测定制备固定化磷脂酶D的活力，具体操作步骤如下：称取20μg制备的固定化磷脂酶D(交联印迹固定化酶或交联无印迹固定化酶)超声分散于0.5mL醋酸钠缓冲液中(0.2M，pH 5.5)，再加入0.05g丙三醇，将上述混合溶液与0.5mL磷脂酰胆碱浓度为1mg/mL的乙醚溶液混合。在400rpm，30℃下反应。每隔15min检测溶液中磷脂酰甘油的生成速率。固定化磷脂酶D酶的活力单位被定义为1min内转化1μmol底物所需的酶量为一个活力单位(U)。

如图1所示，不同沉淀剂的选择对固定化酶的制备具有较大影响。就磷脂酶D而言，本发明确定乙醇作为最优沉淀剂。利用乙醇作沉淀剂制备的交联印迹酶聚集体固定化磷脂酶D比活力可达到390U/g，甚至远高于游离磷脂酶D的活力(137U/g)。另外，如图所示，无论使用哪种沉淀剂，利用交联印迹酶聚集体制备的固定化酶其酶活力都比交联无印迹酶聚集体制备的固定化酶和游离磷脂酶D的活力高。这是因为，利用印迹技术，即通过酶与底物分子或抑制剂的预作用，使酶分子的三维结构发生定向变构，形成利于催化的“超活化”状态，再利用交联酶聚集体技术，通过分子间和分子内的交联作用，“僵化”酶分子的这种“超活化”结构，使酶分子始终保持在利于催化的结构状态下，大大提高交联酶聚集体固定化酶的催化性能。

实施例2：

本实施例给出一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，该方法按照以下步骤进行：

步骤一，磷脂酶D的印迹：

与实施例1的步骤一相同。

步骤二，磷脂酶D-底物配合物的沉淀：

向步骤一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加8mL过冷(0℃以下)无水沉淀剂无水乙醇，滴加完毕后，继续在冰浴下温和搅拌下沉淀10min，得到含有磷脂酶D-底物配合物聚集体混合溶液。

步骤三，磷脂酶D-底物配合物聚集体的交联：

冰浴条件下，向步骤二中得到的混合溶液中加入水溶性交联剂质量浓度为25％的戊二醛，调节反应液中戊二醛质量浓度分别为0.5％，0.8％，1.0％，1.2％，1.5％，1.8％，2％，2.3％，2.5％，交联120min，反应结束后离心收集产物，得到交联酶-底物配合物聚集体。

步骤四，磷脂酶D配体底物的洗涤脱除：

与实施例1的步骤四相同，得到交联印迹磷脂酶D聚集体，将制得交联印迹酶聚集体置于4℃保存备用。

对比例2：

本对比例给出一种磷脂酶D固定化方法，该方法的与实施例2的区别仅仅在于没有实施例2的步骤一，即在其制备过程中不用添加印迹底物丙三醇。其余步骤与交联印迹磷脂酶D聚集体的制备一样，最终制得交联无印迹磷脂酶D聚集体。

本对比例制得的交联无印迹磷脂酶D聚集体作为对照组。

固定化酶活力的测定：

通过利用磷脂酰基转移反应制备磷脂酰甘油测定制备固定化磷脂酶D的活力，具体操作步骤如下：称取20μg制备的固定化磷脂酶D(交联印迹固定化酶或交联无印迹固定化酶)超声分散于0.5mL醋酸钠缓冲液中(0.2M，pH 5.5)，再加入0.05g丙三醇，将上述混合溶液与0.5mL磷脂酰胆碱浓度为1mg/mL的乙醚溶液混合。在400rpm，30℃下反应。每隔15min检测溶液中磷脂酰甘油的生成速率。固定化磷脂酶D酶的活力单位被定义为1min内转化1μmol底物所需的酶量为一个活力单位(U)。

图2是戊二醛浓度对所制备交联丙三醇印迹磷脂酶D聚集体固定化酶活力的影响图，其中虚线代表游离磷脂酶D的活力。如图所示，随着戊二醛浓度的增大，固定化酶活力呈现先增大后减小的趋势。在戊二醛浓度较低时，酶分子间和分子内的交联作用不显著，不能更好的“僵化”酶分子的这种“超活化”结构，无法始终将酶分子保持在利于催化的结构状态下。此时酶分子与水相接触后，其三维结构会向酶分子的自然状态变构，印迹效果下降，宏观表现为交联印迹固定化酶活力下降。而当戊二醛浓度过高，戊二醛分子在一端连接蛋白质分子的氨基时更易在另一端发生聚合作用，形成的聚合物会影响酶分子的三维结构导致酶活力的下降。另外，本发明发现在制备交联印迹固定化磷脂酶D与交联无印迹固定化磷脂酶D有着不同的最优戊二醛用量。交联印迹固定化磷脂酶D其最优戊二醛浓度为1.5％，其比活力可达到393U/g，远高于游离磷脂酶D的活力(137U/g)，而交联无印迹固定化磷脂酶D最优戊二醛浓度为1.2％，其比活力仅为110U/g。这是因为，利用印迹技术，即通过酶与底物分子或抑制剂的预作用，使酶分子的三维结构发生定向变构，形成利于催化的“超活化”状态，这种“超活化”状态拥有与自然态的酶分子不同的三维结构，导致在分子间和分子内的交联作用时，为了维持一个最优的结构，根据其自身三维结构需要不同的戊二醛浓度。

