CN106068230B - 用于化学合成的自动气体阀容器支座 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种容器支座10，包括主体12，主体12继而包括气体入口16；溶液液体出口18；气体控制阀20，气体通过其从气体入口进入容器100；以及用于容器的密封器件22，该密封器件包括用于气体的输入和容器中的溶液经由流出管19的输出的通路24；其中当容器通过密封器件连接到容器支座时，气体控制阀自动地开启，且当容器断开时，气体控制阀自动地关闭。本发明还涉及包括两个或更多容器支座的容器面板50。还公开了使用这些容器和容器面板以用于合成多肽的方法。

Description

用于化学合成的自动气体阀容器支座
技术领域
本发明涉及化学合成，诸如肽合成、蛋白质生物合成，或低聚核苷酸合成。更具体而言，本发明涉及用于此类合成所需的溶液的自动气体阀容器支座，以及使用此自动气体阀容器支座的合成的方法。
背景技术
在近几年间，肽疗法(不包括胰岛素)呈两位数的增长。一旦解决稳定性(搁置寿命)和在体内快速降解的问题，则肽疗法的成功就拉开序幕。在预先的临床前和临床发展阶段，进行了几百次尝试。相比于二十世纪八十年代的5种新API(药用活性成分)/每年，2010年几乎20种新API进入了临床研究。合成肽构成了销售的肽和储备中的肽的大部分(大约70%)。肽研究和制造在全球展开，但欧洲和美国市场占据了肽API的5亿美元/年的总体估计的可寻的市场机会的较大部分。
使用肽作为药品中的API的好处已经被认识了几十年，但还未开发至其全部能力。已经认识到了许多功能，但一直在探索新的治疗领域和适应症。相比于传统小分子，肽的优点在于其高度靶专一性、高效力和低毒性。所有的降解产物是氨基酸，其最大程度减小系统毒性的任何风险，且其短t1/2(半衰期)消除了累积在组织中的较高风险。体内的肽的稳定性和短t1/2的挑战已经在较大程度上得到满足。
若干合成技术可用于多肽的制造。简化且简要的概述在表1中提出。所需的量、肽的长度和其复杂性影响选择。可开发出混合版本以使用各个独立技术的优点。在混合版本中，肽片段使用固相技术合成，且这些链接在一起以使用批量合成纠正整个长度的产品。
表1 肽制造技术
不同于低聚核苷酸的合成，除其它化学溶液之外，多肽合成系统需要能够处理20种以上不同的氨基酸。此外，有机溶剂中的氨基酸需要与空气水分分离，因为它们对水敏感。因此，所需的是提供这些期望特征的紧凑容器支座。
发明内容
本文所公开的包括一种新颖容器支座，其包括气体阀，气体阀在容器连接到容器支座时自动地开启。当容器断开时，气体控制阀自动地关闭。还公开了包括至少两个公开的容器支座的容器支座面板，以及使用此容器支座和容器支座面板来供应一种或多种氨基酸的化学合成的方法。
因此，本发明的第一方面在于提供一种容器支座，其包括主体，主体继而包括：
(a)气体入口；
(b)溶液出口；
(c)气体控制阀，通过其允许气体从气体入口进入容器；以及
(d)用于密封使用中的容器的密封器件，该密封器件包括用于气体的输入和用于容器中的溶液的流出的通路；
其中，当容器通过密封器件密封地连接到容器支座时，气体控制阀自动地开启，且当容器与容器支座流体地断开时，气体控制阀自动地关闭。
本发明的第二方面在于提供一种容器支座面板，包括根据本发明的第一方面的两个或更多容器支座。
本发明的第三方面提供了一种用于化学合成例如多肽的方法，包括合成步骤的循环：
(a)对现有肽上的α氨保护基去保护；
(b)从氨基酸的供应对混合器中的下一氨基酸预活化；以及
(c)将活化的氨基酸耦合至现有肽；
其中至少一种氨基酸通过连接到根据本发明的某些方面的容器支座的容器供应。
本发明的另一个方面提供了一种用于合成多肽的方法，包括合成步骤的循环：
(a)对现有肽上的α氨保护基去保护；
(b)从氨基酸的供应对混合器中的下一氨基酸预活化；以及
(c)将活化的氨基酸耦合至现有肽；
其中至少一种氨基酸通过连接到根据本发明的某些方面的容器支座面板的容器供应。
