CN106924213B - 莱菔素微囊剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种莱菔素微囊剂及其制备方法，所述制备方法以莱菔素或其衍生物为芯材，以预处理的环糊精或环糊精衍生物为壁材。本发明首先采用应用分子动力学模拟技术锁定适用于莱菔素包埋的壁材原料；进一步，通过冷却淬火手段对壁材进行微改性，从而大大改善包封材料的比表面积，提高对药物的包埋率，使其更适用于莱菔素的包封。此外,根据莱菔素及其衍生物在弱酸环境下分解受抑制而环糊精及其衍生物在弱酸环境下较稳定等特点,在制备工艺中我们选用本领域罕用的弱酸性环境制剂，并获得性能良好的莱菔素微囊制剂。

Description

莱菔素微囊剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域及高分子材料领域。具体地,本发明涉及一种莱菔素及其衍生物包封稳定剂的制备方法及应用。

背景技术

莱菔素(英文名:Sulforaphene；分子式:C₆H₉NOS₂；结构如下式LFS-01所示)，是一类异硫氰酸酯类化合物，是古老中药莱菔子的主要有效单体化学成分。既往的研究中,我们曾意外发现，莱菔素及衍生物可以作为XPO1蛋白抑制剂类药物有效地用于肿瘤、自身免疫系统疾病如炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、红斑狼疮、病毒感染、神经系统疾病等疾病的治疗(CN104710337A)，且生物安全度极好、对正常细胞几乎没有任何毒性,具有巨大的潜在临床应用价值。

然而，由于莱菔素及其衍生物含有亲电性的异硫氰酸酯结构，在光照、高温等环境条件下不稳定，不利于长期存储，限制了对其的进一步研究及临床应用。本领域中，研究者已经开始尝试多种措施来提高莱菔素的稳定性，比如微胶囊化等。现有技术中记载了一些相关技术,例如CN104720072A。所使用的包封材料一般是微囊技术领域常用材料，例如聚乙二醇(PEG)、植物油等。然而，在我们的应用实践中发现，使用常规的包封材料和方法制备微囊化莱菔素不仅工艺复杂、生产成本高，并且包封效果常常达不到预期，所得的产品稳定剂水溶性差，不利于临床上口服应用。因此，需要考虑对技术及材料进行改进，以使其更能适用于莱菔素的包封及应用。

环糊精是微囊制剂领域常用的包封材料。环糊精是由6个及6个以上的吡喃葡萄糖分子形成的环状低聚糖的总称，常见的环糊精有α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精3种，组成它们的吡喃葡萄糖分子数为分别为6、7、8。比较三种常见环糊精的空腔内径，α-环糊精的分子空腔内径约为

β-环糊精的分子空腔内径约为

而γ-环糊精的分子空腔内径约为

环糊精的水溶性较好且生物安全度很高。将药物用环糊精包埋可以增加药物的溶解性,提高药物的生物利用度。除此之外还可以增加药物稳定性、掩盖药物的不良气味,降低某些药物的刺激性或毒副作用,调节药物释药速率,促进药物经黏膜吸收等。目前，环糊精及其衍生物已被世界上一些国家如美国、日本及欧盟的药监局批准用于药物或食品的包埋辅料。

我们在研究中应用了分子动力学模拟技术(Molecular Dynamics Simulation,简称MD技术)以及结合自由能计算技术(Free Energy Calculation)，预测了三种环糊精分子均可用于包封莱菔素及其衍生物分子，且α-环糊精包封莱菔素或其衍生物的结合自由能更好、稳定性更高，可以有效的保护并稳定莱菔素或其衍生物分子，非常适合于临床应用。本发明便是围绕此展开。

发明内容

本发明旨在克服莱菔素及其衍生物在光照、高温等环境条件下不稳定的缺点，提供一种稳定包封莱菔素的方法，并提供相应所得到的莱菔素微囊制剂，以改善莱菔素及其衍生物的口服活性，并使其更加适于长期储存及临床应用。

本发明首先提供一种莱菔素微囊剂的制被方法，是以莱菔素或其衍生物为芯材，以环糊精或环糊精衍生物为壁材，包括如下步骤：将芯材母液加入至壁材母液中，混合均匀并超声搅拌至透明，然后将混合溶液缓慢分散至有机酸的缓冲液中，超声搅拌制得分散体系I；继而使用干燥法将所制备的分散体系I制成微球粉末。

