CN106892959A - 多通道多肽固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多通道多肽固相合成方法，按以下步骤来进行：第一步骤是连接步骤，第二步骤是树脂分装步骤；第三步骤是进行树脂溶胀，第四步骤是进行脱保护反应，第五步骤是洗涤树脂步骤，第六步骤是检测脱保护反应是否完成的步骤，第七步骤是进行偶合反应，第八步骤是检测偶合反应是否完成的步骤。本发明在使用时根据进行下一步反应所需要的偶合溶液对各多肽合成管进行分组，将需要的偶合溶液相同的多肽合成管归为同一组，从而为实现批量反应提供基础；本发明进一步设置出若干多肽合成管对应同一反应缸体的技术方案。与以往的合成装置及合成方法相比，具有突出的高效率优点，提高寻找效果最佳的多肽类物质的效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学实验领域，尤其涉及一种多肽固相合成方法。
背景技术
多肽固相合成是将保护氨基酸连接到固态树脂上，脱去保护基团，然后将下一个保护氨基酸与第一个氨基酸的残基反应并形成肽键，然后脱去第二个氨基酸的保护基团，再连接下一个氨基酸，这样循环下去使肽链增长。多肽固相合成中，固态树脂是必须使用的反应底物。
多肽固相合成反应中，需要使用抽滤装置，抽滤装置包括有抽滤瓶和与抽滤瓶相连接的真空泵。
多肽固相合成中，溶入活化剂的反应液为偶合溶液，溶入脱保护剂的反应液为脱保护溶液。在进行肽固相合成反应时，常常使用多肽固相合成管，在多肽固相合成管中加入树脂，先将树脂溶胀，然后交替加入脱保护溶液和偶合溶液进行合成反应。加入脱保护溶液时，树脂与脱保护溶液进行脱去保护基团的反应；加入偶合溶液时，树脂与偶合溶液中的带保护基团的氨基酸进行偶合反应。
在多肽固相合成中，常常需要以一个母肽为基础，合成多种突变位点不同的衍生肽，如在研发多肽类药物时，需要以一种母肽为基础，合成多种突变位点不同的衍生肽，然后从各种衍生肽中寻找药效最佳的多肽类药物。
在树脂上每连接一个氨基酸，都需要使用一种特定的与多肽的氨基酸序列相适应的偶合溶液，连接不同的氨基酸需要使用不同的偶合溶液。因此，在多肽固相合成的过程中，就需要多次更换反应液。在基于一种母肽制备多种衍生肽时，各种衍生肽需要的大部分偶合溶液是相同的，但是目前的多肽固相合成装置，在制备各衍生肽需要的偶合溶液相同时，也需要在制备不同的衍生肽时分别进行偶合反应，缺少能够批量进行多肽固相合成反应的装置以及方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够在制备不同的衍生肽时批量进行多肽固相合成反应的方法。
为实现上述目的，本发明的多通道多肽固相合成方法使用多通道多肽固相合成装置来进行，多通道多肽固相合成装置包括用于盛装反应液的反应缸体，反应缸体底部连接有抽滤接管和氮气接管，氮气接管连接有氮气软管，氮气软管用于连接外置高压氮气瓶，氮气接管上设有氮气阀门，抽滤接管上设有抽滤阀门；
抽滤接管连接有抽真空软管，抽真空软管用于连接外置的抽滤装置；反应缸体顶部设有气体进出管，
反应缸体顶面连接有若干连接磨口，连接磨口的顶部呈上大下小的空心锥台形；每一连接磨口内分别插设有一多肽合成管，多肽合成管的底端插入反应缸体的下部且多肽合成管的底端设有砂芯滤芯；多肽合成管的中部设有磨砂连接部，磨砂连接部呈与连接磨口相适配的上大下小的空心锥台形；
所述各多肽合成管的底端位于同一水平面，反应缸体内于各多肽合成管的下方设有氮气分气箱，氮气分气箱的顶面与各多肽合成管一一对应设有若干氮气分气口，氮气分气口处设有由下至上单向导通的单向阀；所述氮气接管伸入反应缸体内并与氮气分气箱相连接；
本发明的多通道多肽固相合成方法按以下步骤来进行：
第一步骤是连接步骤，将氮气软管与外置高压氮气瓶相连接，将抽真空软管与外置的抽滤装置相连接；
