CN106947471A - 一种水溶性的金纳米簇荧光材料、制备方法及应用 - Google Patents

一种水溶性的金纳米簇荧光材料、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水溶性的金纳米簇荧光材料的制备方法，包括将氨基酸、牛血清蛋白、氯金酸和双蒸水混合均匀，得到原料混合物；调节原料混合物的pH，然后于37℃震荡反应10‑14h，得到热处理混合物；将热处理混合物用透析袋透析4‑8h，得到水溶性的金纳米簇荧光材料。本发明的制备方法具有合成简单、环境友好型污染小，且至少可以制备出发四种颜色荧光的材料，能够用于多色细胞成像、细胞标记和细胞定位等，同时该材料具有有机生物笼子的潜质，可以作为药物递送的载体。

Description

一种水溶性的金纳米簇荧光材料、制备方法及应用
技术领域
本发明属于金纳米簇荧光材料合成技术领域，具体涉及一种水溶性的金纳米簇荧光材料、制备方法及应用。
背景技术
药物运输与生物成像作为一种先进的现代技术，在生命科学领域中有着对分析生物样本以及疾病治疗的手段，它提供了可视化信息小区状况和疾病的分析，一直是人们致力于研究的内容。目前在细胞成像方面运用最多的是无机量子点、稀土材料、有机荧光小分子、聚合物分子以及荧光蛋白(GFP)标记法等，但是两者都存在自身的弱点，例如量子点的毒性以及荧光蛋白自身的光漂白性等，使得其用于更广泛的领域有一定的局限性。
自组装是一种普遍存在的组装构筑基团之间的有序排列的行为，自组装蛋白材料是一种近几年兴起的绿色生物纳米组装，通过人为的设计与控制组装基元可以得到许多不同类型的蛋白自组装材料。作为量子点以及有机荧光小分子的替代品，贵金属(金、银)纳米粒子以及纳米簇以其独特的光学性质而受到关注，尤其是超小型的金银纳米簇已经被用于生物成像和对于某些目标分子在分析调查检测荧光标记的传感器。
鉴于现有传统合成方法合成工艺复杂以及合成材料发光波长单一问题，应用受到限制，因此，有必要开发一种运用蛋白质、氨基酸、金杂化自组装、且低细胞毒性的纳米材料，并将其生物成像的领域。
发明内容
本发明提供的一种水溶性的金纳米簇荧光材料、制备方法及应用，解决了传统合成方法合成工艺复杂以及合成材料发光波长单一等问题。
本发明提供了一种水溶性的金纳米簇荧光材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将氨基酸、牛血清蛋白、氯金酸和双蒸水混合均匀，得到原料混合液，并使原料混合液中氨基酸的浓度为100mmol/L、牛血清蛋白的浓度为5mg/mL、氯金酸的浓度为1.6mg/mL；
所述氨基酸为甘氨酸或者组氨酸；
步骤2，调节原料混合液的pH，然后于37℃震荡反应10-14h，得到热处理混合物；
步骤3，将热处理混合物置于10kDa截留分子量的透析袋中，用超纯水透析4-8h，收集透析袋内的透析液，即为水溶性的金纳米簇荧光材料。
优选的，上述水溶性的金纳米簇荧光材料的制备方法中，步骤2中调节原料混合液的pH至1.5时，步骤3相应的得到水溶性的绿色荧光金纳米簇荧光材料；
步骤2中调节原料混合液的pH至5.5时，步骤3相应的得到水溶性的蓝色荧光金纳米簇荧光材料；
步骤2中调节原料混合液的pH至7.5时，步骤3相应的得到水溶性的黄色荧光金纳米簇荧光材料；
步骤2中调节原料混合液的pH至12.5时，步骤3相应的得到水溶性的红色荧光金纳米簇荧光材料。
优选的，上述水溶性的金纳米簇荧光材料的制备方法中，调节原料混合物的pH时采用的是1mol/L的氢氧化钠溶液或者1mol/L的盐酸溶液。