当然，本发明的目的也在于提供通过上述方法制备的莱菔素微囊剂。

本发明中，首先采用应用分子动力学模拟技术锁定适用于莱菔素包埋的壁材原料；并且根据莱菔素及其衍生物在弱酸环境下分解受抑制而环糊精及其衍生物在弱酸环境下较稳定等特点,在制备工艺中我们选用本领域罕用的弱酸性环境制剂，并获得性能良好的莱菔素微囊制剂。并在进一步方案中，通过冷却淬火手段对壁材进行微改性，从而大大改善包封材料的比表面积，提高对药物的包埋率，使其更适用于莱菔素的包封。

附图说明

本发明附图7幅：

图1是利用分子动力学模拟技术模拟α-环糊精包封莱菔素的复合物结构示意图。图中α-环糊精用CPK模型来表示，莱菔素用球棍模型表示。复合物结构经过了1μs(微秒)的分子动力学模拟计算。

图2是莱菔素微囊剂CD-LFS-01的¹H-NMR核磁氢谱图。

图3是莱菔素微囊剂CD-LFS-01的FTIR红外谱图。

图4是莱菔素微囊剂CD-LFS-01的扫描电镜(SEM)谱图。

图5是炎症性肠病(IBD)动物模型给药实验的效果图。其中control组为对照组；DSS组为炎症性肠病的造模组；CD-LFS-01为本发明的莱菔素微囊剂口服治疗组；5-AA为临床治疗IBD药物5-氨基水杨酸的口服治疗组。

图6是利用本发明的莱菔素微囊剂治疗炎症性肠病的动物结肠免疫组化(H&E)切片效果图。

图7是炎症性肠病(IBD)动物模型给药实验的疾病活动指数(DAI)评分图。

具体实施方式

本发明之初衷在于提供一种莱菔素及其衍生物的微囊制剂。所述的莱菔素微囊剂的制备方法，是以莱菔素或其衍生物为芯材，以环糊精或环糊精衍生物为壁材，包括如下步骤：将芯材母液加入至壁材母液中，混合均匀并超声搅拌至透明，然后将混合溶液缓慢分散至有机酸的缓冲液中，超声搅拌制得分散体系I；继而使用干燥法将所制备的分散体系I制成微球粉末。

本发明中，首先采用应用分子动力学模拟技术锁定适用于莱菔素包埋的壁材原料；并且根据莱菔素及其衍生物在弱酸环境下分解受抑制而环糊精及其衍生物在弱酸环境下较稳定等特点,在制备工艺中我们选用本领域罕用的弱酸性环境制剂，获得性能良好的莱菔素微囊制剂。

为了获得性能更加优良的产品，进一步优化方案中，通过冷却淬火手段对壁材进行微改性，从而大大改善包封材料的比表面积，提高对药物的包埋率，使其更适用于莱菔素的包封。具体的技术方案是：所述的壁材是经过预处理，所述预处理的方法是：将环糊精或环糊精衍生物加热至130℃以上后自然冷却，待降温至100±10℃时，投入常温的去离子水中迅速冷却。

更为具体地，本发明所述的莱菔素微囊剂的制备方法，以莱菔素或其衍生物为芯材，以预处理的环糊精或环糊精衍生物为壁材，包括如下步骤：

(1)将环糊精或环糊精衍生物加热至130℃以上后自然冷却，待降温至100±10℃时，投入常温的去离子水中迅速冷却得改性壁材；

(2)将改性壁材的水溶液于超声条件下搅拌直至成为透明的壁材母液；

(3)将芯材溶解于有机溶剂的水溶液中，制得芯材母液；

该步骤中所述的有机溶剂选自乙醇、丙醇、丁二醇、甲酸、乙酸、乳酸、丙酮、二甲基亚砜或其混合物。优选乙醇、乙酸、乳酸、丙酮或其混合物。

(4)将芯材母液加入至壁材母液中，混合均匀并超声搅拌至透明，然后将混合溶液缓慢分散至有机酸的缓冲液中，超声搅拌制得分散体系I；

上述缓冲液pH值2.0～6.5。优选为pH值4.0～6.0的缓冲液。

其中所述的有机酸包括但不限于柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸的一种。优选柠檬酸。

更为具体的实施方式中，步混合溶液与缓冲液的体积比为1:1～1:10。优选1:2～1:5。

(5)使用干燥法将所制备的分散体系I制成微球粉末；

根据现有技术，干燥法可选自真空干燥法、冷冻干燥法、自然干燥法、喷雾干燥法。优选为冷冻干燥法或喷雾干燥法。特别优选为冷冻干燥法。

容易理解，上述制备方法中所述及的莱菔素或其衍生物包括莱菔素及其可药用衍生物，还应当包括这些化合物的所有同分异构体。包括但不限于每一种结构式的对映异构体、非对映异构体；以及针对每一个不对称中心的R与S构型的化合物，Z与E双键异构体以及Z与E构象异构体的化合物。作为具体的举例，上述莱菔素的及其衍生物包括但不限于CN104710337A和CN104725291A中所公开的全部化合物。

