CN106893779B - 用于携带磺胺类耐药基因的沙门氏菌rpa快速检测的引物及其应用 - Google Patents

用于携带磺胺类耐药基因的沙门氏菌rpa快速检测的引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开用于携带磺胺类耐药基因的沙门氏菌RPA快速检测的引物及其应用。本发明设计的引物具有较好的种间特异性和种内保守性，该技术能在一次反应中检测出沙门氏菌及磺胺类耐药基因(sul3)，短时间内可判断该菌是否为携带磺胺类耐药基因(sul3)的沙门氏菌，无假阳性的出现，也无需昂贵仪器，因此更加便捷、高效、准确。扩增后片段长度大小各异，可通过电泳进行分开辨别。

Description

用于携带磺胺类耐药基因的沙门氏菌RPA快速检测的引物及 其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测沙门氏菌及磺胺类耐药基因的重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)的引物及其应用，具体涉及一种可同时检测出沙门氏菌及磺胺类耐药基因(sul3)的RPA快速检测的引物及其应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中常见的人兽共患病原菌，不仅能导致鸡白痢、仔猪副伤寒、流产等动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位。磺胺类药物具有价格低、易储存、抗菌谱广、药效显著等优点，目前仍是养殖场的必备药物。国内外大量研究表明，由于磺胺类药物长期和大量使用，沙门氏菌已经对其产生了广泛耐药性。大量耐药菌株的存在和流行，使得本病的发病率和死亡率都不断上升，引起人们的广泛关注。因此亟需建立一种操作简便、快速准确、灵敏度和特异性都较高的方法检测携带磺胺类药物耐药基因的沙门氏菌。
目前沙门氏菌的快速检测方法主要有免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验、免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)及聚合酶链反应(PCR)技术等方法。但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是近年来开发的核酸扩增技术，相比经典PCR技术，RPA技术主要优势之一在于等温。常规PCR必须经过不同温度环节，而RPA反应在常温下即可进行反应。优势之二在于检测耗时短。整个过程在10-20分钟内即可完成，且无需变性。优势之三在于灵敏。RPA技术在缩短反应时间的同时也保持了高灵敏性。优势之四在于操作方便，不需要昂贵仪器，整个反应在水浴锅或金属浴中即可完成。优势之五在于结果读取多样化。RPA结果可通过琼脂糖凝胶电泳检测，也可类似real-timePCR对扩增过程进行实时监控，还可以通过试纸条读取结果。
本方法用RPA技术对携带磺胺类药物耐药基因(sul3)的沙门氏菌进行了研究，在保证灵敏、特异的同时，操作简单、耗时短，能够在常温下短时间内对靶DNA进行扩增，在检测沙门氏菌的同时也可检测沙门氏菌对磺胺类耐药基因(sul3)。对携带磺胺类耐药基因的沙门氏菌的分子流行病基础提供理论基础和科学依据，在兽医、食品卫生和公共卫生等方面具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可同时检测沙门氏菌及磺胺类耐药基因(sul3)的RPA快速检测的引物序列。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
为实现上述目的，本发明根据沙门氏菌及磺胺类耐药基因(sul3)的特征靶基因设计出2对特异性引物F1/R1、F2/R2，见表1。各特异性引物具有高度种内保守、种间特异性等优点。扩增后片段长度大小各异，沙门氏菌扩增后产物大小为361bp，磺胺类耐药基因(sul3)扩增后产物大小为198bp，可通过电泳进行分开辨别。
表1、RPA快速检测特异性引物序列
Figure BSA0000141344480000021
具体检测方法包括以下步骤：
步骤(1).样品DNA提取
取1ml培养好的菌液加入至1.5ml离心管，12000g离心1min，弃上清，在离心管内加入400μl裂解液，混匀后加600μl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000g离心10min；取沉淀，用体积含量为70％的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20min，然后加入80μl pH值为8.0的TE缓冲溶液溶解，得到DNA提取物；该DNA提取物即为模板DNA；将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24∶1混合而成；
所述的TE缓冲液为1ml浓度为1M、pH值为8.0的Tris-Cl，0.2ml浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA，定容至100ml溶液；
所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50mM、pH值为8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25mM，NaCl的浓度为100mM，蛋白酶K的浓度为20μg/μL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10％；
步骤(2).RPA扩增
将RPA扩增反应体系振荡混匀后，进行RPA扩增，得到扩增产物。
所述的RPA扩增反应体系即RPA凝胶检测体系为50μL由含有冻干酶粉的0.2mlTwistAmp Basic反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL，去离子水11μL，混合引物6μL(10μmol/L)，提取的样品基因组DNA 1μL，醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)组成。
