CN106916878A - 与谷子生育期基因紧密连锁的分子标记SVhd2 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，具体地，涉及一种与谷子生育期基因紧密连锁的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者其为谷子基因组中含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段。本发明还涉及该分子标记的引物、该分子标记在谷子生育期基因定位或谷子遗传育种中的用途、一种谷子生育期基因定位方法、以及一种谷子育种方法。本发明发现了与谷子生育期基因紧密连锁的分子标记SVhd2，将谷子基因组DNA序列与谷子生育期基因联系起来，更有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立。

Description

与谷子生育期基因紧密连锁的分子标记SVhd2

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，具体地，涉及一种与谷子生育期基因紧密连锁的分子标记。本发明还涉及该分子标记的引物、该分子标记在谷子生育期基因定位或谷子遗传育种中的用途、一种谷子生育期基因定位方法、以及一种谷子育种方法。

背景技术

谷子起源于中国，是传统的优势作物、主食作物和抗旱耐瘠作物。谷子抗旱耐瘠、水份利用效率高、适应性广，不仅在目前旱作生态农业中有重要作用，而且针对日益严重的水资源短缺，谷子还是重要的战略储备作物。谷子去壳后的小米营养丰富且各种成分平衡，是具有营养保健作用的粮食作物，对人体有重要作用的食用粗纤维是大米的5倍，是近年来兴起的世界性杂粮热的主要作物。同时谷子秸秆粗蛋白含量在8％左右，饲草谷子秸秆粗蛋白含量在15％以上，是禾本科中最优质的饲草，在畜牧业发展中有重要作用。

因此，加速谷子育种进程尤为重要。由于谷子属于小粟类作物，在遗传理论研究方面落后于玉米、小麦、谷子等禾谷类作物。如何应用先进科学的研究手段指导谷子育种是一个严峻的问题。随着分子生物学的发展，分子标记技术的出现，为谷子的遗传研究及育种开辟了新的思路和方法。开发与重要性状基因紧密连锁的分子标记并进行分子标记辅助选择育种，能显著提高我国谷子育种水平。

谷子生育期与品种及产量密切相关。但目前还没有文献报道谷子生育期相关基因的定位研究。

发明内容

本发明人依据全基因组序列，经过大量的实验和不懈的努力，提供了一种与谷子(Setaria italica L.Beauv.)生育期基因紧密连锁的分子标记SVhd2，并由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种与谷子生育期基因紧密连锁的分子标记SVhd2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

283 bp：

GTTACAGCACTGTAGCACACTGTAGCGTTTCGTTTGTATTTGTGAATTATTGTCCAAATATTAACTAATTAGGCTCAAAAGATTCGTCTCGTAAAGTACAACAAAACTGTACAATTACTTTTTAATTTCATCTACATTTAGTACTCCATACATGTACCGCAAGTTTGATGTGATAGGGAATCTTCTTTTTGCATAGTGTCAAAGTTGGAAGTTGGGAGTAACTAAACATGGCCTTGGTGTGGCTGAGGAGCAGTGCTTTTGTGCGCCTTCCTTTGCATCTTCT(SEQ ID NO：1)

在本发明中，术语“与谷子生育期基因紧密连锁的分子标记”是指这样的分子标记，在遗传连锁图谱中，该分子标记与谷子抗除草剂基因的遗传连锁距离小于2cM或者小于3cM。

本发明的还一方面涉及本发明的分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示：

正向引物：TGGACTTAGCGCACGACTCT(SEQ ID NO：2)

反向引物：CATGAAGCATCAGTGTGAAG(SEQ ID NO：3)

本发明的分子标记也可以为含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段；该DNA片段的长度为适当长度，但并不特别限定，例如，小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。

在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段)为谷子基因组中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因组中的序列，优选地，为谷子基因组中SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测谷子基因组DNA中的该分子标记，必然能够在长生育期谷子中检测或扩增得到含有SEQ ID NO：1所示的序列，或者在短生育期谷子中不能检测或扩增得到含有SEQ ID NO：1所示的序列。SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。

在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端可操作地连接有人工序列和/或控制序列，例如启动子、增强子、终止子、酶切位点、引物序列等等。其中，术语“可操作地”在本发明中定义为一种如下构象，在该构象中，控制序列例如启动子被适当地置于SEQ ID NO：1的一个位置上，以致该控制序列指导SEQ ID NO：1编码的多肽的产生。

本发明的另一方面涉及一种重组载体，其含有本发明的分子标记。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。本发明的还一方面涉及一种重组细胞，其含有该重组载体。

本发明的还一方面涉及本发明的分子标记的制备方法，包括下述步骤：使用长生育期谷子的基因组DNA作为模板，以上述引物进行PCR扩增，得到的扩增产物即含有所述分子标记；优选地，还包括将PCR扩增产物进行纯化的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述长生育期谷子为WD-2(晚熟，长生育期，116天)。