本发明的进一步细节和优点将从以下描述和权利要求中出现。
附图说明
图1示出了就位的容器支座和容器的截面视图。气体通过具有外径1/16英寸(1.6mm)的毛细管供应，且类似的毛细管用作用于氨基酸的出口。
图2示出了容器支座的局部截面侧视图。弹簧阀将通过其内部O形环密封。
图3示出了截面侧视图。弹簧阀开启，且气体将加压容器。
图4示出了截面前视图。导销防止钢盘在管连接时关于其螺纹旋转。
图5示出了带有台架支撑物的示例性容器支座。
图6示出了附接到原型多肽合成器的柜轨道的示例性容器支座。
具体实施方式
对于多肽合成系统的一个要求涉及除其它化学溶液之外，需要能够处理20种以上不同的氨基酸。此外，有机溶剂中的氨基酸需要与气湿分离，因为它们对湿气敏感。设计了一种新颖容器支座，其包括气体阀，气体阀在容器连接到容器支座时自动地开启。当容器断开时，气体控制阀自动地关闭。此容器支座确保了在包括对于外部环境敏感的成分的容器附接到容器支座时，小压力累积在容器中，因此该成分与外部环境分离。本发明还提供了包括至少两个公开的容器支座的容器支座面板，以及使用此容器支座或容器支座面板来供应一种或多种氨基酸的肽合成方法。
第一方面，本发明涉及如图1中示范的用于保持容器100的容器支座10。支座10包括主体12，其具有面向下的内螺纹孔口14以用于接纳容器100的互补的带螺纹的上部110。容器支座主体12还包括气体入口16；液体溶液出口18；气体控制阀20，空气经由其从气体入口16进入容器100；以及用于在容器拧入支座主体10中时密封容器的密封器件22，该密封器件包括用于气体的输入和用于流出管19的通路24，管19从容器100传送输出液体L溶液。流出管19浸入容器中的液体L中，使得来自气体入口16的气压将迫使液体L沿流出管19向上行进并离开出口18。当容器连接到容器支座时，气体控制阀20自动地开启，且当容器断开时，气体控制阀自动地关闭。
气体阀的操作在图2和图3中更详细示出，其中图2示出了支座的主体12，其中无附接到其上的相应的容器，使得气体阀20关闭，且图3示出了其中附接了容器的主体，使得气体阀20开启。
更详细而言，当容器100未拧入就位时(图2)，阀20的弹簧推动的销28被向下推动，使得入口16中的气体G受阻且不可行进经过阻挡室26。当容器100拧入就位时，容器的上缘120作用于弹性体平密封部件23上，其继而向上推动阀促动板27以作用在阀销29上，且相对于其弹簧推动向上推动销。阀20然后打开，且允许气体加压容器100。板27的后部通过O形环密封件25相对于主体12密封。
图3中可看到的是，通路24容纳加压气体G的流和流出管19两者，提供了容易清洁的简单构造的帽。
在一个实施例中，气体控制阀20为弹簧阀。
在一个实施例中，密封器件包括螺纹部分14和板27或盘，其中当容器通过其带螺纹的上缘120或盖与螺纹部分连接时，板27或盘开启气体控制阀20。板27或盘可由钢或塑料制成。
在某些实施例中，容器支座还包括板27或盘下方的平密封件23，以及板/盘与主体的内侧表面或边缘之间的O形环25。
图4示出了穿过不同截面截取的主体12的另一个截面视图。在此视图中，导销30示为由引导弹簧31推入就位。导销30的目的在于在容器100拧入主体12中的位置时阻止板27旋转。
在某些实施例中，结合容器支座使用的容器可为任何形状或尺寸，只要螺纹110匹配容器支座的螺纹14。作为备选，具有用于不同容器的不同螺纹的适配器构件可用于将不同容器连接到不同容器支座。在优选实施例中，容器为50ml的管，诸如Falcon管。
容器支座设计成使得当气体控制阀处于开启位置时，容器利用惰性气体加压，且容器中的溶液与外部环境隔离。在某些实施例中，惰性气体可为无湿气的。在某些其它实施例中，惰性气体为氮。
本发明的第二方面在图5和图6中示出。示出了容器支座50，其包括保持多个容器100的改进的容器支座。改进的容器支座10'具有多个接纳容器的螺纹孔口14'、公共气体入口16'和多个出口18。在图5中，示出了4个容器支座10'，其一个在另一个上方安装在垂直支撑物55上，以形成容器支座面板50。