第二步骤是树脂分装步骤，在多通道多肽固相合成装置的各多肽合成管中分别装入精确称量后的连接有相同或不同氨基酸残基的树脂；
第三步骤是进行树脂溶胀，具体是：
①将溶胀溶剂加入反应缸体；
②将装有树脂的每个多肽合成管分别通过连接磨口插入同一反应缸体进行溶胀，多肽合成管支撑在连接磨口上且其底端高于氮气分气箱并位于氮气分气口的正上方；
③打开高压氮气瓶的出气阀和氮气阀门，将氮气送入氮气分气箱；氮气分气箱内的氮气通过单向阀后进入反应缸体，氮气带动部分反应缸体内的液体通过砂芯滤芯进入多肽合成管，在反应中起到搅拌的作用，使液体与树脂充分接触；氮气同时通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体上的气体进出管流出；溶胀30±10 分钟，待树脂充分溶胀后，关闭氮气阀门；
④进行抽滤操作，抽滤操作具体是打开抽滤阀门，使用塞子封闭气体进出管，启动抽滤装置，对反应缸体进行抽滤，将反应缸体内的液体从反应缸体内抽出；抽滤结束后关闭抽滤阀门；
第四步骤是进行脱保护反应，具体是：
①将脱保护溶液加入反应缸体；
②打开氮气阀门，进行氮气搅拌，使反应缸体内的脱保护溶液与树脂充分接触；氮气通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体上的气体进出管流出，本步骤持续进行30-40分钟，关闭氮气阀门，进行所述抽滤操作；
第五步骤是洗涤树脂步骤，本步骤是将溶剂（如DMF溶剂，甲醇溶剂或二氯化碳溶剂；DMF溶剂即N，N-二甲基甲酰胺溶剂）加入反应缸体中对树脂进行洗涤，打开氮气阀门，进行氮气搅拌，使反应缸体内的液体与树脂充分接触；氮气通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体上的气体进出管流出，本步骤持续进行1分钟，关闭氮气阀门，进行所述抽滤操作；
本步骤重复进行六次；
第六步骤是检测脱保护反应是否完成的步骤，具体是：
通过茚三酮显色法检测各多肽合成管中的树脂的脱保护反应是否完成，对于未完成脱保护反应的树脂，重复第四和第五步骤；
对于已完成脱保护反应的树脂，若固相合成反应未全部结束，则进行下一步骤；若固相合成反应已全部结束，则将树脂从各多肽合成管中取出，停止反应；本步骤是多肽固相合成方法的结束步骤。
第七步骤是进行偶合反应，具体是：
①对各多肽合成管进行区分，根据进行下一步反应所需要的偶合溶液对各多肽合成管进行分组，将需要的偶合溶液相同的多肽合成管归为同一组；
②对于同一组装有树脂的多肽合成管，将该组中的每个多肽合成管分别通过连接磨口插入同一反应缸体，将偶合溶液加入反应缸体；
③打开氮气阀门，进行氮气搅拌，使反应缸体内的液体与树脂充分接触；氮气通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体上的气体进出管流出，本步骤持续进行2-3小时；关闭氮气阀门，进行所述抽滤操作；然后进行第五步骤即洗涤树脂步骤，然后进行第八步骤；
第八步骤是检测偶合反应是否完成的步骤，具体是：
通过茚三酮显色法检测各多肽合成管中的树脂的偶合反应是否完成；对于未完成偶合反应的树脂，重复第七步骤以重新进行偶合反应；对于已完成偶合反应的树脂，则进行第四至第六步骤。
所述溶胀溶剂为N，N-二甲基甲酰胺溶剂；所述树脂采用Wang树脂或Rink树脂。
所述气体进出管设有两个，一个连接在反应缸体顶面中心处，另一个连接在反应缸体侧壁顶部。
本发明设计了一种多通道多肽固相合成方法及专用的装置，进行多肽固相合成反应非常方便，而且通过将不同的多肽合成管同时插入同一反应缸体来进行批量反应，与以往相比大大提高了多肽固相合成的效率，节约了相应研究的时间。在以一种母肽为基础，合成多种突变位点不同的衍生肽时，与以往的合成装置及合成方法相比，具有突出的高效率优点，能够快速合成多种衍生肽，从而提高寻找效果（如药效）最佳的多肽类物质的效率。