对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的分子标记。

本发明的还一方面涉及所述分子标记的检测方法，包括下述步骤：

(1)根据本发明的分子标记的核苷酸序列设计引物；

(2)以被检测谷子的基因组DNA作为模板进行扩增；

(3)判断扩增产物中是否存在该分子标记。

例如，可以以被检测谷子的基因组DNA为模板，以上述引物(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)进行PCR扩增，得到扩增产物。可以将得到的扩增产物进行测序或者凝胶电泳。

本发明的还一方面涉及本发明的分子标记在谷子生育期基因定位或检测中的用途。

本发明的还一方面涉及一种谷子生育期基因定位的方法，包括使用本发明的分子标记的步骤。

本发明的还一方面涉及本发明的分子标记在谷子辅助育种中的用途。

本发明的还一方面涉及一种谷子辅助育种方法，包括检测本发明的分子标记的步骤。

本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选长生育期或短生育期的谷子。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的分子标记引物。所述检测还可以通过测序方法进行。该谷子辅助育种方法具有简便、快速、高通量的优点。

发明的有益效果

本发明提供了与谷子生育期基因紧密连锁的分子标记，并将谷子基因组DNA与谷子生育期基因联系起来，更有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立；所述分子标记与生育期基因的遗传紧密连锁距离为1.5cM。本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于谷子辅助育种。

附图说明

图1：分子标记引物(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)对215个重组自交系RIL株系(F6代)单株扩增的部分结果。其中：

泳道1－5为RIL株系中长生育期单株的PCR扩增产物；泳道7－11为RIL株系中短生育期单株的PCR扩增产物。泳道6为marker，其分子量包括：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、以及100bp。结果显示：RIL株系中长生育期单株扩增产物条带为593bp，RIL株系中短生育期单株扩增产物条带为310bp。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器、材料未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：谷子RIL群体的构建

父本：宁夏早谷，早熟(短生育期，104天)。母本：乌当2号(WD-2)，晚熟(长生育期，116天)。父本和母本杂交得到F1，F1代通过单粒传法得到215个重组自交系RIL株系(F6代)。宁夏早谷和WD-2可以从深圳华大农业与循环经济科技有限公司购得。

实施例2：基因组DNA的提取

针对实施例1中获得的谷子RIL群体，用CTAB法分别提取父母本及RIL群体单株的基因组DNA，具体方法如下：

(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。

其中1.5×CTAB配方如下(1L)：

CTAB	15g
		1mol/L的Tris.Cl(pH为8.0)	75mL
0.5mol/L的EDTA	30mL
		NaCl	61.4g

加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。

(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。

(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。

(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入200μL TE溶解DNA。

(5)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA。

(6)将得到的父母本及RIL群体单株的基因组DNA存于-20℃备用。

实施例3：基因定位和分子标记开发

(1)遗传图谱构建

针对实施例2中获得的RIL个体的基因组DNA，基于RAD-seq的基因分型技术(http://www.bioon.com.cn/server/show_product.asp？id＝12291)对RIL群体的个体进行基因分型，获得RIL群体的基因型数据。

用MapMaker 3.0软件(Constructing genetic maps withMAPMAKER/EXP 3.0，S Lincoln,M Daly,E Lander-Cambridge,MA:Whitehead Institute,1992，通过参照将其全文并入本文)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。

(2)基因定位

针对实施例1中获得的RIL群体，将RIL群体的个体表型，与父本型性状相似的记为a，与母本型性状相似的记为b，性状居于父本和母本之间的记为h。得到全部个体的表型数据，将个体的表型数据与之前得到的基因型数据进行比较，从而将谷子生育期基因定位在遗传连锁图谱上。结果显示，谷子生育期基因定位在2号染色体39053453bp至39098769bp区间内，长度约为45316bp。

(3)分子标记开发

将父本和母本分别进行全基因组重测序(10X)，然后根据RAD-seq的测序结果，利用SOAP软件比对测序reads，然后用SOAPsv寻找父母本基因组片段差异较大的分子标记，便于用凝胶电泳区分鉴别。

结果，选择靠近谷子生育期基因所在区段的标记SVhd2(SEQID NO：1所示的核酸序列)作为候选。

SVhd2的核苷酸序列如下(283bp)：

GTTACAGCACTGTAGCACACTGTAGCGTTTCGTTTGTATTTGTGAATTATTGTCCAAATATTAACTAATTAGGCTCAAAAGATTCGTCTCGTAAAGTACAACAAAACTGTACAATTACTTTTTAATTTCATCTACATTTAGTACTCCATACATGTACCGCAAGTTTGATGTGATAGGGAATCTTCTTTTTGCATAGTGTCAAAGTTGGAAGTTGGGAGTAACTAAACATGGCCTTGGTGTGGCTGAGGAGCAGTGCTTTTGTGCGCCTTCCTTTGCATCTTCT(SEQ ID NO：1)。

实施例4：分子标记的生育期相关性验证

对实施例3中确定的谷子生育期相关分子标记SVhd2(SEQ IDNO：1所示的核酸序列)进行验证，具体如下：

针对上述分子标记设计引物，引物序列如下所示：

正向引物：5’-TGGACTTAGCGCACGACTCT-3’(SEQ ID NO：2)；

反向引物：5’-CATGAAGCATCAGTGTGAAG-3’(SEQ ID NO：3)。

利用上述引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来验证该标记的多态性和扩增稳定性。

具体地，以实施例2中提取的父本、母本、RIL群体单株的基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，其中，