在另一个示例性实施例中，本发明涉及包括至少两排容器支座的容器支座面板50，各排具有至少两个容器支座。在优选实施例中，容器支座面板包括四排容器支座，各排具有8个容器支座。
在一个实施例中，各个容器支座的气体入口连接到公共气源。
图6示出了结合化学合成(诸如多肽合成)的设备使用的面板50。
在某些实施例中，容器支座面板用于将氨基酸溶液供应到肽合成器60。在某些优选实施例中，容器支座面板50用于将多肽合成运行所需的所有氨基酸溶液供应到肽合成器60。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于合成多肽的方法，包括合成步骤的循环：
(a)对现有肽上的α氨保护基去保护；
(b)从氨基酸的供应对混合器中的下一氨基酸预活化；以及
(c)将活化的氨基酸耦合至现有肽；
其中至少一种氨基酸通过连接到根据本发明的方面的容器支座的容器供应。在一个示例性实施例中，各种氨基酸通过连接到容器支座的独立容器供应。
在本发明的第三方面，提供了一种用于合成多肽的方法，包括合成步骤的循环：
(a)对现有肽的α氨保护基去保护；
(b)从氨基酸的供应对混合器中的下一氨基酸预活化；以及
(c)将活化的氨基酸耦合至现有肽；
其中至少一种氨基酸通过连接到根据本发明的方面的容器支座面板的容器支座的容器供应。在一个示例性实施例中，各种氨基酸通过连接到容器支座面板的容器支座的容器供应。
下文简要描述了用于多肽合成的循环过程。
示例性多肽合成过程
多肽可在装填在柱中的固体支撑物上合成。所需的柱容积CV与支撑物的膨胀性质以及将产生的肽的量/长度有关。支撑物可以以干形式或作为浆料在设置系统之前加入柱中。合成过程是循环程序，其中各个循环将一种氨基酸加入生长的肽链。第一氨基酸(AA)可能已经附接到准备用于待耦合的第二AA的支撑物上的α-氨反应部位。对于各个循环，不同的化学制品/试剂以逐步方式泵送穿过装填的柱。
(1)合成步骤
各个循环包括：
•对柱中现有肽上的α胺保护基去保护
•对混合器中的下一氨基酸预活化
•利用穿过柱的再循环使预活化的氨基酸耦合
•可选的封端步骤以阻止氨基酸链末端的未结合的氨基酸在所有随后合成步骤中结合至任何氨基酸。
各个循环中的独立步骤后接清洗通路和柱来消除任何交叉污染和不期望的反应。循环重复，直到产生期望的多肽产物(氨基酸链)。
在开始时，AA的预期序列与信息一起输入软件中，诸如将使用的固体支撑物、对于各个AA耦合期望的活化和耦合混合物，以及活化和耦合分别所需的时间。
1.现有肽的最后的AA的去保护将除去Fmoc保护基。这通过加入与溶剂(通常是NMP或DMF)混合的去保护剂(例如，哌啶)来完成。冲洗柱，且混合物通过废物除去。N端现在与需要活化的下一AA自由反应。
通路、柱和混合器利用溶剂清洗(通常是NMP或DMF)。
2.将耦合至生长的肽的下一AA的预活化在混合器中执行。添加剂和基料(如果对于待活化的AA需要)与预期的AA和耦合剂CR一起加入混合物中。存在添加剂、基料和CR试剂的备选物，且选择取决于特定AA和将产生的耦合。
3.预活化的氨基酸的耦合通过经由柱泵送耦合混合物来执行。该反应较慢，且对于高耦合程度需要再循环。
该步骤后接清洗通路、柱和清洁混合器至预活化的AA≤0.01%的检测水平。
取决于待执行的耦合，任何未反应的α胺部位有时需要在加入下一AA之前消除。出于此目的，封端剂因此可选地通过柱冲洗。
合成循环对于下一AA耦合继续。
(2)合成后
当合成完成时，柱从系统拆卸。使材料干燥，且肽随后在过滤/净化之前从支撑物裂开。粗肽已经裂开之后仍存在的支撑物弃置，因为其为一次性使用的材料。
容器支座
各种氨基酸溶解于有机溶剂中，且需要受保护而免受气湿。这通过以较小超压来加压保持AA溶液的容器实现，以确保没有空气泄漏到容器中，因为其在肽合成过程期间排空。容器的加压通过将具有气体入口的容器连接在瓶支座上且然后将惰性气体分布到容器中来实现。气流通过弹簧阀限制，以确保在瓶除去时没有气体泄漏。当瓶完全附接时，弹簧阀的开口匹配气体入口，且气体自由流入瓶中。图1。