以往的多肽固相反应中，树脂和反应液均加入同一多肽固相反应管，砂芯滤芯则位于多固相反应管的中部。这种结构也限制了批量反应的可能性。
本发明在使用时根据进行下一步反应所需要的偶合溶液对各多肽合成管进行分组，将需要的偶合溶液相同的多肽合成管归为同一组，从而为实现批量反应提供基础；本发明进一步设置出若干多肽合成管对应同一反应缸体的技术方案。
这种分组的办法，以及多管对应同一缸体的结构，是发明人在经过长期低效重复反应实验后，经过创造性思考所提出来的，是实现批量反应、提高反应效率的关键。
氮气分气箱的设置是发明人的另一创新之处，每一多肽合成管的底端（砂芯滤芯）均对应一个氮气分气口，使得氮气在通过氮气分气口后，非常容易地带动一部分反应缸体内的液体向上通过砂芯滤芯进入多肽合成管，大大提高了搅拌力度，明显提高了反应或洗涤的效率。所述气体进出管设有两个，一个连接在反应缸体顶面中心处，另一个连接在反应缸体侧壁顶部。在加大氮气搅拌的力度（加大氮气压力可以加大氮气搅拌力度）时，能够使氮气顺畅地流出反应缸体。
附图说明
图1是本发明的多通道多肽固相合成装置去掉多肽合成管后的结构示意图；
图2是图1的俯视图；
图3是氮气分气箱与氮气接管相连接的示意图；
图4是本发明的多通道多肽固相合成装置的结构示意图。
具体实施方式
如图1至图4所示，本发明的多通道多肽固相合成方法使用多通道多肽固相合成装置来进行。多通道多肽固相合成装置包括用于盛装反应液（脱保护溶液或偶合溶液）的反应缸体1，反应缸体1底部连接有抽滤接管2和氮气接管3，氮气接管3连接有氮气软管4，氮气软管4用于连接外置高压氮气瓶，氮气接管3上设有氮气阀门5，抽滤接管2上设有抽滤阀门6；
抽滤接管2连接有抽真空软管7，抽真空软管7用于连接外置的抽滤装置；反应缸体1顶部设有气体进出管8，
反应缸体1顶面连接有若干连接磨口9，连接磨口9的顶部呈上大下小的空心锥台形；每一连接磨口9内分别插设有一多肽合成管10，多肽合成管10的底端插入反应缸体1的下部且多肽合成管10的底端设有砂芯滤芯11；进行反应时，树脂放置在砂芯滤芯11上，液体能够通过砂芯滤芯11，但是固态的树脂不会通过砂芯滤芯11。多肽合成管10的中部设有磨砂连接部，磨砂连接部呈与连接磨口9相适配的上大下小的空心锥台形。使用时，多肽合成管10依靠磨砂连接部支撑在连接磨口9上并与连接磨口9之间形成密封。磨砂连接部在图4中被连接磨口9所遮挡，因此图中未给出标号。
所述各多肽合成管10的底端位于同一水平面，反应缸体1内于各多肽合成管10的下方设有氮气分气箱12，氮气分气箱12的顶面与各多肽合成管10一一对应设有若干氮气分气口13，氮气分气口13处设有由下至上单向导通的单向阀；所述氮气接管3伸入反应缸体1内并与氮气分气箱12相连接。单向阀可以防止液体由反应缸体1流入氮气分气箱12。单向阀为常规技术，图未示。
在使用上述多通道多肽固相合成装置实现多通道多肽固相合成方法时按以下步骤来进行：
第一步骤是连接步骤，将氮气软管4与外置高压氮气瓶相连接，将抽真空软管7与外置的抽滤装置相连接；
第二步骤是树脂分装步骤，在多通道多肽固相合成装置的各多肽合成管中分别装入精确称量后的连接有相同或不同氨基酸残基的树脂；
第三步骤是进行树脂溶胀，具体是：
①将溶胀溶剂加入反应缸体1；
②将装有树脂的每个多肽合成管分别通过连接磨口9插入同一反应缸体1进行溶胀，多肽合成管支撑在连接磨口9上且其底端高于氮气分气箱12并位于氮气分气口13的正上方；
③打开高压氮气瓶的出气阀和氮气阀门5，将氮气送入氮气分气箱12；氮气分气箱12内的氮气通过单向阀后进入反应缸体1，氮气带动部分反应缸体1内的液体通过砂芯滤芯11进入多肽合成管，在反应中起到搅拌的作用，使液体与树脂充分接触；氮气同时通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体1上的气体进出管8流出；溶胀30±10 分钟，待树脂充分溶胀后，关闭氮气阀门5；由于单向阀的存在，反应缸体1内的液体不会通过单向阀进入氮气分气箱12。
