CN106937948B - 葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents
葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白‑淀粉纳米颗粒的制备方法及其应用。本发明涉及纳米颗粒制备和食品医药领域,具体涉及伴刀豆球蛋白和支链淀粉通过组装得到葡萄糖响应性的纳米颗粒及其制备工艺。该制备工艺为配制含氯化钠的伴刀豆球蛋白(ConA)浓度为0.5‑1.5mg/mL的乙酸缓冲溶液,加入一定量的浓度为1‑10mg/mL的糊化淀粉乳,制得氯化钠浓度为0.013‑0.120g/mL的悬浮液,在15‑35℃下不断搅拌,反应1‑60min,冷冻干燥得到纳米颗粒。制备过程简单、条件温和、载药率高,并且具有非常显著葡萄糖响应型的效果,可以包埋药物如胰岛素等提高胃肠道对药物输送效率,提高其生物利用率,保护具有生物活性的胰岛素等,防止外界环境中的光、pH值等对其的影响,提高活性成分的稳定性,保护活性部位,有效减少药物的添加量和毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及纳米颗粒制备和食品医药领域,具体涉及伴刀豆球蛋白和支链淀粉通过组装得到葡萄糖响应性的纳米颗粒及其制备工艺。
背景技术
近年来,载药响应型的纳米结构受到越来越多的关注,包括pH、盐、温度等响应型,尤其是葡萄糖响应型药物载体备受关注。葡萄糖响应型的药物载体能够根据环境葡萄糖浓度变化调节药物释放量,用它作为胰岛素载体能模拟胰岛的智能分泌胰岛素功能,在降低血糖的同时能够有效避免低血糖的发生,因而对控制血糖平衡有很大帮助,是糖尿病患者的一种理想的给药方式。
中国专利CN201310068833.7介绍了一种葡萄糖响应性药物控释载体的制备方法,该方法1)将含糖单元的聚合物溶于碱液中并加入二乙烯基砜,调节pH停止反应,经透析得到带有乙烯基砜基团的含糖单元的聚合物;2)将制得的物质溶解于缓冲溶液中,加入Con A活化液;3)将步骤2)中得到的混合物用缓冲溶液调节pH之后滴加到环己烷与乳化稳定剂混合溶液中,反应后去除上层油相,下层经沉淀即得葡萄糖响应性载体。该方法使用的有机试剂种类多,并且有些试剂毒性较强,如二乙烯基砜,环己烷,安全性低,处理过程复杂,耗时长,仅仅透析就需要4-7天,效率低,制得的凝胶载体的载药性比纳米级的材料要差。
淀粉是一类重要的具有生物可降解性、可再生、良好生物相容性的天然多糖类高分子材料,来源丰富,价格低廉,作为载体材料在药物控制释放领域已经得到部分应用。目前通过淀粉已经制备出了淀粉纳米颗粒,但是它并不是葡萄糖响应型的材料,对于一些药物组分如胰岛素等则无法通过单独使用淀粉载体达到葡萄糖响应型的控释的目的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的葡萄糖响应型载体制备复杂、安全性低、载药性差的上述缺陷,提供一种葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒,制备过程简单、条件温和、载药率高,并且具有非常显著葡萄糖响应型的效果。
本发明是采用以下的技术方案实现的:
一种葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的制备工艺,包括以下步骤:配制含氯化钠的伴刀豆球蛋白(ConA)浓度为0.5-1.5mg/mL的乙酸缓冲溶液,加入一定量的浓度为1-10mg/mL的糊化淀粉乳,制得氯化钠浓度为0.013-0.120g/mL的悬浮液,在15-35℃下不断搅拌,反应1-60min,冷冻干燥得到纳米颗粒。
所述乙酸缓冲液为pH为3.2-8.9、浓度0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液。
所述糊化淀粉乳的配制采用pH为4-6的浓度为1mol/L磷酸缓冲液。
所述糊化淀粉乳在糊化前先去除淀粉中的直链淀粉。
所采用的淀粉中支链淀粉含量为85-100%。
所采用的淀粉为蜡质玉米淀粉、糯性大米淀粉、蜡质马铃薯淀粉、蜡质小麦淀粉或普通玉米淀粉中的任意一种或几种。
所述搅拌的转速为200-500rpm。
所述冻干工艺为真空度5-10Pa,温度-80--60℃,时间48-72h。
本发明还提供一种包埋胰岛素的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:在ConA乙酸缓冲溶液中加入胰岛素,然后加入到1mg/mL的糊化蜡质玉米淀粉乳中,使最终氯化钠的浓度为0.120g/mL,室温下搅拌反应10min,最后在真空度8Pa、-80℃条件下冻干,得到包埋胰岛素的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒。