在上述本发明的制备方法中，对环糊精或环糊精衍生物的加热猝火预处理的步骤是非常规的，并且在改善包埋材料的性能上带来异常优异的效果，尤其是针对本发明中优选使用的包埋材料α-环糊精。具体实施方式中，对壁材进行加热温度最优选为150±10℃。

环糊精或环糊精衍生物都可以作为本发明中制备莱菔素微囊制剂的壁材材料，包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精以及它们的可药用衍生物。这其中所述及的环糊精衍生物包括被羟乙基、羟丙基、甲基、葡萄糖、麦芽糖、羧甲基、磺烷基等单取代或多取代的环糊精。可举例但不限于羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、二羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、葡萄糖-环糊精、麦芽糖-环糊精、麦芽三糖-环糊精、羧甲基-环糊精、磺烷基-环糊精。

进一步结合预处理手段对壁材改性效果的考虑，又尤其优选经改性的α-环糊精及其衍生物作为制备微囊制剂的壁材。

壁材与芯材的比例，以及壁材母液、芯材母液的制备，本领域技术人员可以根据现有技术进行操作。本发明中壁材与芯材的质量比优选使用10:3～10:1。

上述本发明的莱菔素微囊制剂的制备方法更为优选的实施方式，还包括稳定剂的使用，具体是：向步骤(4)所制得的分散体系I中按照质量比例加入0.5-2％的稳定剂，超声搅拌制得分散体系II，然后再使用干燥法将所制备的分散体系II制成微球粉末，为本发明的目标产品莱菔素微囊制剂。

其中的稳定剂是酸性稳定剂，包括但不限于甘醇酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸或其组合物。优选柠檬酸、酒石酸、乳酸或其组合物。酸性稳定剂的使用也是本发明中无启示于现有技术并带来异常优异技术效果的特征之一。可以显著增加包埋复合物的稳定性。

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例应用分子动力学模拟技术(Molecular Dynamics Simulation,MD)以及自由能计算的方法来测定环糊精包封莱菔素(LFS-01)的稳定性(stability)以及α-环糊精(α-CD)和β-环糊精(β-CD)包埋莱菔素的稳定性差异。将莱菔素分子置于参测环糊精材料的Primary-Rim或者Secondary-Rim外2nm左右，利用分子动力学模拟工具Gromacs模拟底物莱菔素分子自行进入环糊精空腔的过程。利用长时分子动力学模拟进行1μs(微秒)后，利用MM/PBSA的方法计算环糊精与底物莱菔素的结合自由能，从能量角度判断环糊精包封的稳定性以及α-环糊精和β-环糊精包封的稳定性差异，结果如下表所示。

表1：α-环糊精和β-环糊精包封莱菔素的稳定性差异测试

参测材料	ΔE<sub>Coul</sub>(kJ/mol)	ΔE<sub>LJ</sub>(kJ/mol)	ΔE(kJ/mol)
				α-CD	-10.096	-86.088	-96.184
β-CD	-7.736	-73.930	-81.666

从测试结果来看，α-环糊精更适宜用于莱菔素的包埋,α-环糊精包埋莱菔素的模拟效果具体见附图1。

实施例2

制备莱菔素微囊剂CD-LFS-01：

(1)常温常压环境下,称取1mmol的α-环糊精973mg，加热到150℃，然后在室温条件下自然降温，待温度降至100℃时，迅速投入至100ml的室温去离子水中进行冷却淬火处理，并超声搅拌至溶液均匀透明。

(2)同时称取1mmol的莱菔素175mg(命名代号为LFS-01)，用1ml的60％(v/v)乙醇-水溶液溶解。

(3)将(2)所得的溶液缓慢滴加到(1)所制备的环糊精溶液中,搅拌至透明；

(4)将(3)所得的透明混合液缓慢分散至pH4.0的柠檬酸缓冲溶液中，得分散体系I-1；

(5)向分散体系I-1中按照质量百分比加入2％的酒石酸,进一步超声搅拌制得稳定分散体系II-1。室温下超声搅拌24小时,之后冷冻干燥，得到莱菔素微囊剂CD-LFS-01。