④进行抽滤操作，抽滤操作具体是打开抽滤阀门6，封闭气体进出管8，启动抽滤装置（如真空泵），对反应缸体1进行抽滤，将反应缸体1内的液体从反应缸体1内抽出；抽滤结束后关闭抽滤阀门6；
第四步骤是进行脱保护反应，具体是：
①将脱保护溶液通过连接磨口9或多肽合成管加入反应缸体1；
②打开氮气阀门5，进行氮气搅拌，使反应缸体1内的脱保护溶液与树脂充分接触；氮气通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体1上的气体进出管8流出，本步骤持续进行30-40分钟，关闭氮气阀门5，进行所述抽滤操作；
第五步骤是洗涤树脂步骤，本步骤是将溶剂（如DMF溶剂，甲醇溶剂或二氯化碳溶剂；DMF溶剂即N，N-二甲基甲酰胺溶剂）加入反应缸体中对树脂进行洗涤，打开氮气阀门5，进行氮气搅拌，使反应缸体1内的液体与树脂充分接触；氮气通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体1上的气体进出管8流出，本步骤持续进行1分钟，关闭氮气阀门5，进行所述抽滤操作；
本步骤重复进行六次；
第六步骤是检测脱保护反应是否完成的步骤，具体是：
通过茚三酮显色法检测各多肽合成管中的树脂的脱保护反应是否完成，对于未完成脱保护反应的树脂，重复第四和第五步骤；
对于已完成脱保护反应的树脂，若固相合成反应未全部结束，则进行下一步骤；若固相合成反应已全部结束，则将树脂从各多肽合成管中取出，停止反应；
第七步骤是进行偶合反应，具体是：
①对各多肽合成管进行区分，根据进行下一步反应所需要的偶合溶液对各多肽合成管进行分组，将需要的偶合溶液相同的多肽合成管归为同一组；下一步反应需要的偶合溶液类型是根据下一步需要偶合的氨基酸来确定的。
②对于同一组装有树脂的多肽合成管，将该组中的每个多肽合成管分别通过连接磨口9插入同一反应缸体1，将偶合溶液加入反应缸体1；
③打开氮气阀门5，进行氮气搅拌，使反应缸体1内的液体与树脂充分接触；氮气通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体1上的气体进出管8流出，本步骤持续进行2-3小时；关闭氮气阀门5，进行所述抽滤操作；然后进行第五步骤即洗涤树脂步骤，然后进行第八步骤；
第八步骤是检测偶合反应是否完成的步骤，具体是：
通过茚三酮显色法检测各多肽合成管中的树脂的偶合反应是否完成；对于未完成偶合反应的树脂，重复第七步骤以重新进行偶合反应；对于已完成偶合反应的树脂，则进行第四至第六步骤。
所述溶胀溶剂为N，N-二甲基甲酰胺溶剂；所述树脂采用Wang树脂或Rink树脂。所述气体进出管8设有两个，一个连接在反应缸体1顶面中心处，另一个连接在反应缸体1侧壁顶部。在加大氮气搅拌的力度（即加大氮气压力）时，能够使氮气顺畅地流出反应缸体1。
本发明尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (3)
1.多通道多肽固相合成方法，其特征在于：该方法使用多通道多肽固相合成装置来进行，多通道多肽固相合成装置包括用于盛装反应液的反应缸体，反应缸体底部连接有抽滤接管和氮气接管，氮气接管连接有氮气软管，氮气软管用于连接外置高压氮气瓶，氮气接管上设有氮气阀门，抽滤接管上设有抽滤阀门；
抽滤接管连接有抽真空软管，抽真空软管用于连接外置的抽滤装置；反应缸体顶部设有气体进出管，
反应缸体顶面连接有若干连接磨口，连接磨口的顶部呈上大下小的空心锥台形；每一连接磨口内分别插设有一多肽合成管，多肽合成管的底端插入反应缸体的下部且多肽合成管的底端设有砂芯滤芯；多肽合成管的中部设有磨砂连接部，磨砂连接部呈与连接磨口相适配的上大下小的空心锥台形；