本发明的有益效果为:
(1)制备过程简单易行,条件温和,制备过程没有有毒的试剂的参与,安全性高;
(2)制备得到的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒,载药率高,可以包埋药物如胰岛素等提高胃肠道对药物输送效率,提高其生物利用率,保护具有生物活性的胰岛素等,防止外界环境中的光、pH值等对其的影响,提高活性成分的稳定性,保护活性部位,有效减少药物的添加量和毒副作用;
(3)制备得到的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒,纳米粒子尺寸小,粒径在100-300nm之间,能显著增加纳米颗粒对组织的附着力;
(4)制备得到的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒,具有明显的葡萄糖响应性,当血糖升高时,装载的胰岛素会被释放出来,降低血糖浓度。
附图说明
图1为实施例1伴刀豆球蛋白-淀粉混合物浊度图(伴刀豆球蛋白与淀粉比例为3:(0-10),氯化钠的浓度为0.120g/mL,pH为5.2,反应10min);
图2实施例1不同比例的伴刀豆球蛋白-淀粉混合物的PDI和粒径分布图(氯化钠的浓度为0.120g/mL,pH为5.2,反应10min);
图3实施例1不同比例的伴刀豆球蛋白-支链淀粉混合物的透射图(氯化钠的浓度为0.120g/mL,pH为5.2,反应10min);其中淀粉(A),伴刀豆球蛋白(B),3:1(C),3:2(D),3:4(E),3:6(F),3:8(G),3:10(H);
图4为实施例4伴刀豆球蛋白-支链淀粉混合物不同反应时间的浊度图(氯化钠的浓度为0.120g/mL,伴刀豆球蛋白-支链淀粉的比例为3:1,pH为5.2);
图5为实施例4伴刀豆球蛋白-支链淀粉混合物不同反应时间的透射图(氯化钠的浓度为0.120g/mL,伴刀豆球蛋白-支链淀粉的比例为3:1,pH为5.2),其中1min(A),5min(B),9min(C),10min(D),30min(E),60min(F);
图6为实施例2伴刀豆球蛋白-淀粉混合物在不同氯化钠浓度下的PDI和粒径分布图(伴刀豆球蛋白-支链淀粉的比例为3:1,pH为5.2,反应10min);
图7为实施例2伴刀豆球蛋白-淀粉混合物在不同氯化钠浓度下的透射图(伴刀豆球蛋白-支链淀粉的比例为3:1,pH为5.2,反应10min),其中0.013g/mL(A),0.040g/mL(B),0.067g/mL(C),0.094g/mL(D),0.120g/mL(E),0g/mL(F),(G)是(E)透析盐后的;
图8是实施例2伴刀豆球蛋白-淀粉混合物在不同pH下的PDI和粒径分布图(伴刀豆球蛋白-支链淀粉的比例为3:1,氯化钠的浓度为0.120g/mL,反应10min);
图9为实施例2伴刀豆球蛋白-淀粉混合物在不同pH下的透射图(伴刀豆球蛋白-支链淀粉的比例为3:1,氯化钠的浓度为0.120g/mL,反应10min),其中pH 3.2(A),4.2(B),5.6(C),7.0(D),8.9(E);
图10为实施例1葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的荧光谱图,其中伴刀豆球蛋白=3.0mg,支链淀粉 1→7分别为 0mg,1mg,2mg,4mg,6mg,8mg和 10mg;
图11为实施例1葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的同步荧光谱图,(A)Δλ=15nm,(B)Δλ=60nm。Δλ=15nm代表酪氨酸,Δλ=60nm代表色氨酸,其中伴刀豆球蛋白=3.0mg,支链淀粉 1→7分别为0mg,1mg,2mg,4mg,6mg,8mg和10mg;
图12为实施例1淀粉、伴刀豆球蛋白和葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的红外光谱图,1-10分别代表纳米颗粒分别由3mgConA和1mg,2mg,4mg,6mg,8mg,10mg支链淀粉组成;
图13为实施例1ConA分别在在醋酸缓冲溶液和含0.120g/mL氯化钠的醋酸缓冲液中和纳米颗粒分散体系在pH=5.2时的圆二色谱图;
图14为实施例5包埋胰岛素的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒分别在含0mg/mL,1mg/mL和3mg/mL葡萄糖的pH=7.4磷酸缓冲体系中的累积释放图。