CD-LFS-01为粒径均匀的微囊颗粒。对莱菔素微囊剂CD-LFS-01进行核磁、红外及电镜检测，结果分别如附图2、3和4所示。

从图2(¹H-NMR核磁氢谱图)可见,环糊精与莱菔素复合物的谱图中环糊精与莱菔素的特征化学位移均发生了一定的变化，证明环糊精与莱菔素之间存在分子间相互作用。

从图3(FTIR红外)可见，本发明制备的莱菔素微囊剂CD-LFS-01复合物的吸收峰与CD/LFS混合物显著不同，最明显在2200cm^-1吸收波长附近,CD-LFS-01复合物的吸收峰显著弱于CD/LFS混合物，证明CD-LFS-01复合物中莱菔素与环糊精形成了较好的氢键相互作用。证明本发明中α-环糊精对莱菔素起到了良好的稳定包封效果。

实施例3

制备莱菔素微囊剂CD-LFS-02：

(1)常温常压环境下,称取1mmol的α-环糊精973mg，超声搅拌至溶液均匀透明。

(2)同时称取1mmol的莱菔素175mg(命名代号为LFS-01)，用1ml的60％(v/v)乙醇-水溶液溶解。

(3)将(2)所得的溶液缓慢滴加到(1)所制备的环糊精溶液中,搅拌至透明；

(4)将(3)所得的透明混合液缓慢分散至pH4.0的柠檬酸缓冲溶液中，得分散体系I-1；

(5)向分散体系I-1中按照质量百分比2％加入酒石酸,进一步超声搅拌制得稳定分散体系II-1。室温下超声搅拌24小时,之后冷冻干燥，得到莱菔素微囊剂CD-LFS-02。

实施例4

制备莱菔素微囊剂CD-LFS-03：

(1)常温常压环境下,称取1mmol的α-环糊精973mg，加热到150℃，然后在室温条件下自然降温，待温度降至100℃时，迅速投入至100ml的室温去离子水中进行冷却淬火处理，并超声搅拌至溶液均匀透明。

(2)同时称取1mmol的莱菔素175mg，用1ml的60％(v/v)乙醇-水溶液溶解。

(3)将(2)所得的溶液缓慢滴加到(1)所制备的环糊精溶液中,搅拌至透明；

(4)将(3)所得的混合液分散至pH4.0的柠檬酸缓冲溶液中，得分散体系I-1；

(5)将(4)所得的分散液在室温下超声搅拌24小时,之后冷冻干燥，得到莱菔素微囊剂CD-LFS-03。

实施例5

本实施例的目的在于比较常规包埋方法处理的环糊精包封稳定剂与经过冷却淬火处理的环糊精包封稳定剂的比表面积的差别。具体结果见表2。可见冷却淬火处理的环糊精比表面积更大，更有利于包封稳定药物。

表2：利用透射电镜计算不同包封方法的比表面积(m²/g)。

实验组别	样品名称	溶剂	比表面积(m<sup>2</sup>/g)
				常规方法	CD-LFS-02	去离子水	85
冷却淬火方法	CD-LFS-01	去离子水	150

实施例6

本实施例在于比较本发明的莱菔素微囊剂CD-LFS-01与其他药物包埋材料包封的莱菔素制剂的效果。

本研究采用聚乙二醇(PEG400)、壳聚糖这二种常见药物包埋材料作为对照。先将莱菔素分别溶解于PEG400溶液、壳聚糖溶液以及α-环糊精溶液中,超声搅拌至溶液均匀透明,分装于5ml的密闭的样品瓶中，放置在60℃高温环境中储存30天,每5天取样,利用高效液相色谱检测莱菔素的含量。如样品含量测定发生5％以上的变化，则证明包埋效果不理想；反之，则证明包埋效果较好，样品无显著变化。

表3.各种药物包埋材料的包埋效果比较。

包埋材料	含量变化测定
		PEG400	>5％
壳聚糖	>5％
		α-环糊精(CD-LFS-01)	无显著变化(～1.0％)
α-环糊精(CD-LFS-03)	无显著变化(～2.5％)

研究结果表明,与常用的药物包埋材料相比，本发明的莱菔素微囊剂CD-LFS-01更加稳定，专一性更强。此外，与未添加酸性药物稳定剂的产品CD-LFS-03相比，添加酸性药物稳定剂后的产品CD-LFS-01的稳定性也更好。