用于AA的容器支座对于具有良好使用性和确保正确功能性很重要。使用性问题于容器以有效且稳健的方式与流动通路附接和除去有关。功能性主要关于保持AA免受湿气的需要，但由于AA溶液中的高粘性，故在入口管中具有一定超压来防止成穴也可能较好。
容器支座的主体配备有气体控制阀，其在容器完全连接时打开(图2)，且在容器断开时关闭(图3)。
当容器与容器支座连接时，钢盘接合弹簧阀以打开气体入口，且气体通过钢盘中的超过尺寸的孔进入容器用于溶液出口。流入管中的气体由图2中的绿色虚线箭头示出。O形环和平橡胶密封件可用于防止气体泄漏，见图2中的红色和蓝色虚线圆。手指上紧的1/16英寸连接器(GE Healthcare)可用于气体入口和氨基酸出口来防止气体泄漏。
当容器并未与容器支座紧密连接时，钢盘将通过重力和弹簧阀内的内部弹簧力下落。弹簧阀将通过其内部O形环密封，图3。图1-图4中所示的弹簧阀为常用于汽车轮胎的示例性Schrader阀。
可选地，两个圆柱形导销附接在钢盘上，这防止其旋转，否则这将引起用于氨基酸出口毛细管的超过尺寸的孔位置不当(图4)。导销可设有其自身的螺旋弹簧，以因而支撑弹簧阀的内部弹簧(即，确保阀盘的适当返回)。
在容器就位时，图1-图4中所述的自动气体控制系统通过减少气体消耗和确保气流来提供附加价值。利用正确尺寸的连接，任何容器都可结合容器支座使用。优选容器为Falcon 50ml管。
结合多肽合成器使用的容器支座面板
大部分多肽由许多不同的氨基酸组成。因此，肽合成器可能需要能够在单次多肽合成运行中接收20种或更多种氨基酸。因此，对于各个合成运行可能需要20个或更多容器支座。替代单个容器支座，因此期望使用支座面板，以较好地组织氨基酸和其它溶液，且最大限度减少合成过程的人为干预。
因此，容器支座面板可包括两个或更多容器支座。在一个示例中，容器支座由用于标准50ml Falcon管的32个位置和10个手指上紧的1/16英寸连接(面板的任一侧上5个)组成，以用于将惰性气体(例如，N2)供应至外部较大的容器。用于Falcon管的32个位置独立地配备有气体控制阀，其在管连接时打开，且在管断开时关闭。气体管可整体结合在容器面板壁中，作为壁的一部分，或在容器面板的相对侧上。气体管可在任何位置，只要其不干扰容器。
容器与对应的容器支座连接可通过将容器的盖上的螺纹与容器支座的对应螺纹部分螺纹连接来实现。因此，在一个实施例中，容器支座面板的一些容器支座可具有不同类型的螺纹以用于接纳不同的容器。在另一个实施例中，容器支座面板中的容器支座具有相同类型的螺纹，且具有用于不同容器的不同螺纹的适配器构件可用于将不同容器连接到容器支座面板中的支座。
容器支座面板可为具有支撑部件的独立单元(图5)，或置于柜轨道上(图6)。
连接到独立容器支座或容器支座面板的气体入口的容器可使用惰性气体(诸如N2)以大约0.1到大约0.5bar加压。尽管50ml Falcon管对于容器支座面板是优选的，但达到200ml的容器可用于实验室规模的多肽合成器。为了最大限度减少重量和交叉污染的可能性，高度耐化学制品的塑料的单次使用的管可为优选的。
尽管已经示出和描述了本发明的特定实施例，但本领域的技术人员将清楚的是，可制作出变化和改型而不脱离本发明的教导内容。例如，本文已经列举了多肽合成，但本领域的技术人员将清楚的是，所述和所示的容器支座将在其它合成技术中具有广泛的适用性，诸如蛋白质或低聚核苷酸的合成。前述描述和附图中阐释的主题仅通过图示提供而不作为限制。在基于现有技术以其适合的观点查阅时，本发明的实际范围意在限定于以下权利要求中。

Claims (21)

1.一种容器支座(10;10')，包括主体(12)，所述主体(12)继而包括
(a)气体入口(16)；
(b)溶液出口(18)；
(c)气体控制阀(20)，其允许气体从所述气体入口进入所述容器；以及