将RPA扩增反应体系振荡混匀后，放入37℃恒温金属浴反应20min，得到扩增产物；
所述的加入的混合引物为2对特异性引物的混合引物，其中2对特异性引物的浓度比为F1∶R1∶F2∶R2＝1∶1∶1∶1。
步骤(3).扩增产物电泳检测
反应结束后，取扩增产物2～3μL，于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如果在361bp处有特异性条带，说明该细菌是沙门氏菌；如果在198bp处有特异性条带，说明该菌不是沙门氏菌，但是该细菌存在磺胺类耐药基因(sul3)；如果在198bp与361bp处都有特异性条带，说明该细菌为携带磺胺类耐药基因(sul3)的沙门氏菌。无条带则为阴性，说明该菌既不是沙门氏菌又不携带磺胺类耐药基因(sul3)。
本发明的有益效果：本发明设计的引物具有较好的种间特异性和种内保守性，该技术能在一次反应中检测出沙门氏菌及磺胺类耐药基因(sul3)，短时间内可判断该菌是否为携带磺胺类耐药基因(sul3)的沙门氏菌，因此更加便捷、高效。
附图说明
图1为携带磺胺类耐药基因的沙门氏菌RPA检测图谱，其中M：Marker；泳道1：磺胺类耐药基因(sul3)扩增条带；泳道2：沙门氏菌扩增条带；泳道3：携带磺胺类耐药基因(sul3)的沙门氏菌扩增条带；泳道4：阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
实施例1.
步骤(1).样品DNA提取
取1ml培养好的菌液加入至1.5ml离心管，12000g离心1min，弃上清，在离心管内加入400μl裂解液，混匀后加600μl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000g离心10min；取沉淀，用体积含量为70％的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20min，然后加入80μl pH值为8.0的TE缓冲溶液溶解，得到DNA提取物；该DNA提取物即为模板DNA；将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24∶1混合而成；
所述的TE缓冲液为1ml浓度为1M、pH值为8.0的Tris-Cl，0.2ml浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA，定容至100ml溶液；
所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50mM、pH值为8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25mM，NaCl的浓度为100mM，蛋白酶K的浓度为20μg/μL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10％；
步骤(2).RPA扩增
将RPA扩增反应体系振荡混匀后，进行RPA扩增，得到扩增产物。
所述的RPA扩增反应体系即RPA凝胶检测体系为50μL由含有冻干酶粉的0.2mlTwistAmp Basic反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL，去离子水11μL，混合引物6μL(10μmol/L)，提取的样品基因组DNA 1μL，醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)组成。
将RPA扩增反应体系振荡混匀后，放入37℃恒温金属浴反应20min，得到扩增产物；
所述的加入的混合引物为2对特异性引物的混合引物，其中2对特异性引物的浓度比为F1∶R1∶F2∶R2＝1∶1∶1∶1。
步骤(3).扩增产物电泳检测
反应结束后，取扩增产物2～3μL，于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。结果显示，在361bp处有特异性条带，说明该细菌是沙门氏菌。
实施例2.
步骤(1).样品DNA提取
取1ml培养好的菌液加入至1.5ml离心管，12000g离心1min，弃上清，在离心管内加入400μl裂解液，混匀后加600μl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000g离心10min；取沉淀，用体积含量为70％的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20min，然后加入80μl pH值为8.0的TE缓冲溶液溶解，得到DNA提取物；该DNA提取物即为模板DNA；将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24∶1混合而成；
所述的TE缓冲液为1ml浓度为1M、pH值为8.0的Tris-Cl，0.2ml浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA，定容至100ml溶液；
所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50mM、pH值为8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25mM，NaCl的浓度为100mM，蛋白酶K的浓度为20μg/μL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10％；
步骤(2).RPA扩增
将RPA扩增反应体系振荡混匀后，进行RPA扩增，得到扩增产物。
所述的RPA扩增反应体系即RPA凝胶检测体系为50μL由含有冻干酶粉的0.2mlTwistAmp Basic反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL，去离子水11μL，混合引物6μL(10μmol/L)，提取的样品基因组DNA 1μL，醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)组成。
将RPA扩增反应体系振荡混匀后，放入37℃恒温金属浴反应20min，得到扩增产物；
所述的加入的混合引物为2对特异性引物的混合引物，其中2对特异性引物的浓度比为F1∶R1∶F2∶R2＝1∶1∶1∶1。