实施例7

在临床应用中,药物包封体系应在整个货架期保持稳定,故有必要测定其长期储存时的稳定性。本实施例的目的即在于检测不同的莱菔素/环糊精微囊剂的长期储存稳定性。

本发明制备的莱菔素微囊剂(CD-LFS-01)在25℃环境中储存40天后,进行莱菔素的含量检测，含量变化小于5％。这说明，经过40天的常温储存，纳米微球仍然具有较好的储存稳定性。我们将纳米颗粒分散液经冷冻干燥后重新分散在水中,发现干燥后的纳米颗粒具有优良的重分散性。

实施例8

3％葡聚糖硫酸酯钠(DSS)诱发的动物模型是最经典的炎症性肠病(IBD)模型之一。本研究用于评价基于α-环糊精的莱菔素包封稳定剂对葡聚糖硫酸酯钠(DSS)诱导的炎症性肠病模型的药效。SPF级别的C57BL/6J小鼠40只,雌雄各半,体重20～25克。购于辽宁省长生实验动物公司、自由进食饮水。将小鼠随机分为空白组、模型对照组、莱菔素微囊剂CD-LFS-01给药组(80mg/kg)、临床常用药物5-氨基水杨酸(5-AA)给药组(80mg/kg),共4组，10只/组。除空白组外，其他各组动物每天饮用5％葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液，连续7天，建立溃疡性结肠炎模型。在给予3％DSS饮用水的第2天开始给予药物治疗。从DSS的摄取开始第8天将小鼠通过利用乙醚进行的深度麻醉下处死。已有文献报道,DSS诱导IBD模型的重要病理特征之一是结肠长度缩短,参见文献:[Nat Protoc.2007；2(3):541-6.]通过卡尺测定摘取的从结肠到肛门的组织长度,结果见表4以及附图5、6和7所示。

表4.莱菔素微囊剂CD-LFS-01对IBD动物模型的治疗效果。

从图5可见：DSS炎症性肠病的造模组的动物结肠明显缩短,并有严重的溃疡、出血症状,而莱菔素的α-环糊精稳定包封剂口服治疗后,动物结肠长度恢复，粪便形状恢复正常,溃疡、出血等症状也被逆转，与之相比,临床治疗IBD药物5-氨基水杨酸的口服治疗组的动物仍然有溃疡、出血等症状。

从图6可见：DSS炎症性肠病的造模组的动物结肠上皮屏障破坏严重，出现了炎性细胞浸润；而莱菔素的α-环糊精稳定包封剂口服治疗后，动物结肠上皮屏障恢复；与之相比,临床治疗IBD药物5-氨基水杨酸的口服治疗组的动物结肠上皮屏障并未恢复。

由图7可见：与对照组相比,DSS炎症性肠病的造模组的疾病活动指数明显升高；而莱菔素的α-环糊精稳定包封剂口服治疗后,动物的疾病活动指数明显恢复到接近正常水平；而5-氨基水杨酸的口服治疗组的疾病活动指数仅有轻微的恢复。

由此可见，本发明的莱菔素微囊剂可以有效的逆转DSS诱导IBD模型大肠长度的缩短，恢复的程度接近空白组。此外，与炎症性肠病临床常用治疗药物5-氨基水杨酸(5-AA)相比，CD-LFS-01治疗组的结肠组织基本恢复到正常、粪便也恢复正常，而5-AA治疗组的结肠组织仍然有溃疡现象、粪便不正常，证明CD-LFS-01的治疗效果全面优于一线的IBD治疗药物。此外，该实验证明莱菔素包封稳定剂对于IBD具有良好的肠道靶向治疗效果，表明莱菔素包封稳定剂具有良好的临床发展潜力。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (5)

1.一种莱菔素微囊剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将α-环糊精加热至150±10℃后自然冷却，待降温至100±10℃时，投入常温的去离子水中迅速冷却得改性壁材；

(2)将改性壁材的水溶液于超声条件下搅拌直至成为透明的壁材母液；

(3)将芯材溶解于有机溶剂的水溶液中，制得芯材母液；所述芯材是莱菔素；

(4)将芯材母液加入至壁材母液中，混合均匀并超声搅拌至透明，然后将混合溶液缓慢分散至有机酸的缓冲液中，超声搅拌制得分散体系I；

(5)使用干燥法将所制备的分散体系I制成微囊剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)的有机溶剂选自乙醇、丙醇、丁二醇、甲酸、乙酸、乳酸、丙酮、二甲基亚砜或其混合物。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的缓冲液pH值2.0～6.5。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中混合溶液与缓冲液的体积比为1:1～1:10。

5.根据权利要求1所述的方法制备的莱菔素微囊剂。

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