本发明还提供了由上述任一种制备方法制备而成的水溶性的金纳米簇荧光材料。
本发明还提供了上述水溶性的金纳米簇荧光材料在生物成像中的应用。
本发明还提供了上述水溶性的金纳米簇荧光材料在多色细胞成像、细胞标记或者细胞定位中的应用。
本发明还提供了上述水溶性的金纳米簇荧光材料作为药物递送载体的应用。
与现有技术相比，本发明的水溶性的金纳米簇荧光材料具有以下有益效果：
1、设计了一个蛋白组装与原位合成金纳米簇同时进行的组装杂化材料，运用蛋白质、氨基酸、金杂化自组装，该材料使用金纳米簇、牛血清白蛋白和氨基酸作为构建模块自组装形成的，通过对形貌的观测发现其同时具有有机生物笼子的潜质。同时该材料具有高度生物相容性、低的细胞毒性，并且可以容易地内化进入不同类型的细胞。
2、在组装该材料的过程中，由于pH变化以及金的存在导致了自由基的产生，引发了自由基的聚合反应组装，并且在组装过程中首先形成环状结构，最后形成类似核壳状的组装体。
3、本发明所述的金纳米簇荧光材料是在有蛋白质与氨基酸掺杂的前提下合成的，与其它的金纳米簇荧光材料相比具有合成相对简单、环境友好型污染小，且材料可以发出至少四种颜色的光，能够用于细胞成像等领域，由于本发明的荧光探针具有多种发光颜色，因此还能够用于多色细胞成像、细胞标记和细胞定位等，同时该材料具有有机生物笼子的潜质，作为药物递送的载体。
附图说明
图1为金纳米簇荧光材料在扫描电镜下的整体形貌图；
其中，1a为蓝色荧光金纳米簇荧光材料在扫描电镜下的整体形貌图；1b为绿色荧光金纳米簇荧光材料在扫描电镜下的整体形貌图；1c为黄色荧光金纳米簇荧光材料在扫描电镜下的整体形貌图；1d为红色荧光金纳米簇荧光材料在扫描电镜下的整体形貌图；
图2为制备金纳米簇荧光材料过程中，不同震荡反应时间下蓝色荧光金纳米簇荧光材料的形貌图；
其中，图2a-2i分别代表反应时间为0min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h时蓝色荧光金纳米簇荧光材料的形貌图；
图3为制备蓝色荧光金纳米簇荧光材料过程中，震荡反应2h、12h时的电子自旋共振谱仪检测结果图；
图4不同颜色荧光金纳米簇荧光材料的光漂白实验结果图；
图中，横坐标1为罗丹明6G材料，横坐标2为BSA-AuNCs金簇材料，横坐标3为蓝色荧光金纳米簇荧光材料，横坐标4为绿色荧光金纳米簇荧光材料，横坐标5为黄色荧光金纳米簇荧光材料，6为红色荧光金纳米簇荧光材料；
图5不同颜色荧光金纳米簇荧光材料的毒性试验结果图；
图6不同颜色荧光金纳米簇荧光材料的细胞成像标记结果图；
其中，图6a、6e、6i、6m分别是蓝色、绿色、黄色、红色荧光金纳米簇荧光材料进入HELA细胞内后的荧光影像，图6b、6f、6j、6n分别是蓝色、绿色、黄色、红色荧光金纳米簇荧光材料进入HELA细胞内后的经溶菌酶染料标记后的细胞荧光影像，图6c、6g、6k、6o分别是蓝色、绿色、黄色、红色荧光金纳米簇荧光材料进入HELA细胞内后在明场下的细胞荧光影像；图6d是图6a和图6b的叠加效果，图6h是图6e和图6f的叠加效果，图6l是图6i和图6j的叠加效果，图6p是图6m和图6n的叠加效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明提供的一种水溶性的金纳米簇荧光材料，包括以下实施例：
实施例1
一种水溶性的金纳米簇荧光材料，具体按照以下步骤制备：
步骤1，将甘氨酸、牛血清蛋白、氯金酸和双蒸水混合均匀，得到原料混合液，并使原料混合液中甘氨酸的浓度为100mmol/L、牛血清蛋白的浓度为5mg/mL、氯金酸的浓度为1.6mg/mL；