实施例3：

本实施例给出一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，该方法按照以下步骤进行：

步骤一，磷脂酶D的印迹：

将0.1mL含有磷脂酰胆碱浓度为1mg/mL的乙醚溶液加入1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液(浓度为0.2M，pH值为5.5)，冰浴温和搅拌下，印迹60min，得到含有酶-底物配合物(印迹酶)溶液。

步骤二，磷脂酶D-底物配合物的沉淀：

向步骤一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加8mL过冷(0℃以下)无水沉淀剂无水乙醇，滴加完毕后，继续在冰浴下温和搅拌下沉淀10min，得到含有磷脂酶D-底物配合物聚集体混合溶液。

步骤三，磷脂酶D-底物配合物聚集体的交联：

冰浴条件下，向步骤二中得到的混合溶液中加入水溶性交联剂质量浓度为25％的戊二醛，调节反应液中戊二醛质量浓度分别为0.5％，0.8％，1.0％，1.2％，1.5％，1.8％，2％，2.3％，2.5％，交联120min，反应结束后离心收集产物，得到交联酶-底物配合物聚集体。

步骤四，磷脂酶D配体底物的洗涤脱除：

将步骤三中得到的交联酶-底物配合物聚集体用1mL过冷无水乙醇冲洗3遍，洗去酶分子的配合底物，然后用去离子水冲洗至少三次，洗去未交联的酶分子，冷冻干燥，得到交联印迹磷脂酶D聚集体，将制得交联印迹酶聚集体置于4℃保存备用。

对比例3：

本对比例给出一种磷脂酶D固定化方法，该方法的与实施例3的区别仅仅在于没有实施例3的步骤一，即在其制备过程中不用添加印迹底物磷脂酰胆碱。其余步骤与交联印迹磷脂酶D聚集体的制备一样，最终制得交联无印迹磷脂酶D聚集体。

本对比例制得的交联无印迹磷脂酶D聚集体作为对照组。

固定化酶活力的测定：

通过利用磷脂酰基转移反应制备磷脂酰甘油测定制备固定化磷脂酶D的活力，具体操作步骤如下：称取20μg制备的固定化磷脂酶D(交联印迹固定化酶或交联无印迹固定化酶)超声分散于0.5mL醋酸钠缓冲液中(0.2M，pH 5.5)，再加入0.05g丙三醇，将上述混合溶液与0.5mL磷脂酰胆碱浓度为1mg/mL的乙醚溶液混合。在400rpm，30℃下反应。每隔15min检测溶液中磷脂酰甘油的生成速率。固定化磷脂酶D酶的活力单位被定义为1min内转化1μmol底物所需的酶量为一个活力单位(U)。

图3是戊二醛浓度对所制备交联磷脂酰胆碱印迹磷脂酶D聚集体固定化酶活力的影响图，其中虚线代表游离磷脂酶D的活力。如图所示，当时用不同印迹底物时，以戊二醛用量为变量，观察到的现象与实施例2类似，即酶活力随戊二醛用量呈现先增大后减小的趋势，且交联印迹酶聚集体与交联无印迹酶聚集体有着不同的最优戊二醛用量。交联印迹固定化磷脂酶D其最优戊二醛浓度为1.0％，其比活力可达到228U/g，远高于游离磷脂酶D的活力(137U/g)，而交联无印迹固定化磷脂酶D最优戊二醛浓度为1.2％，其比活力仅为110U/g。相比丙三醇作为印迹物时，用磷脂酰胆碱作为印迹物分子得到的交联印迹酶聚集体其酶活力相对较低。这是因为，磷脂酰胆碱自身不溶于水，需要将磷脂酰胆碱溶于乙醚后再和水相混合，此时相界面间的传质阻力无法避免，导致印迹效果不明显。另外考虑到丙三醇相对磷脂酰胆碱，其价格十分便宜，因此在交联印迹酶聚集体生产过程中选用丙三醇作为印迹物分子更具有实际意义。

