CN106943385A

CN106943385A - 3‑去氧苏木查尔酮在制备预防和治疗结直肠癌药物中的应用

Info

Publication number: CN106943385A
Application number: CN201710261990.8A
Authority: CN
Inventors: 董子钢; 李美贤; 黄海; 赵冉; 刘雪娇; 崔富荣; 刘康栋
Original assignee: China (henan) Hormel Institute For Cancer Research
Current assignee: China (henan) Hormel Institute For Cancer Research
Priority date: 2017-04-20
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2017-07-14

Abstract

本发明涉及天然化合物3‑去氧苏木查尔酮（3‑Deoxysappanchalcone，简称3‑DSC）在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。本发明通过细胞增殖实验，验证了3‑DSC在结直肠癌细胞系中的抑制效果，尤其在TOPK高表达的HCT‑15、HCT‑116、SW620和DLD1四个细胞系中，为临床研究预防和治疗结直肠癌药物提供帮助和依据。

Description

3-去氧苏木查尔酮在制备预防和治疗结直肠癌药物中的应用

技术领域

本发明属于医药化工领域，具体涉及一种化合物3-去氧苏木查尔酮的抗肿瘤活性，其可用于制备预防和治疗结直肠癌药物、以及靶向结直肠癌中具有促进肿瘤细胞增殖的TOPK蛋白的药物开发等。

背景技术

结直肠癌是消化道恶性肿瘤之一，也是胃肠道肿瘤中仅次于食管癌的第二大恶性肿瘤，结直肠癌在以手术为主联合化疗、放疗的综合治疗策略下，疗效有一定的进步。但是由于化疗失败导致的结直肠癌的复发和转移的恶性进展依然是临床亟待解决的关键问题。

TOPK是一个新近发现的丝氨酸，苏氨酸蛋白激酶，是一个重要的信号分子。在生理情况下，TOPK仅表达于睾丸和胸腺中，与机体生殖细胞的成熟和免疫细胞激活有关。近年来研究显示：TOPK在多种恶性肿瘤细胞中呈高表达，不仅调控着肿瘤细胞的有丝分裂和细胞周期，并且参与了肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡过程。关于TOPK与肿瘤关系的研究正日益被人们关注，其特异性阻断剂也已被应用于肿瘤学研究中。而本发明意在通过3-DSC能够明显靶向TOPK，继而通过其结构类似物得到更多的靶向TOPK 的抑制剂，为临床治疗结肠癌的药物提供更多的选择。

发明内容

本发明目的在于提供一种化合物3-去氧苏木查尔酮的抗肿瘤活性，其在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。

我国不仅拥有着丰富的中草药资源，而且中医药在近年来已经以其副作用小，疗效独特的优势开始踏入世界医药舞台，在我国的肿瘤防治方面更是发挥着重要的作用。而3-去氧苏木查尔酮，即是从我国传统中药材苏木（Caesalpinia sappanL.）中分离得到的天然化合物。前期研究表明：3-去氧苏木查尔酮（简称3-DSC，结构式如下所示，分子式：C₁₆H₁₄O₄，分子量：270.3，CAS号为112408-67-0）具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗补体作用等；

。

本发明中，着重研究了3-去氧苏木查尔酮在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。3-去氧苏木查尔酮为天然化合物，在验证其是否具有抑制肿瘤增殖的实验中要求其纯度需≥95％以上。

具体的，可以是3-去氧苏木查尔酮在制备预防和治疗结直肠癌药物中的应用。

本发明中，通过试验发现：结合在正常结直肠细胞系中的毒性筛选，确定3-去氧苏木查尔酮的安全浓度为2.5 µM－20 µM，并发现在该浓度范围下，该化合物可以明显抑制结肠癌不同细胞系的增殖、以及能够明显抑制结肠癌细胞克隆的形成数量及大小。此外，3-去氧苏木查尔酮可以明显诱导细胞凋亡并阻断G2/M期致使细胞周期停滞。

3-去氧苏木查尔酮可用于靶向结直肠癌中具有促进肿瘤细胞增殖的TOPK蛋白药物的开发。

本发明中明确TOPK在结肠癌细胞系中有高表达，并筛选出可以高表达的四个细胞系（HCT-15、HCT-116、SW620及DLD1）。还发现了3-DSC是靶向结直肠癌中的具有促进肿瘤细胞增殖的TOPK 蛋白的天然化合物。在3-DSC结构上进行改造并在适宜条件下合成的衍生物也具有抗肿瘤的作用。

本发明中的靶点为TOPK蛋白，TOPK是近年来才作为治疗结肠癌患者发现的一个新的蛋白，对于该蛋白的功能研究已经有学者报道过，但是对于将该蛋白作为靶点治疗结肠癌患者的药物还没有报道过，即使有文献报道的HI-TOPK-032可以有效抑制结肠癌中该蛋白的表达，并且作为许多学者进行研究的阳性对照，该抑制剂也没有应用于临床治疗。因此，本发明欲通过相关实验证明该天然化合物3-去氧苏木查尔酮可以有效抑制结肠癌肿瘤的生长并诱导肿瘤细胞的凋亡，从而最终实现该化合物可以用于结直肠癌患者的临床治疗。