步骤2，用1mol/L的盐酸溶液调节原料混合液的pH至1.5，然后于37℃震荡反应12h，得到热处理混合物；
步骤3，将热处理混合物置于10kDa截留分子量的透析袋中，用超纯水透析4h，以除去未反应的小分子，收集透析袋内的透析液，即为水溶性的绿色荧光金纳米簇荧光材料。
实施例2
一种水溶性的金纳米簇荧光材料，具体按照以下步骤制备：
步骤1，将组氨酸、牛血清蛋白、氯金酸和双蒸水混合均匀，得到原料混合液，并使原料混合液中组氨酸的浓度为100mmol/L、牛血清蛋白的浓度为5mg/mL、氯金酸的浓度为1.6mg/mL；
步骤2，调节原料混合液的pH至5.5，然后于37℃震荡反应10h，得到热处理混合物；
步骤3，将热处理混合物置于10kDa截留分子量的透析袋中，用超纯水透析8h，以除去未反应的小分子，收集透析袋内的透析液，即为水溶性的蓝色荧光金纳米簇荧光材料。
实施例3
一种水溶性的金纳米簇荧光材料，具体按照以下步骤制备：
步骤1，将1mmol的甘氨酸、50mg的牛血清蛋白、16mg的氯金酸混合，然后用双蒸水定容至10mL，混合均匀，得到原料混合液，最终原料混合液中甘氨酸的浓度为100mmol/L、牛血清蛋白的浓度为5mg/mL、氯金酸的浓度为1.6mg/mL；
步骤2，调节原料混合液的pH至7.5，然后于37℃震荡反应14h，得到热处理混合物；
步骤3，将热处理混合物置于10kDa截留分子量的透析袋中，用超纯水透析6h，以除去未反应的小分子，收集透析袋内的透析液，即为水溶性的黄色荧光金纳米簇荧光材料。
实施例4
一种水溶性的金纳米簇荧光材料，具体按照以下步骤制备：
步骤1，将10mmol的甘氨酸、500mg的牛血清蛋白、160mg的氯金酸混合，然后用双蒸水定容至100mL，混合均匀，得到原料混合液，最终原料混合液中甘氨酸的浓度为100mmol/L、牛血清蛋白的浓度为5mg/mL、氯金酸的浓度为1.6mg/mL；
步骤2，调节原料混合液的pH至12.5，然后于37℃震荡反应14h，得到热处理混合物；
步骤3，将热处理混合物置于10kDa截留分子量的透析袋中，用超纯水透析6h，以除去未反应的小分子，收集透析袋内的透析液，即为水溶性的红色荧光金纳米簇荧光材料。
需要说明的是，上述水溶性的金纳米簇荧光材料的制备方法实施例中，调节原料混合物的pH时采用的是1mol/L的氢氧化钠溶液或者1mol/L的盐酸溶液。
需要说明的是，上述本发明的制备方法及实施例1-4中，制备的水溶性的绿色荧光金纳米簇荧光材料、水溶性的蓝色荧光金纳米簇荧光材料、水溶性的黄色荧光金纳米簇荧光材料、水溶性的红色荧光金纳米簇荧光材料，可以直接将液体于4℃保存半年，或者冻干成粉末后-20℃长期保存。
下面，我们对水溶性的金纳米簇荧光材料为例进行一系列的表征与应用。
一、整体形貌
我们利用扫描电镜对制备而成的金纳米簇荧光材料的整体形貌进行观察，结果如图1所示，所述金纳米簇荧光材料具有四种颜色，1a为蓝色荧光金纳米簇荧光材料在扫描电镜下的整体形貌图；1b为绿色荧光金纳米簇荧光材料在扫描电镜下的整体形貌图；1c为黄色荧光金纳米簇荧光材料在扫描电镜下的整体形貌图；1d为红色荧光金纳米簇荧光材料在扫描电镜下的整体形貌图；每种颜色金纳米簇荧光材料的颗粒大小和形状均较均匀且清晰可辨。
二、形貌特征与振荡反应时间之间的关系
为了探索金纳米簇荧光材料的形貌特征与振荡反应时间之间的关系，我们利用扫描电镜分别观察了反应时间为0min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h时蓝色荧光金纳米簇荧光材料的形貌图，结果如图2所示，其中，图2a-2i分别代表反应时间为0min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h时蓝色荧光金纳米簇荧光材料的形貌图，材料首先聚集成球壳结构，随着时间的推移，壳球变小，最终形成球状结构。