实施例4：

本实施例给出一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，该方法按照以下步骤进行：

步骤一，磷脂酶D的印迹：

与实施例1的步骤一相同。

步骤二，磷脂酶D-底物配合物的沉淀：

向步骤一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加8mL过冷(0℃以下)无水沉淀剂无水乙醇，滴加完毕后，继续在冰浴下温和搅拌下沉淀10min，得到含有磷脂酶D-底物配合物聚集体混合溶液。

步骤三，磷脂酶D-底物配合物聚集体的交联：

与实施例1的步骤三相同。

步骤四，磷脂酶D配体底物的洗涤脱除：

与实施例1的步骤四相同，得到交联印迹磷脂酶D聚集体，将制得交联印迹酶聚集体置于4℃保存备用。

对比例4：

本对比例给出一种磷脂酶D固定化方法，该方法的与实施例4的区别仅仅在于没有实施例4的步骤一，即在其制备过程中不用添加印迹底物丙三醇，其余步骤与交联印迹磷脂酶D聚集体的制备一样，最终制得交联无印迹磷脂酶D聚集体。

固定化酶回收再利用和酶活力的测定：

通过利用磷脂酰基转移反应制备磷脂酰甘油测定制备固定化磷脂酶D的活力，具体操作步骤如下：称取20μg制备的固定化磷脂酶D(交联印迹固定化酶或交联无印迹固定化酶)超声分散于0.5mL醋酸钠缓冲液中(0.2M，pH 5.5)，再加入0.05g丙三醇，将上述混合溶液与0.5mL磷脂酰胆碱浓度为1mg/mL的乙醚溶液混合。在400rpm，30℃下反应。使用后的固定化酶通过离心分离后回收再利用，固定化酶使用后先用去离子水反复冲洗，在4℃冷冻干燥即可再次使用，每次使用后都如此操作。重复使用后，测定酶活力，每隔15min检测溶液中磷脂酰甘油的生成速率。固定化磷脂酶D酶的活力单位被定义为1min内转化1μmol底物所需的酶量为一个活力单位(U)。

图4是交联丙三醇印迹磷脂酶D聚集体固定化酶的重复再利用的活性图，其中虚线代表游离磷脂酶D的活力。如图所示，交联印迹酶聚集体经重复使用8次后，酶比活力仍能达到140U/g，高于交联无印迹酶聚集体首次使用时的酶活力(115U/g)，甚至与游离磷脂酶D首次使用时的酶活力几乎一样(137U/g)。说明本方法制备的印迹固定化酶，其印迹效果即便在水溶液中仍能得到较好的保存，固定化酶的稳定性好，重复利用率高，从而达到降低成本的目的。

实施例5：

本实施例给出一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，该方法按照以下步骤进行：

步骤一，磷脂酶D的印迹：

将0.01g丙三醇加入1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液(浓度为0.2M，pH值为5.5)，冰浴温和搅拌下，印迹30min，得到含有酶-底物配合物(印迹酶)溶液。

步骤二，磷脂酶D-底物配合物的沉淀：

向步骤一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加10mL过冷(0℃以下)无水沉淀剂无水乙醇，滴加完毕后，继续在冰浴下温和搅拌下沉淀30min，得到含有磷脂酶D-底物配合物聚集体混合溶液。

步骤三，磷脂酶D-底物配合物聚集体的交联：

冰浴条件下，向步骤二中得到的混合溶液中加入水溶性交联剂质量浓度为25％的戊二醛，调节反应液中戊二醛质量浓度为1.5％，交联60min，反应结束后离心收集产物，得到交联酶-底物配合物聚集体。

步骤四，磷脂酶D配体底物的洗涤脱除：

将步骤三中得到的交联酶-底物配合物聚集体用去离子水冲洗，洗去酶分子的配合底物和未交联的酶分子，用去离子水冲洗至少3次，冷冻干燥，得到交联印迹磷脂酶D聚集体，将制得交联印迹酶聚集体置于4℃保存备用。

实施例6：

本实施例给出一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，该方法按照以下步骤进行：

步骤一，磷脂酶D的印迹：

将0.1g丙三醇加入1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液(浓度为0.2M，pH值为6.0)，冰浴温和搅拌下，印迹120min，得到含有酶-底物配合物(印迹酶)溶液。

步骤二，磷脂酶D-底物配合物的沉淀：

向步骤一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加9mL过冷(0℃以下)无水沉淀剂无水乙醇，滴加完毕后，继续在冰浴下温和搅拌下沉淀20min，得到含有磷脂酶D-底物配合物聚集体混合溶液。

步骤三，磷脂酶D-底物配合物聚集体的交联：

冰浴条件下，向步骤二中得到的混合溶液中加入水溶性交联剂质量浓度为25％的戊二醛，调节反应液中戊二醛质量浓度为1.5％，交联90min，反应结束后离心收集产物，得到交联酶-底物配合物聚集体。