步骤(3).扩增产物电泳检测
反应结束后，取扩增产物2～3μL，于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。结果显示，在198bp处有特异性条带，说明该菌不是沙门氏菌，但是该细菌存在磺胺类耐药基因(sul3)。
实施例3.
步骤(1).样品DNA提取
取1ml培养好的菌液加入至1.5ml离心管，12000g离心1min，弃上清，在离心管内加入400μl裂解液，混匀后加600μl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000g离心10min；取沉淀，用体积含量为70％的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20min，然后加入80μl pH值为8.0的TE缓冲溶液溶解，得到DNA提取物；该DNA提取物即为模板DNA；将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24∶1混合而成；
所述的TE缓冲液为1ml浓度为1M、pH值为8.0的Tris-Cl，0.2ml浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA，定容至100ml溶液；
所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50mM、pH值为8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25mM，NaCl的浓度为100mM，蛋白酶K的浓度为20μg/μL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10％；
步骤(2).RPA扩增
将RPA扩增反应体系振荡混匀后，进行RPA扩增，得到扩增产物。
所述的RPA扩增反应体系即RPA凝胶检测体系为50μL由含有冻干酶粉的0.2mlTwistAmp Basic反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL，去离子水11μL，混合引物6μL(10μmol/L)，提取的样品基因组DNA 1μL，醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)组成。
将RPA扩增反应体系振荡混匀后，放入37℃恒温金属浴反应20min，得到扩增产物；
所述的加入的混合引物为2对特异性引物的混合引物，其中2对特异性引物的浓度比为F1∶R1∶F2∶R2＝1∶1∶1∶1。
步骤(3).扩增产物电泳检测
反应结束后，取扩增产物2～3μL，于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。结果显示，在198bp与361bp处都有特异性条带，说明该细菌为携带磺胺类耐药基因(sul3)的沙门氏菌。
实施例4.
步骤(1).样品DNA提取
取1ml培养好的菌液加入至1.5ml离心管，12000g离心1min，弃上清，在离心管内加入400μl裂解液，混匀后加600μl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000g离心10min；取沉淀，用体积含量为70％的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20min，然后加入80μl pH值为8.0的TE缓冲溶液溶解，得到DNA提取物；该DNA提取物即为模板DNA；将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24∶1混合而成；
所述的TE缓冲液为1ml浓度为1M、pH值为8.0的Tris-Cl，0.2ml浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA，定容至100ml溶液；
所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50mM、pH值为8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25mM，NaCl的浓度为100mM，蛋白酶K的浓度为20μg/μL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10％；
步骤(2).RPA扩增
将RPA扩增反应体系振荡混匀后，进行RPA扩增，得到扩增产物。
所述的RPA扩增反应体系即RPA凝胶检测体系为50μL由含有冻干酶粉的0.2mlTwistAmp Basic反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL，去离子水11μL，混合引物6μL(10μmol/L)，提取的样品基因组DNA 1μL，醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)组成。
将RPA扩增反应体系振荡混匀后，放入37℃恒温金属浴反应20min，得到扩增产物；
所述的加入的混合引物为2对特异性引物的混合引物，其中2对特异性引物的浓度比为F1∶R1∶F2∶R2＝1∶1∶1∶1。
步骤(3).扩增产物电泳检测
反应结束后，取扩增产物2～3μL，于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。结果显示，无特异性条带，说明该菌既不是沙门氏菌又不携带磺胺类耐药基因(sul3)。

Claims (1)

1.用于携带磺胺类耐药基因的沙门氏菌RPA快速检测的引物，其特征在于包括两对特异性引物，具体是：
F1: 5’- GAAAAAATACCTGTAACGGGAAGTGGGTTTGT -3’；
R1: 5’- TTCCTTTACGGTTATCGCCACGTAGCGGGTAATT -3’；
F2: 5’- CTCTGCATTTGGTTGAAGATGGAGCAGATGTGAT -3’；
R2: 5’- CCTTTTGTTCTATGCAAAAACTCTGAACCTCAGG -3’。
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