三、反应类型
为了鉴定金纳米簇荧光材料制备过程中的反应类型，我们以蓝色荧光金纳米簇荧光材料为例，利用电子自旋共振谱仪检测了震荡反应2h、12h时的自由基的变迁过程，结果如图3所示，根据EPR数据处理公式g的计算方法：g＝hμ/Hβ，可以得到反应两小时的时候g＝2.07，反应12小时的时候g＝2.11，再结合图3的结果，可以确定金纳米簇荧光材料的生成是一个高分子自由基聚合式反应。
四、光漂白实验
为了检测金纳米簇荧光材料的抗光漂白特性，我们进行了光漂白实验，具体操作步骤如下：
分别制备罗丹明6G材料(对图4中应横坐标1，作为对照)、BSA-AuNCs金簇材料(对图4中应横坐标2，作为对照)、蓝色荧光金纳米簇荧光材料(对应图4中横坐标3)、绿色荧光金纳米簇荧光材料(对应图4中横坐标4)、黄色荧光金纳米簇荧光材料(对应图4中横坐标5)、红色荧光金纳米簇荧光材料(对应图4中横坐标6)的水溶液，需要说明的是，本发明的金纳米簇荧光材料均为水溶性材料，其中罗丹明6G材料的浓度为1μmol/L，本发明的金纳米簇荧光材料均为水溶性材料，以金的浓度计算溶液的浓度均为50μmol/L。
将上述样品的水溶液沉积在石英载玻片上并照射5min(λex＝355nm；3.5mW)。将照射前后的荧光强度标准化以进行比较，记录荧光强度值，结果参图4，通过对比可以看出，横坐标3-6的荧光强度值较高，即蓝色荧光、绿色荧光、黄色荧光和红色荧光的金纳米簇荧光材料抗光漂白性比较强。
五、细胞毒性检测
金纳米簇荧光材料的细胞毒性是利用大肠杆菌的生长曲线来进行评估的。具体的操作过程是：
S1、将大肠杆菌DH5α菌落接种到LB培养基中，在37℃(150rpm)的恒温振荡器中温育过夜(12小时)，直到大肠杆菌的OD600达到约3.5。
S2、通过离心收获细菌，并使用PBS缓冲液洗涤3次，并用新鲜LB培养基重悬至OD600＝0.3，得到重悬细胞。
S3、将上述重悬细胞与0.2mM的金纳米簇荧光材料混合；或者将上述重悬细胞与PBS缓冲液(PBS缓冲液与金纳米簇荧光材料的体积相等)混合；上述混合后的细胞样品在37℃、150rpm的恒温振荡器中进一步温育，每隔一段时间测量OD600，直到细胞达到稳定生长。其中每组实验都平行重复三次。
分别记录大肠杆菌的生长曲线，结果如图5所示，图5中blank为对照组，PGHMS-R对应的是实验组红色荧光金纳米簇荧光材料，PGHMS-Y对应的是实验组黄色荧光金纳米簇荧光材料，PGHMS-G对应的是实验组绿色荧光金纳米簇荧光材料，PGHMS-B对应的是实验组蓝色荧光金纳米簇荧光材料。
实验组与对照组的大肠杆菌生长曲线趋势接近，区别不大，说明四种荧光颜色金纳米簇荧光材料对大肠杆菌的生长曲线的影响都比较小，证明本发明的金纳米簇荧光材料的细胞毒性比较小。
六、应用
为了验证本发明的金纳米簇荧光材料在细胞成像方面的应用，我们利用四种荧光颜色金纳米簇荧光材料进行了细胞成像实验，具体操作如下：