步骤四，磷脂酶D配体底物的洗涤脱除：

将步骤三中得到的交联酶-底物配合物聚集体用去离子水冲洗，洗去酶分子的配合底物和未交联的酶分子，用去离子水冲洗至少3次，冷冻干燥，得到交联印迹磷脂酶D聚集体，将制得交联印迹酶聚集体置于4℃保存备用。

实施例7：

本实施例给出一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，该方法按照以下步骤进行：

步骤一，磷脂酶D的印迹：

将0.1mL含有磷脂酰胆碱浓度为0.1mg/mL的乙醚溶液加入1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液(浓度为0.2M，pH值为5.0)，冰浴温和搅拌下，印迹60min，得到含有酶-底物配合物(印迹酶)溶液。

步骤二，磷脂酶D-底物配合物的沉淀：

向步骤一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加8mL过冷无水沉淀剂无水乙醇，滴加完毕后，继续在冰浴下温和搅拌下沉淀10min，得到含有磷脂酶D-底物配合物聚集体混合溶液。

步骤三，磷脂酶D-底物配合物聚集体的交联：

冰浴条件下，向步骤二中得到的混合溶液中加入水溶性交联剂质量浓度为25％的戊二醛，调节反应液中戊二醛质量浓度为1.0％，交联120min，反应结束后离心收集产物，得到交联酶-底物配合物聚集体。

步骤四，磷脂酶D配体底物的洗涤脱除：

将步骤三中得到的交联酶-底物配合物聚集体用1mL过冷无水乙醇冲洗3遍，洗去酶分子的配合底物，然后用去离子水冲洗至少三次，洗掉未交联的酶分子，冷冻干燥，得到交联印迹磷脂酶D聚集体，将制得交联印迹酶聚集体置于4℃保存备用。

Claims (9)

1.一种提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，该方法按照以下步骤进行：

步骤一，将印迹底物加入到磷脂酶D溶液中进行配合，得到酶-底物配合物溶液；

步骤二，加入沉淀剂沉淀酶-底物配合物，得到含有酶-底物配合物聚集体混合溶液；

步骤三，向沉淀后的混合溶液中加入水溶性交联剂进行交联反应，得到交联酶-底物配合物聚集体；

步骤四，对交联酶-底物配合物聚集体进行洗涤，除去底物后得到交联印迹磷脂酶D聚集体。

2.如权利要求1所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，该方法具体按照以下步骤进行：

步骤一，磷脂酶D的印迹：

将印迹底物加入到磷脂酶D溶液中，搅拌30～120min，得到酶-底物配合物，其中：

所述的印迹底物为丙三醇或磷脂酰胆碱；

所述的磷脂酶D溶液为磷脂酶D的醋酸缓冲液；

每1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液中对应加入0.01～0.1g丙三醇；或者每1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液中对应加入0.1mL含有磷脂酰胆碱浓度为0.1～1mg/mL的乙醚溶液；

步骤二，磷脂酶D-底物配合物的沉淀：

向步骤一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加无水沉淀剂并搅拌，滴加完毕后，继续在搅拌下沉淀10～30min，得到含有磷脂酶D-底物配合物聚集体混合溶液，其中：

每1mL含有磷脂酶D浓度为0.05mg/mL的醋酸缓冲液中对应加入8～10mL无水沉淀剂；

步骤三，磷脂酶D-底物配合物聚集体的交联：

向步骤二中得到的混合溶液中加入水溶性交联剂进行交联反应60～120min，反应结束后离心收集产物，得到交联酶-底物配合物聚集体，其中：

水溶性交联剂的质量浓度控制在0.5％～2.5％之间；

步骤四，磷脂酶D配体底物的洗涤脱除：

将步骤三中得到的交联酶-底物配合物聚集体用纯化溶剂洗去酶分子的配合底物，再用去离子水洗去未交联的酶分子，冷冻干燥，得到交联印迹磷脂酶D聚集体。

3.如权利要求2所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，所述的步骤一、步骤二和步骤三均在冰浴条件下进行。

4.如权利要求2所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤一中，所述的醋酸缓冲液的浓度为0.2M，pH值为5.0～6.0。

5.如权利要求2所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤二中，所述的无水沉淀剂降温至0℃以下后再加入到磷脂酶D-底物配合物溶液中。

6.如权利要求2所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤二中，所述的无水沉淀剂为无水乙醇。

7.如权利要求2所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤三中，所述的水溶性交联剂为戊二醛。

8.如权利要求2所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤四中，若印迹底物为丙三醇，则对应的纯化溶剂为去离子水；若印迹底物为磷脂酰胆碱，则对应的纯化溶剂为无水乙醇。

9.如权利要求2所述的提高磷脂酰甘油合成反应活力的磷脂酶D固定化方法，其特征在于，步骤四中，所述的交联印迹磷脂酶D聚集体置于4℃下保存。