本发明通过激酶实验筛选得到的3-去氧苏木查尔酮及其IC50值，并证明具有明显抑制结肠癌细胞增殖的作用。根据在正常结肠细胞中的毒性实验表明：该化合物3-DSC在20µM时没有毒性作用，在结肠癌细胞系中的抑制作用可以明确在该浓度条件下，可以有效抑制结肠癌细胞的增殖。此外，本发明发现3-去氧苏木查尔酮在G2/M期阻断细胞周期的进行；并可以显著诱导细胞凋亡。

附图说明

图1 为通过激酶方法得到靶向TOPK的化合物，即本发明中的化合物3-去氧苏木查尔酮（3-DSC）；

图2为3-去氧苏木查尔酮（3-DSC）在正常结肠细胞中的毒性作用；

图3为3-去氧苏木查尔酮（3-DSC）在不同结肠癌细胞系中的抑制作用；

图4为3-去氧苏木查尔酮（3-DSC）抑制结肠癌细胞克隆的形成。其中，随着化合物浓度的增加，克隆数显著降低，并且克隆明显变小。图为对加药以及对照组克隆数量的统计结果；

图5为3-去氧苏木查尔酮（3-DSC）诱导结肠癌细胞周期阻滞，在安全范围内诱导结肠癌细胞在G2/M期阻滞。结果采用流式测定法对不同浓度3-DSC诱导的G2/M期细胞的阻滞从而表现出G2/M期细胞增多；

图6 为3-去氧苏木查尔酮（3-DSC）具有明显诱导的细胞凋亡的作用；

图7为3-DSC可以有效与TOPK结合并抑制其磷酸化的水平；

图8为3-DSC可与ATP竞争性结合TOPK激酶位点。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

本发明首先通过激酶筛选实验得到3-去氧苏木查尔酮（3-DSC）能够有效靶向TOPK。在此基础上进行细胞增殖实验（MTT，非锚定性生长实验，细胞周期与凋亡）的研究；药物靶向蛋白结合实验研究；药物与ATP的竞争性结合实验研究；激酶实验研究；以及药物靶向TOPK的信号通路和凋亡的研究包括该天然化合物在不同时间点对信号通路的研究等，最后应用于动物实验研究。

材料与方法

1 材料。

1.1 结肠癌细胞系

本发明中使用的结肠癌细胞系均来自于ATCC（包括人正常结肠上皮细胞CCD841 CoN、人结肠癌细胞HCT-15、HCT-116、SW620、SW480、DLD1和HT-29）。

1.2 试剂

PRIM-1640培养基（BI公司），McCoy’s5A培养基（BI公司），FBS胎牛血清（BI公司），双抗（solarbio），胰酶（solarbio），噻唑蓝（MTT, Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO，上海市科密欧化学试剂有限公司）；PBS。

1.3 耗材及仪器

1.3.1 海尔医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司），分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），Thermo 超净工作台，水套式CO₂细胞培养箱（Thermo），酶标仪，流式细胞分析仪（BD公司）

1.3.2 移液枪，移液管（规格分别为5 ml/10、ml/25 ml），6孔板，96孔板。

1.4 实验方法。

1.4.1 细胞增殖实验研究：

将已筛选的能够大量表达TOPK的结肠癌细胞种于96孔板中，每孔细胞数为1000个，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养，经过24小时，细胞贴壁后，给予3-去氧苏木查尔酮进行处理，然后分别于0h、24h、48h以及72h后加入20 µl 噻唑蓝（MTT）随即放入37℃，5%CO₂培养箱中孵育1个小时，取出后将96孔板内的液体弃掉，加入100 µl二甲基亚砜（DMSO），利用酶标仪在波长为570 nm和620 nm下检测细胞增殖情况。

1.4.2 非锚定性实验研究：

非锚定生长是肿瘤细胞生长的重要特性之一；发明人在不同浓度下察看化合物对结直肠癌细胞生长的抑制作用（下层胶为0.6% Agar加入相应浓度的3-DSC，上层胶为0.3% Agar加入相应浓度的3-DSC），并在两周或者三周进行拍照，然后计算抑制效率。

1.4.3 细胞周期与凋亡：

将筛选到的敏感结直肠癌细胞以2×10⁵ 个接种到直径为60mm 的细胞培养皿中，然后放入到37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养24h。细胞周期实验组待细胞贴壁24h后，加入不含血清（胎牛血清）和双抗（青链霉素混合液）的RPMI1640培养基，饥饿24 小时，然后换成含有血清和双抗的RPMI1640培养基，加药后继续培养48h。然后经过收集，70%乙醇固定染色后，用流式细胞仪检测并分析细胞周期阻滞情况；细胞凋亡实验组，待细胞贴壁24h 后，换不含血清和抗生素的培养基饥饿24 小时，然后给予不同浓度（0μM、5μM、10μM、20μM）的化合物治疗，72h 后收集细胞，检测并分析细胞凋亡结果。