HELA细胞在含有10％(V/V)胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养基中含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。将大约5×104的细胞接种到24孔板的每一个孔中，在CO2浓度为5％的37℃培养箱中培养过夜。第二天，将培养基更换为200μL的含PGHM(0.2mM)的DMEM培养基中在37℃孵育6h后，然后与溶酶体红色荧光探针或溶酶体绿色荧光探针孵育另外10分钟。并用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤两次。通过高通量成像荧光显微镜(LSM710来自德国)检测细胞形态结构。所有共聚焦荧光显微镜(CFM)固定的激发波长为405nm，结果图6所示。
图6a蓝色荧光金纳米簇荧光材料进入HELA细胞内后的荧光影像，图6b蓝色荧光金纳米簇荧光材料进入HELA细胞内后的经溶菌酶染料标记后的细胞荧光影像，图6c蓝色荧光金纳米簇荧光材料进入HELA细胞内后在明场下的细胞荧光影像，图6d是图6a和图6b的叠加效果；
图6e、6i、6m分别是绿色、黄色、红色荧光金纳米簇荧光材料进入HELA细胞内后的荧光影像，图6f、6j、6n分别是绿色、黄色、红色荧光金纳米簇荧光材料进入HELA细胞内后的经溶菌酶染料标记后的细胞荧光影像，图6g、6k、6o分别是绿色、黄色、红色荧光金纳米簇荧光材料进入HELA细胞内后在明场下的细胞荧光影像；图6h是图6e和图6f的叠加效果，图6l是图6i和图6j的叠加效果，图6p是图6m和图6n的叠加效果。
从图6的结果可以看出，不同颜色荧光金纳米簇荧光材料均可呈现明显的细胞影像，细胞图像清晰可辨，有机生物笼子的潜质，在细胞成像方面、在多色细胞成像、细胞标记或者细胞定位方面、作为药物递送载体的应用方面均具有良好的应用前景。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种水溶性的金纳米簇荧光材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将氨基酸、牛血清蛋白、氯金酸和双蒸水混合均匀，得到原料混合液，并使原料混合液中氨基酸的浓度为100mmol/L、牛血清蛋白的浓度为5mg/mL、氯金酸的浓度为1.6mg/mL；
所述氨基酸为甘氨酸或者组氨酸；
步骤2，调节原料混合液的pH，然后于37℃震荡反应10-14h，得到热处理混合物；
步骤3，将热处理混合物置于10kDa截留分子量的透析袋中，用超纯水透析4-8h，收集透析袋内的透析液，即为水溶性的金纳米簇荧光材料。
2.根据权利要求1所述的水溶性的金纳米簇荧光材料的制备方法，其特征在于，步骤2中调节原料混合液的pH至1.5时，步骤3相应的得到水溶性的绿色荧光金纳米簇荧光材料；
步骤2中调节原料混合液的pH至5.5时，步骤3相应的得到水溶性的蓝色荧光金纳米簇荧光材料；
步骤2中调节原料混合液的pH至7.5时，步骤3相应的得到水溶性的黄色荧光金纳米簇荧光材料；
步骤2中调节原料混合液的pH至12.5时，步骤3相应的得到水溶性的红色荧光金纳米簇荧光材料。
3.根据权利要求1所述的水溶性的金纳米簇荧光材料的制备方法，其特征在于，调节原料混合物的pH时采用的是1mol/L的氢氧化钠溶液或者1mol/L的盐酸溶液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法制备而成的水溶性的金纳米簇荧光材料。
5.根据权利要求4所述的水溶性的金纳米簇荧光材料在生物成像中的应用。
6.根据权利要求4所述的水溶性的金纳米簇荧光材料在多色细胞成像、细胞标记或者细胞定位中的应用。
7.根据权利要求4所述的水溶性的金纳米簇荧光材料作为药物递送载体的应用。
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