具体实施方式
为了能够更加清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
如无特殊说明,实施例中所用试剂均通过常规商业渠道购得。
实施例1
按照如下步骤制备葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒:
纳米颗粒的制备:首先配制含氯化钠1.5mg/mL的伴刀豆球蛋白(ConA)乙酸缓冲溶液,调节其pH值为5.2,然后加入一定量的1mg/mL的糊化蜡质玉米淀粉乳,使最终氯化钠的浓度为0.120g/mL,在25℃下混合,以200rpm的转速不断搅拌反应10min,最后在真空度8Pa、-80℃下冻干50h得到冷冻干燥得到纳米颗粒。
实施例2
按照如下步骤制备葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒:
纳米颗粒的制备:首先配制含氯化钠的1.5mg/mL ConA乙酸缓冲溶液,调节其pH值为6.0,然后加入一定量的1mg/mL的糊化蜡质小麦淀粉乳,最终氯化钠的浓度为0.120g/mL,在25℃下混合,以300rpm的转速不断搅拌反应10min。最后在真空度10Pa、-60℃下冻干48h得到冷冻干燥得到纳米颗粒。
实施例3
按照如下步骤制备葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒:
纳米颗粒的制备:首先配制含氯化钠的1.5mg/mL ConA乙酸缓冲溶液,调节其pH值为6.5,然后加入一定量的10mg/mL的糊化糯性大米淀粉乳,最终氯化钠的浓度为0.094g/mL,在25℃下混合,以500rpm的转速不断搅拌反应10min。最后在5Pa、-60℃下冻干72h得到冷冻干燥得到纳米颗粒。
实施例4
按照如下步骤制备葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒:
纳米颗粒的制备:首先配制含氯化钠的1.5mg/mL ConA乙酸缓冲溶液,调节pH值为7.0,然后加入一定量的1mg/mL的糊化蜡质大米淀粉乳,最终氯化钠的浓度为0.067g/mL,在25℃下混合,以300rpm的转速不断搅拌反应60min;最后在10Pa、-60℃下冻干70h,得到冷冻干燥得到纳米颗粒。
实施例5
按照如下步骤制备包埋胰岛素的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒:
将实施例1制得的含氯化钠的1.5mg/mL ConA乙酸缓冲溶液中加入胰岛素,然后加入到1mg/mL的糊化蜡质玉米淀粉乳中,使最终氯化钠的浓度为0.120g/mL,室温下搅拌反应10min,最后在真空度8Pa、-80℃条件下冻干,得到包埋胰岛素的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒。
性能检测
1、对实施例1-4所制备的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒进行性能检测
(1)浊度检测:将实例1制得的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒悬浮液进行浊度的测定分析,如图1的浊度图表明,当伴刀豆球蛋白与支链淀粉比例为3:(0.25-1)时,两者的浊度是显著增加的,说明一定量的ConA与支链淀粉结合形成复合物。当伴刀豆球蛋白与支链淀粉比例为3:1.5时,浊度显著降低。继续增加支链淀粉的质量,浊度基本保持不变。
(2)双亲纳米颗粒的大小及形态
将实施例1制得的伴刀豆球蛋白-淀粉混合物分散在超纯水中测定激光动态光散射图,图2不同比例的伴刀豆球蛋白-淀粉混合物的PDI和粒径分布图(氯化钠的浓度为0.120g/mL,pH为5.2,反应10min);如图2可见,葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的粒径大小为241.10–292.20nm。PDI低于0.4,说明纳米颗粒具有比较窄的粒径分布。
将实施例1制得的伴刀豆球蛋白-淀粉生物聚合物纳米颗粒悬浮液,滴于带有碳支持膜的铜网上,再将铜网冷冻干燥测定。图3不同比例的伴刀豆球蛋白-支链淀粉混合物的透射图(氯化钠的浓度为0.120g/mL,pH为5.2,反应10min);其中淀粉(A)支链淀粉(B)伴刀豆球蛋白,3:1(C),3:2(D),3:4(E),3:6(F),3:8(G),3:10(H),如图3可见,支链淀粉为分支状,伴刀豆球蛋白为无定型,当加入伴刀豆球蛋白时,两者复合形成颗粒状,图3C粒径大约为100-300nm,从以上结果看到两者形成纳米结构。