PCR反应体系如下：

无菌水	20.2μl
			2.5μl
dNTPs(25mM)	0.15μl
		Taq酶(5U/μl)	0.15μl
正向引物(10μM)	0.5μl
		反向引物(10μM)	0.5μl
模板	1.0μl
		总体积	25μl

PCR反应程序如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物经纯化后于4℃下保存。

接着，将各PCR扩增产物取部分进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。如图1所示，长生育期的单株均扩增出593bp的条带，短生育期的单株均扩增出310bp的条带。由此，证明该分子标记SVhd2(SEQ ID NO：1所示的核酸序列)在父母本之间具有多态性，该分子标记与谷子生育期性状紧密连锁。

然后，利用3730测序仪对各扩增产物进行测序，结果显示，母本及RIL群体中长生育期单株扩增产物为593bp，其序列如SEQID NO：4所示：

TGGACTTAGCGCACGACTCTTGGTGGGGTTCGTCAGCCATGGCAGGAGCAGGACAATGCTGCGTGCCATCAGAGATTCTGCAGGCACCATCCTGCTTTCTCTTATCCTTTGCTTGGACCTTTAGTTGGCCAATTTGGGAGGTGCCAAATTACTGTTACAGCACTGTAGCACA CTGTAGCGTTTCGTTTGTATTTGTGAATTATTGTCCAAATATTAACTAATTAGGCTCAA AAGATTCGTCTCGTAAAGTACAACAAAACTGTACAATTACTTTTTAATTTCATCTACAT TTAGTACTCCATACATGTACCGCAAGTTTGATGTGATAGGGAATCTTCTTTTTGCATAG TGTCAAAGTTGGAAGTTGGGAGTAACTAAACATGGCCTTGGTGTGGCTGAGGAGCAGTG CTTTTGTGCGCCTTCCTTTGCATCTTCTTTTGCTTTCTCTTGTGTGGTTCAGGTGAATCCTTTTGCCTCCTCATGCTTTATCTTCCTTCCTCGTAGTGCTTTGGCCTTCAGTTGGACTTGGGGCAGCGAGCAACGGCCCATCCGCCATATTCCCCATCCTTCACACTTCACACTGATGCTTCATG(SEQ ID NO：4)；

上述下划线序列即为本发明的分子标记SEQ ID NO：1。

父本及RIL群体中短生育期单株扩增产物为310bp，其序列如SEQ ID NO：5所示：

TGGACTTAGCGCACGACTCTTGGTGGGGTTCGTCAGCCATGGCAGGAGCAGGACAATGCTGCGTGCCATCAGAGATTCTGCAGGCACCATCCTGCTTTCTCTTATCCTTTGCTTGGACCTTTAGTTGGCCAATTTGGGAGGTGCCAAATTACTTTTGCTTTCTCTTGTGTGGTTCAGGTGAATCCTTTTGCCTCCTCATGCTTTATCTTCCTTCCTCGTAGTGCTTTGGCCTTCAGTTGGACTTGGGGCAGCGAGCAACGGCCCATCCGCCATATTCCCCATCCTTCACACTTCACACTGATGCTTCATG(SEQ ID NO：5)

母本及RIL群体中长生育期单株与父本及RIL群体中短生育期单株扩增条带相比增加了一些序列，该序列即为分子标记SVhd2(SEQ ID NO：1所示的核酸序列)。

此外，利用上述扩增引物(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)扩增含有该生育期位点的其它谷子群体或品种，长生育期的单株均扩增出593bp的条带，短生育期的单株均扩增出310bp的条带。由此证明该分子标记使用于含有该生育期位点的其它谷子群体或品种。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种与谷子生育期基因紧密连锁的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或者其为含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段。

2.一种重组载体，其含有权利要求1所述的分子标记。

3.一种重组细胞，其含有权利要求2所述的重组载体。

4.权利要求1所述的分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

5.权利要求1所述的分子标记的制备方法，包括下述步骤：

使用长生育期谷子的基因组DNA作为模板，以权利要求4所述的引物进行PCR扩增；优选地，还包括将PCR扩增的产物进行纯化的步骤；具体地，所述长生育期谷子为长生育期谷子为乌当2号。

6.权利要求1所述的分子标记的检测方法，包括下述步骤：

(1)根据权利要求1的分子标记的核苷酸序列设计引物；

(2)以被检测谷子的基因组DNA作为模板进行扩增；

(3)判断扩增产物中是否存在该分子标记。

7.权利要求1所述的分子标记在谷子生育期基因定位或检测中的用途。

8.一种谷子生育期基因定位的方法，包括使用权利要求1所述的分子标记的步骤。

9.权利要求1所述的分子标记在谷子辅助育种中的用途。

10.一种谷子辅助育种方法，包括检测权利要求1所述的分子标记的步骤。