1.4.4 3-DSC与TOPK激酶的结合及抑制实验：

取激酶反应液60 µl及TOPK 激酶8µl混合后，分装于0.5ml的EP管中，每管17µl混合液，然后于每管中加不同浓度的的化合物3-去氧苏木查尔酮（0μM 、5μM、10μM、20μM）1 µl，同时设对照组（即只含有激酶反应液的对照组），于室温条件下反应10 min；再将含有ATP和激酶底物的混合液（25µl的ATP与10µl的激酶底物）加入到先前的反应液中混合，每管7 µl，于30℃的金属浴中反应30 min；然后取出后每管加入5µl的缓冲液（溴酚蓝），于95℃的金属浴中反应5 min；取出后，在固定电压为90V的条件下进行蛋白泳动，再于电压为70V的条件下将蛋白转到硝酸纤维素膜上。利用蛋白质免疫印迹技术通过对丝-苏氨酸磷酸化抗体检测底物磷酸化水平进而检测底物蛋白与激酶的含量水平。

1.4.5收集结直肠癌敏感细胞，并通过裂解，BCA 检测获得已知浓度的细胞裂解液。利用琼脂糖4B 结合实验在蛋白质印迹技术下检测该化合物与激酶的结合效果，孵育相应的抗体检测；同时，利用化合物与4B 琼脂糖微球偶联共聚体，再于不同浓度的ATP（0μM 、10μM、100μM、1000μM）进行结合，然后在固定电压为90V的条件下进行蛋白泳动，再于电压为70V的条件下将蛋白转到硝酸纤维素膜上，利用蛋白免疫印迹技术检测化合物与ATP 竞争性结合效果。

1.5 实验结果。

本发明首先通过激酶方法筛选得到的化合物3-去氧苏木查尔酮3-DSC及其IC50值（见图1），从而判断该化合物可以有效靶向TOPK（IC50值小，说明效果较好）。

TOPK在许多种肿瘤细胞中均有表达，本发明选取了结肠癌细胞系，因此首先对正常结肠细胞系CCD8841 CoN进行毒性筛选，结果见图2。图2表明该化合物在20µM时没有毒性。

本发明同时考察了在不同结肠癌细胞系中3-DSC对结肠癌细胞的抑制作用（给药处理24、48和72小时，测定细胞生长情况，三次独立试验）结果见图3。

在非锚定性实验研究中，考察了3-DSC对癌细胞形成的克隆及大小的抑制作用，结果（见图4）发现，在浓度为20µM时，3-DSC可有明显抑制克隆的形成或减小克隆形成的面积。

本发明考察了3-DSC对细胞周期的影响，结果（见图5）显示3-DSC诱导细胞周期停滞在G2/M期。

本发明考察了3-DSC对细胞凋亡的影响，结果（见图6）显示3-DSC可以明显诱导结肠癌细胞的凋亡。

本发明考察了3-DSC与TOPK结合及对激酶的抑制作用。结果（见图7）再次显示该化合物靶向TOPK，使其底物发生磷酸化。

本发明也考察了3-DSC与ATP竞争性结合TOPK激酶位点的关系。结果（见图8）显示3-DSC在结合TOPK位点时与ATP成竞争关系，再次说明3-DSC可以抑制该激酶的磷酸化活性。

综上，通过细胞增殖实验，验证了3-DSC在结直肠癌细胞系中的抑制效果，尤其在TOPK高表达的HCT-15、HCT-116、SW620和DLD1四个细胞系中。本发明首先通过激酶筛选实验得到靶向TOPK的3-DSC化合物及其IC50值，然后在结肠的正常细胞中进行毒性的筛选，从而确定给药的安全浓度；再在结直肠癌细胞系中给予化合物3-DSC处理，并在处理后的0h、24h、48h以及72h检测细胞的增殖情况，在确定该化合物3-DSC对结直肠癌细胞系有抑制作用情况下，并且发现在相同浓度下验证细胞的非锚定性生长状况也受到抑制，同时发现细胞周期在G2/M期受到阻滞、并可以明显诱导细胞凋亡。从而显示了该化合物对结肠癌细胞有显著抑制作用。为临床研究预防和治疗结直肠癌药物提供帮助。

Claims

1.3-去氧苏木查尔酮在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，3-去氧苏木查尔酮在制备预防和治疗结直肠癌药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，结合在正常结直肠细胞系中的毒性筛选，确定3-去氧苏木查尔酮的安全浓度为2.5 µM－20 µM。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，3-去氧苏木查尔酮可以明显诱导细胞凋亡并阻断G2/M期致使细胞周期停滞。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，3-去氧苏木查尔酮用于靶向结直肠癌中具有促进肿瘤细胞增殖的TOPK蛋白药物的开发。