图4和5分别为实施例4伴刀豆球蛋白-支链淀粉混合物不同反应时间的浊度图和透射图。
如图5可见,反应1min,伴刀豆球蛋白-支链淀粉纳米颗粒的粒径大小为500-700nm,继续增加反应时间至5min,粒径400-500nm,当反应9-10min时,粒径为100-300nm,再继续增加反应时间30-60min,粒径为250-500nm,这些结果表明反应10min时足以形成纳米颗粒,并具有比较好的分散性。
图6和7分别为实施例2伴刀豆球蛋白-粉混合物在不同氯化钠浓度下的PDI和粒径分布图和透射图。如图6可见,双亲纳米颗粒的粒径大小为284.50-329.45nm。氯化钠浓度为0.094–0.120g/mL时,粒径低于300nm,当氯化钠浓度为0.067g/mL,纳米颗粒粒径显著增加,表明盐使纳米颗粒出现聚集,以上结果表明,纳米颗粒的粒径受盐浓度的控制。同样图7也是类似规律。
图8和9分别为实施例2伴刀豆球蛋白-淀粉混合物在不同pH下的PDI和粒径分布图和透射图如图8所示,pH=3.2,4.2,5.6,7.0和8.9时,分别对应的粒径是804.10,688.25,326.45,796.80和﹥1000nm。pH=5.6时粒径最小。当为碱性条件下会出现沉淀,可能是由于ConA构象发生改变,造成ConA聚集。如图9可见,当pH=3.2,4.2和7.0时,纳米颗粒的粒径大小为200-500nm。当pH=5.6时,纳米颗粒为球状,粒径大约为100-300nm。
荧光谱图和同步荧光谱图
(1)将实施例1葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒悬浮液进行荧光光谱的测定。如图10所示,随着支链淀粉量的增加,ConA的荧光强度是降低的,说明ConA荧光淬灭,ConA和支链淀粉发生了相互作用。如图11为同步荧光光谱图,当Δλ=15nm,随着支链淀粉的质量从1mg-10mg,ConA的酪氨酸发生红移从268-270nm。当Δλ=60nm,ConA的色氨酸也发生红移从255.5nm到257.5nm。说明ConA和支链淀粉发生相互作用。红移说明酪氨酸和色氨酸的微环境发生改变,即疏水性降低,亲水性增加。故红移结果表明结合支链淀粉后的Con A的构象发生改变。我们相信蛋白是位于纳米颗粒的内部,ConA和亲水的支链淀粉作用后降低了疏水作用。
(2)红外光谱检测:将实施例1制得的双亲辛烯基琥珀酸短直链淀粉干粉以溴化钾为背景进行红外光谱分析,如图12的红外图谱表明,ConA的酰胺Ⅰ在1655cm-1处,随着支链淀粉含量的增加,强度逐渐降低至消失,说明C=O受支链淀粉的影响。ConA的酰胺Ⅱ发生转移从1525cm-1到1530cm-1,表明C-N和N-H受支链淀粉的影响。ConA的酰胺Ⅲ在1238cm-1,然而纳米颗粒的酰胺Ⅲ消失了,说明-NH2支链淀粉的影响。以上结果说明ConA和支链淀粉发生相互作用。
(3)圆二色谱图检测:将实施例1制得的纳米颗粒分散在缓冲体系中进行圆二色谱分析,如图13的圆二色谱图所示,ConA发生红移从222–225nm,说明伴刀豆球蛋白和支链淀粉发生了相互作用。
2、对实施例5所制备的包埋胰岛素的纳米颗粒进行性能检测:
(1)实施例5包埋胰岛素纳米颗粒的装载效率和载药量的测定
将实施例5制备的胰岛素纳米颗粒溶液,采用考马斯亮蓝法利用紫外分光光度计测定上层溶液中未包埋的胰岛素的吸光值,通过胰岛素的标准曲线测定出胰岛素的含量,从而计算出纳米颗粒的装载率和载药量。
表1
由表1可见纳米颗粒的装载效率接近70%,载药量高达17%。包埋胰岛素后,纳米颗粒的粒径从292.2增加到342.7nm。
(2)在血液环境中模拟葡萄糖响应型释放
取实施例5得到的包埋胰岛素的纳米颗粒干粉,溶解在pH为7.4(模拟血液环境)的分别含0,1和3mg/mL的1mol/L磷酸缓冲溶液中,于200rpm的磁力搅拌器中搅拌不同时间,通过胰岛素标准曲线,高速离心取上清液,用紫外分光光度计测定不同时间累计释放的胰岛素含量。图14为模拟血液环境中的缓释图,可见纳米颗粒具有非常显著葡萄糖响应型的效果,当葡萄糖浓度比较高时,胰岛素的释放量比较高,故可以达到治疗糖尿病的效果。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的制备工艺,其特征在于,包括以下步骤:配制含氯化钠的伴刀豆球蛋白(ConA)浓度为0.5-1.5mg/mL的乙酸缓冲溶液,加入一定量的浓度为1-10mg/mL的糊化淀粉乳,制得氯化钠浓度为0.013-0.120g/mL的悬浮液,在15-35℃下不断搅拌,反应1-60min,冷冻干燥得到纳米颗粒;