(d)用于密封使用中的所述容器的密封器件(22)，所述密封器件包括用于所述气体的输入和用于所述容器中的液体的流出的通路(24)；
其中，当所述容器通过所述密封器件密封地连接到所述容器支座时，所述气体控制阀自动地开启，且当所述容器与所述容器支座断开时，所述气体控制阀自动地关闭，且
其中，所述主体包括内螺纹孔口(14)，且其中所述密封器件包括螺纹部分和板，其中当所述容器通过其带螺纹的上缘与所述螺纹部分连接时，所述板开启所述气体控制阀，且
所述容器支座(10;10')还包括可与所述板一起操作以防止所述板旋转的一个或多个导销(30)。
2.根据权利要求1所述的容器支座，其特征在于，所述气体控制阀为可借助于板(27)操作的弹簧阀，所述板(27)继而由将所述容器密封地连接到所述容器支座的动作移位。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的容器支座，其特征在于，所述板包括用于使所述容器和所述入口流体地互连的通路(24)，且所述出口包括用于延伸到所述容器中的流出管(19)，所述通路容纳所述管。
4.根据权利要求1所述的容器支座，其特征在于，所述容器支座还包括所述板下方的平密封件，以及所述板与所述主体(12)的内表面之间的O形环。
5.根据权利要求1所述的容器支座，其特征在于，所述容器支座还包括用于将所述导销推入就位的引导弹簧。
6.根据权利要求1所述的容器支座，其特征在于，所述容器中的至少一些为50ml的管。
7.根据权利要求1所述的容器支座，其特征在于，当所述气体控制阀在开启位置时，所述容器可利用惰性气体加压，且所述容器中的溶液与其外部环境隔离。
8.根据权利要求7所述的容器支座，其特征在于，所述惰性气体为无湿气的。
9.根据权利要求7所述的容器支座，其特征在于，所述惰性气体为氮。
10.根据权利要求1所述的容器支座，其特征在于，所述容器支座用于将氨基酸溶液(L)供应至合成器。
11.根据权利要求1所述的容器支座，其特征在于，所述容器支座用于将氨基酸溶液(L)供应至肽或低聚核苷酸合成器。
12.一种容器支座面板(50)，包括前述权利要求中任一项所述的两个或更多容器支座(10')。
13.根据权利要求12所述的容器支座面板，其特征在于，所述容器支座面板包括至少两排容器支座，各排包括至少两个容器支座。
14.根据权利要求12所述的容器支座面板，其特征在于，所述容器支座面板包括四排容器支座，各排包括8个容器支座。
15.根据权利要求12所述的容器支座面板，其特征在于，各个容器支座的气体入口连接至公共气源(16')。
16.根据权利要求12所述的容器支座面板，其特征在于，所述容器支座面板用于将氨基酸溶液供应至肽合成器。
17.根据权利要求12所述的容器支座面板，其特征在于，所述容器支座面板用于将所有氨基酸溶液供应至肽合成器。
18.一种用于合成多肽的方法，包括如下合成步骤的循环：
(a)对现有肽上的α氨保护基去保护；
(b)从氨基酸的供应对混合器中的下一氨基酸预活化；以及
(c)将活化的氨基酸耦合至现有肽；
其中至少一种氨基酸通过连接到权利要求1至权利要求11中任一项所述的容器支座或根据权利要求12至权利要求17中任一项所述的容器支座的容器供应。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述氨基酸或各种氨基酸通过连接到容器支座或容器支座面板的相应容器供应。
20.一种用于合成多肽的方法，包括以下合成步骤的循环：
(a)对现有肽上的α氨保护基去保护；
(b)从氨基酸的供应对混合器中的下一氨基酸预活化；以及
(c)将活化的氨基酸耦合至现有肽；
其中至少一种氨基酸通过连接到权利要求12所述的容器支座面板的容器支座的容器供应。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，各种氨基酸通过连接到所述容器支座面板的容器支座的容器供应。
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