所述各多肽合成管的底端位于同一水平面，反应缸体内于各多肽合成管的下方设有氮气分气箱，氮气分气箱的顶面与各多肽合成管一一对应设有若干氮气分气口，氮气分气口处设有由下至上单向导通的单向阀；所述氮气接管伸入反应缸体内并与氮气分气箱相连接；
本发明的多通道多肽固相合成方法按以下步骤来进行：
第一步骤是连接步骤，将氮气软管与外置高压氮气瓶相连接，将抽真空软管与外置的抽滤装置相连接；
第二步骤是树脂分装步骤，在多通道多肽固相合成装置的各多肽合成管中分别装入精确称量后的连接有相同或不同氨基酸残基的树脂；
第三步骤是进行树脂溶胀，具体是：
①将溶胀溶剂加入反应缸体；
②将装有树脂的每个多肽合成管分别通过连接磨口插入同一反应缸体进行溶胀，多肽合成管支撑在连接磨口上且其底端高于氮气分气箱并位于氮气分气口的正上方；
③打开高压氮气瓶的出气阀和氮气阀门，将氮气送入氮气分气箱；氮气分气箱内的氮气通过单向阀后进入反应缸体，氮气带动部分反应缸体内的液体通过砂芯滤芯进入多肽合成管，在反应中起到搅拌的作用，使液体与树脂充分接触；氮气同时通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体上的气体进出管流出；溶胀30±10 分钟，待树脂充分溶胀后，关闭氮气阀门；
④进行抽滤操作，抽滤操作具体是打开抽滤阀门，使用塞子封闭气体进出管，启动抽滤装置，对反应缸体进行抽滤，将反应缸体内的液体从反应缸体内抽出；抽滤结束后关闭抽滤阀门；
第四步骤是进行脱保护反应，具体是：
①将脱保护溶液加入反应缸体；
②打开氮气阀门，进行氮气搅拌，使反应缸体内的脱保护溶液与树脂充分接触；氮气通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体上的气体进出管流出，本步骤持续进行30-40分钟，关闭氮气阀门，进行所述抽滤操作；
第五步骤是洗涤树脂步骤，本步骤是将溶剂加入反应缸体中对树脂进行洗涤，打开氮气阀门，进行氮气搅拌，使反应缸体内的液体与树脂充分接触；氮气通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体上的气体进出管流出，本步骤持续进行1分钟，关闭氮气阀门，进行所述抽滤操作；
本步骤重复进行六次；
第六步骤是检测脱保护反应是否完成的步骤，具体是：
通过茚三酮显色法检测各多肽合成管中的树脂的脱保护反应是否完成，对于未完成脱保护反应的树脂，重复第四和第五步骤；
对于已完成脱保护反应的树脂，若固相合成反应未全部结束，则进行下一步骤；若固相合成反应已全部结束，则将树脂从各多肽合成管中取出，停止反应；
第七步骤是进行偶合反应，具体是：
①对各多肽合成管进行区分，根据进行下一步反应所需要的偶合溶液对各多肽合成管进行分组，将需要的偶合溶液相同的多肽合成管归为同一组；
②对于同一组装有树脂的多肽合成管，将该组中的每个多肽合成管分别通过连接磨口插入同一反应缸体，将偶合溶液加入反应缸体；
③打开氮气阀门，进行氮气搅拌，使反应缸体内的液体与树脂充分接触；氮气通过各多肽合成管的顶端开口或者反应缸体上的气体进出管流出，本步骤持续进行2-3小时；关闭氮气阀门，进行所述抽滤操作；然后进行第五步骤即洗涤树脂步骤，然后进行第八步骤；
第八步骤是检测偶合反应是否完成的步骤，具体是：
通过茚三酮显色法检测各多肽合成管中的树脂的偶合反应是否完成；对于未完成偶合反应的树脂，重复第七步骤以重新进行偶合反应；对于已完成偶合反应的树脂，则进行第四至第六步骤。
2.根据权利要求1所述的多通道多肽固相合成方法，其特征在于：所述溶胀溶剂为N，N-二甲基甲酰胺溶剂；所述树脂采用Wang树脂或Rink树脂。
3.根据权利要求1或2所述的多通道多肽固相合成方法，其特征在于：所述气体进出管设有两个，一个连接在反应缸体顶面中心处，另一个连接在反应缸体侧壁顶部。
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