其中,所述乙酸缓冲液为pH为3.2-7.0、浓度0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液;所述糊化淀粉乳中所采用的淀粉为蜡质玉米淀粉、糯性大米淀粉、蜡质小麦淀粉的任意一种或几种。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的制备工艺,其特征在于,所述糊化淀粉乳的配制采用pH为4-6的浓度为1mol/L磷酸缓冲液。
3.根据权利要求2所述的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的制备工艺,其特征在于,所述糊化淀粉乳在糊化前先去除淀粉中的直链淀粉。
4.根据权利要求1所述的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的制备工艺,其特征在于,所述搅拌的转速为200-500rpm。
5.根据权利要求4所述的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的制备工艺,其特征在于,所述冻干工艺为真空度5-10Pa,温度-80--60℃,时间48-72h。
6.一种包埋胰岛素的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:在ConA乙酸缓冲溶液中加入胰岛素,所述乙酸缓冲液为pH为3.2-7.0、浓度0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液,然后加入到1mg/mL的糊化蜡质玉米淀粉乳中,使最终氯化钠的浓度为0.120g/mL,室温下搅拌反应10min,最后在真空度 8Pa、-80℃条件下冻干,得到包埋胰岛素的葡萄糖响应型的伴刀豆球蛋白-淀粉纳米颗粒。
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CN101745114A (zh) * | 2009-12-25 | 2010-06-23 | 浙江工业大学 | 一种对葡萄糖敏感可自控释胰岛素的生物材料的制备方法 |
CN103191437A (zh) * | 2013-03-05 | 2013-07-10 | 常州大学 | 一种葡萄糖响应性药物控释载体的制备方法 |
CN104337795A (zh) * | 2014-09-15 | 2015-02-11 | 青岛农业大学 | 一种蜡质玉米淀粉纳米颗粒-胰岛素缓释胶囊的制备方法 |
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2017
- 2017-02-23 CN CN201710102976.3A patent/CN106937948B/zh active Active
Patent Citations (3)
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CN101745114A (zh) * | 2009-12-25 | 2010-06-23 | 浙江工业大学 | 一种对葡萄糖敏感可自控释胰岛素的生物材料的制备方法 |
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Title |
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Preparation and Characterization of Glycoprotein-Resistant Starch Complex As a Coating Material for Oral Bioadhesive Microparticles for Colon-Targeted Polypeptide Delivery;Wenbei Situ et al;《Agricultural and Food Chemistry》;20150411;第63卷;第4138-4147页 |
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测定直链淀粉含量的几种新方法;郭星等;《粮油加工与食品机械》;20061231(第4期);第87-89页 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN106937948A (zh) | 2017-07-11 |
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